אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים

יישום פשוט זה של מיקרוסקופיה תוך-חיונית של ורידי מזנטריה בעכברים יכול לשמש במודלים שונים של דלקת כדי לצפות באינטראקציות לויקוציטים-אנדותל וטסיות-לויקוציטים.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור אינטראקציות לויקוציטים, תאי אנדותל וטסיות דם במהלך דלקת in vivo. זה מושג על ידי טיפול מקדים תחילה, עכבר עם החומרים המעניינים ותיוג תאי הדם בלולאת אילאום, ולאחר מכן כלי הדם המזנטריים הנלווים מוחצנים והאינטראקציות של תאי STO המתרחשות בתוך וריד מזנטרי נבחר מצולמות על ידי מיקרוסקופיה תוך-חיונית. בסופו של דבר, ניתן לנתח את האינטראקציות בין הלויקוציטים וטסיות הדם עם האנדותל או זה עם זה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הדלקת, כגון אילו סוגים של אינטראקציות לויקוציטים, אנדותל או טסיות דם מתרחשות in vivo במהלך מודלים שונים של דלקת או לאחר טיפולים מקדימים שונים מעניינים. ארבע שעות לפני ההדמיה התוך-חיונית יש להזריק 20 מיליגרם לק"ג LPS IP לעכבר זכר בן 16 עד 20 גרם בן ארבעה עד שישה שבועות כדי לגרום לתגובה דלקתית חיידקית מדומה. יש לחמם תמיסת מלח של 0.9% באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס להרטבת תא הפלסטיק ורקמת המזנטריה גם בשלב זה.

לאחר מכן, אשר את עומק ההרדמה המתאים על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן בעכבר שטופל ב-LPS, ולאחר מכן מרח משחה על גודל החיה, חבט את הבטן במכונת גילוח, והסר כל שיער רופף עם גזה ספוגה באתנול 70%. לאחר מכן השתמש במלקחיים ומספריים מעוקלים קטנים כדי לפתוח את הבטן, לזהות את כלי הדם האפיגסטריים ולפתוח את הצפק באזור האלבה הליניארית כדי להגן על הכלים. מרחו כמה טיפות של מי מלח חמים מראש לתוך חלל הבטן כדי לשמור על לחות הרקמה, ולאחר מכן הזרקה רטרואורביטלית של 50 מיקרוליטר של מוט Domine six G כדי לסמן את תאי הדם במחזור הדם.

לאחר מכן הניחו את העכבר בצלחת פטרי של 10 סנטימטרים, הוצאו לולאה של איליום ותנו את מי המלח החמים כל דקה שנייה כדי לשמור על לחות הרקמה. כדי להמחיש את התגובה הדלקתית על ידי מיקרוסקופיה תוך-חיונית, הנח את העכבר מתחת למיקרוסקופ והביא וריד מזנטרי בקוטר של 200 עד 300 מיקרומטר וכמה שפחות שומן מסביב גלוי לשדה הראייה. שימוש בתוכנת המיקרוסקופ המתאימה.

רשום את אינטראקציות האנדותל של תאי הדם למשך דקה אחת בארבעה ורידים שונים לכל עכבר. לאחר מכן לנתח את תגובות התא לתא כדי לאשר את היציבות ולהיכנס לתנאי זרימת דם בנפרד. כדי לכמת את מספר הלויקוציטים המתגלגלים, צייר קו אנכי דרך הווריד וספור ידנית את כל הלויקוציטים החוצים את הקו הזה בדקה אחת.

כדי לקבוע את מהירות הגלגול, צייר שני קווים אנכיים דרך הווריד במרחק של 50 מיקרומטר זה מזה, ומדוד את הזמן שלוקח ללויקוציט בודד לחצות בין הקווים תוך כדי גלגול יציב על האנדותל. כדי למדוד את הידבקות הלויקוציטים, צייר ריבוע של 200 על 200 מיקרומטר בווריד. לאחר מכן ספרו ידנית את הלויקוציטים הנצמדים היטב המציגים, ללא תנועה נראית לעין בתוך הריבוע למשך 30 שניות.

לבסוף, כדי לכמת את אינטראקציות הלויקוציטים של טסיות הדם, ספרו ידנית את מספר הטסיות הקשורות ללויקוציט אחד. למרות שיש מידה מסוימת של הפעלה בבעלי חיים לא מטופלים עקב ההליך עצמו, כמעט ואין גלגול איטי או הידבקות יציבה של לויקוציטים לא מטופלים. ואכן, מספרים גבוהים יותר של לויקוציטים מתגלגלים ונצמדים נצפים עם ירידה במהירות הגלגול של תאי הדם במחזור בעכברים מאותגרים LPS.

בניסוי זה, מיקרוסקופיה תוך-חיונית בוצעה ללא אתגר LPS נוסף מיד לאחר טיפול תוך-צפקי חריף עם פלואוקסטין. שימו לב, המספרים הגבוהים יותר של לויקוציטים נצמדים היטב ומהירויות הגלגול הנמוכות יותר בבעלי חיים שטופלו בפלואוקסטין מצביעים על השפעה של הטיפול החריף בפלואוקסטין על אינטראקציות אנדותל לויקוציטים. יתר על כן, כפי שנצפה בתמונה מייצגת זו של אינטראקציות לויקוציטים של טסיות דם עם וריד מזנטרי במהלך דלקת הצפק הנגרמת על ידי LPS, ניתן לראות עוצמה של הטסיות סביב הלויקוציטים כמו גם את האינטראקציות של קומפלקסים אלה עם דופן הכלי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע מיקרוסקופיה פנימית כדי לחקור אינטראקציות של לויקוציטים אנדותל וטסיות.