Name: אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: למד מיקרוסקופיה אינטראוויטלית לחקירת אינטראקציות לויקוציט-אנדותל וטסיות דם-לויקוציט בעכברים. שיטה זו מאפשרת צפייה בזמן אמת בתהליכי דלקת ומספקת מידע על דינמיקת תאים בחיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לחוק הגרמני הגנה על בעלי חיים (TierSchG). העכברים שוכנו ויטופלו בהתאם לפרקטיקת חיה טובה כפי שהוגדר בFELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) וגוף רווחת בעלי החיים הלאומי GV-סולאס (www.gv-solas.de/index.html). ועדת הרווחה של בעלי החיים באוניברסיטה פרייבורג, כמו גם את הרשויות המקומיות (Regierungspräsidium פרייבורג) אישרו את כל הניסויים בבעלי החיים. 1. טיפול בבעלי חיים, הכנה ואינדוקציה של דלקת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 4 - עכברי זכרים ישנים 6 שבוע עם טווח משקל של 16 - 20 גרם. הערה: אם העכברים מבוגרים או כבדים יותר הם מציגים שומן עודף סביב הספינה, המגביל את התצפית המיקרוסקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל הכלים ושולחן מיקרוסקופ לפני הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 20 מ&quot;ג / קילוגרם LPS (lipopolysaccharide) intraperitoneally 4 שעות לפני במיקרוסקופ לעכבר החי לגרום inflamm חיידקיםני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewarm תמיסת מלח 0.9% בwaterbath על 37 מעלות צלזיוס לללחלח את תא הפלסטיק והרקמה לפדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם זריקת intraperitoneal של קטמין (100 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (5 מ&quot;ג / קילוגרם) ממש לפני הליך מיקרוסקופ. ניתן להשתמש בהרדמה אלטרנטיבית, למשל, 2% שאיפת isoflurane. לאשר הרדמה תקינה על ידי האובדן של תגובה לגירוי רפלקס (קמצוץ הבוהן או זנב עם לחץ חזק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְהַשִׁיר שֵׂעַר הבטן באמצעות מכונת גילוח והסרת שיער רופף עם הגזה רוויה עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחה וטרינר בעיניים של העכבר כדי למנוע יובש, ואילו בהרדמה. </li></ol> 2. ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הבטן באמצעות אתנול 70%. שיטה זו אינה שיטה סטרילית ויכולה להיות קטלני בסוף הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע laparotomy חציון: פתח את עור הבטן באמצעות מלקחיים קטנים, מעוגלים ומספריים קטנים. זהה את עליתכלי gastrical ולפתוח את הצפק באזור של alba Linea, כדי להגן על כלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל כמה טיפות של תמיסת מלח prewarmed לתוך חלל הבטן כדי לשמור על הרקמה לחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדוריות דם לבנות וטסיות דם תווית fluorescently ידי הזרקת rhodamine 50 μl 6G (1 מ&quot;ג / מיליליטר) רטרו-orbitally כפי שתואר לפני 9,10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Exteriorize לולאה של מקום זה ileumand בpetridish בקוטר של 10 סנטימטר ולוודא כדי לשמור על הרקמה לחה על ידי יישום 37 ° C prewarmed תמיסת מלח (0.9%) מכל רגע אחר. </li></ol> 3. מיקרוסקופית Intravital <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר מתחת למיקרוסקופ ולהביא את הווריד לפדר בקוטר של 200-300 מיקרומטר במרכז התצוגה. בחר כלי ללא שומן נראית לעין סביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תיגעו בכולים לפדר ובכך להימנע מגירוי האנדותל. ידית מעי הלולאה בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו אינטראקציות תא-אנדותל דםעם מיקרוסקופ הפוך או זקוף ומצלמה באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. שיא דם אינטראקציות תא-אנדותל דקות 1 ב 4 ורידים שונים לכל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם לאחר השלמת ניסויי הדמיה. </li></ol> 4. ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את הניתוח במצב לא מקוון ועיוור לכל הפרמטרים. לבצע ניתוח באמצעות כל תוכנה מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את זרימת דם תנאים יציבים וinterindividually דומים בקולנוע-קליפים ברזולוציה גבוהה בזמן (במסגרת שיעור מקסימלי) התמקדו בתא זרימת דם intraluminal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את מספר כדוריות דם לבנות מתגלגלים. לכך למתוח קו אנכי דרך הווריד ולספור את כל לויקוציטים חציית הקו הזה בדקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע מהירות מתגלגלת על ידי מדידת זמן יקוציט אחת צריך לעבור מרחק של 50 מיקרומטר תוך גלגול ביציבות על האנדותל. כדי לעשות זאת, לצייר שני קווים אנכיים במרחק של לא 50 מיקרומטרhrough הווריד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את זמן יקוציט נציג צריך לקבל מקו אחד לother.Calculate המהירות של כדוריות דם לבנות על ידי חלוקת 50 מיקרומטר באמצעות הזמן הדרוש (מיקרומטר / s). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד הידבקות לויקוציטים בשדה של 0.04 מ&quot;מ 2. כדי לעשות זאת, לצייר ריבוע עם אורך הצד של 200 מיקרומטר לתוך הווריד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת כדוריות דם לבנות החברה חסיד, שהוגדרו כלא תנועה גלויה למשך 30 שניות, תוך כיכר זו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר טסיות הדם קשור לויקוציטים אחד לכמת אינטראקציות טסיות-יקוציט. </li></ol>

<ol><li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).</li>
<li>Atherton, A., Born, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+investigations+of+the+adhesiveness+of+circulating+polymorphonuclear+leucocytes+to+blood+vessel+walls%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls.</a> The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).</li>
<li>Duerschmied, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+stimulates+platelet+receptor+shedding+by+tumor+necrosis+factor-alpha-converting+enzyme+%28ADAM17%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+thrombosis+and+haemostasis+%3A+JTH%22%5BJournal%5D)">Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17).</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).</li>
<li>Chauhan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAMTS13%3A+a+new+link+between+thrombosis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+endoscopy%22%5BJournal%5D)">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).</li>
<li>Duerschmied, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+serotonin+promotes+the+recruitment+of+neutrophils+to+sites+of+acute+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice.</a> Blood. 121, 1008-1015 (2013).</li>
<li>Herr, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+fluoxetine+treatment+induces+slow+rolling+of+leukocytes+on+endothelium+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice.</a> PloS one. 9, e88316(2014).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab animal. 40, 155-160 (2011).</li>
<li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+routes+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+functions+of+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">Immune functions of platelets.</a> Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).</li>
<li>Wagner, D. D., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vessel+wall+and+its+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The vessel wall and its interactions.</a> Blood. 111, 5271-5281 (2008).</li>
<li>Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+activation+and+interaction+with+leucocytes+in+patients+with+sepsis+or+multiple+organ+failure%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure.</a> European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).</li>
<li>Sarma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+platelet+binding+to+circulating+monocytes+in+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes.</a> Circulation. 105, 2166-2171 (2002).</li>
<li>Sumagin, R., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+activation+of+arterioles+and+venules+alters+distribution+and+levels+of+ICAM-1+and+affects+leukocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

במסמך זה אנו מתארים את ההכנה וביצועים של מיקרוסקופיה intravital של ורידים לפדר של עכברי in vivo. שיטה זו נותנת לנו את ההזדמנות כדי לבחון אינטראקציות יקוציט-האנדותל וטסיות דם-אנדותל 11 ישירות באורגניזם החי. כתגובה מוקדמת לדלקת האנדותל מקבל הופעל ואינטראקציה עם כדוריות דם לבנות וטסיות דם וכתוצאה מכך מתגלגלים, הדבקה והגלגול 12. אבל לויקוציטים גם אינטראקציה עם טסיות דם ויוצרים מה שנקרא,...

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר טכניקה פשוטה של ​​מיקרוסקופיה intravital של ורידים לפדר בחיים עכברים לתצפית ישירה של אינטראקציות יקוציט-האנדותל ויקוציט-טסיות בתנאים דלקתיים. מיקרוסקופיה Intravital פותחה כדי לחקור אינטראקציות יקוציט-האנדותל in vivo בתנאים דלקתיים 1,2, שאינו טריוויאלי אבל חשוב להבנת גיוס לויקוציטים דלקתי ותפקוד. השיטה שאנו מתארים בפרוטוקול זה פותחה על בסיס פרסומים שפורסמו בעבר. דומה להדמית התאגדות טסיות דם בפקיק גובר 3 ובמקביל למה שפורסם קודם לכן 4, וריד לפדר exteriorized נבחן על ידי מיקרוסקופ אור מועברת. ישנם דגמים שונים של מיקרוסקופיה התוך החיוני כגון שריר Cremaster של חולדות 5 או כבד של עכבר וחולדות 6. מיקרוסקופיה Intravital של וריד לפדר פותחה ויושמה במחקרים קודמים על ידי מספר קבוצות. השתמשנו בטכניקה זו כדי לצפות בהבדלים בגיוס לויקוציטים בין עכברים הפראיים סוג וhydroxylase1 tryptophane (Tph1) - / - עכברים, שהם לקויים של סרוטונין שאינו עצבי והשווה את הממצאים לעכברי טסיות הדם שסרוטונין היה מדולדל פרמקולוגית על ידי לטווח ארוך פלואוקסטין מעכב יישום ספיגה החוזרת של סרוטונין 7. יש לנו גם בחנו אינטראקציות יקוציט-האנדותל לאחר טיפול פלואוקסטין החריף 8. בפרוטוקול זה אנו מתמקדים במיקרוסקופיה intravital של ורידים לפדר, כי מודל זה יכול להתבצע במהירות, ומאפשר מדידות תקפות של אינטראקציות יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט. זה הרבה יותר מאתגר ובמיקרוסקופיה intravital של איברים אחרים, כגון עצמות, כבד, עור, או שרירים Cremaster זמן רב. המצבl המתואר כאן הוא אידיאלי להערכה לשחזור של אינטראקציה תאי תאים דלקתית לאחר challengeing אותו עם גירוי דלקתי, כגון זריקת intraperitoneal של lipopolysaccharide.

<table><tbody><tr><td>רודמין 6G</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; 989-38-8</td><td></td></tr><tr><td>ליפופוליסכרידים מ- Escherichia coli 055:B5</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L2637&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

אינטראקציות מיקרוסקופית intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בmesenterial ורידים בעכברים

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

מיקרוסקופיה Intravital היא שיטה שיכול לשמש כדי לחקור תהליכים שונים באזורים שונים וכלי בבעלי חיים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים מיקרוסקופיה intravital של ורידים לפדר. זה יכול להתבצע בפרק זמן קצר עם תוצאות לשחזור מראים אינטראקציות יקוציט-האנדותל in vivo. אנו מתארים הגדרה דלקתית לאחר אתגר LPS של האנדותל. אבל במודל זה ניתן להחיל סוגים רבים ושונים של מצבים דלקתיים, כמו חיידקים, כימי או ביולוגי ולחקור את הממשל של תרופות וההשפעות הישירות שלהם על בעלי החיים החיים והשפעתה על גיוס לויקוציטים. פרוטוקול זה יושם בהצלחה למספר הטיפולים השונים של עכברים והשפעתם על תגובה דלקתית בכלי. במסמך זה, אנו מתארים את ההדמיה של לויקוציטים וטסיות דם על ידי fluorescently תיוג אלה עם rhodamine 6G. בנוסף, כל הדמיה ספציפית יכולה להיות PErformed באמצעות מולקולות שכותרתו fluorescently ממוקדות.

סקירה של הגדרת הניסוי המתוארת בפרוטוקול זה מוצגת באיור 1. זה מראה עכבר עם מעי-לולאת exteriorized וכליו, שניתן לראות במיקרוסקופ intravital. איור 2 מראה מידה מסוימת של הפעלה בבעלי חיים שלא טופלו בשל ההליך עצמו. אבל אין כמעט מתגלגל איטי או הידבקות חברה של לויקוציטים בהשוואה לעכברים שטופלו-LPS. איור 2 מציג גם את התוצאות השונות של מיקרוסקופיה intravital בעכברי wildtype או שטופל בפלואוקסטין במשך 3 שבועות במי השתייה או עכברים שלא טופלו. ...

יישום פשוט זה של מיקרוסקופיה תוך-חיונית של ורידי מזנטריה בעכברים יכול לשמש במודלים שונים של דלקת כדי לצפות באינטראקציות לויקוציטים-אנדותל וטסיות-לויקוציטים.

אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לחקור אינטראקציות בין לוקוציטים, תאים אנדותליאליים וטבחים במהלך דלקת in vivo. מטרה זו מושגת תחילה על ידי טיפול מקדים של עכבר בחומרים הנחקרים וסימון תאי הדם; לאחר מכן, לולאת אילאום וכלי הדם המזנטריים הנלווים מוצאים אל מחוץ לגוף, והאינטראקציות התאיות המתרחשות בתוך וריד מזנטרי נבחר מצולמות באמצעות מיקרוסקופיה אינטרה-וייטלית. בסופו של דבר, ניתן לנתח את האינטראקציות בין הלוקוציטים והטבחים לאנדותל או זה עם זה.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מרכזיות בתחום הדלקת, כגון אילו סוגי אינטראקציות בין לוקוציטים לאנדותל, או בין טבקיות ללוקוציטים, מתרחשות in vivo במודלים שונים של דלקת או לאחר טיפולים מקדימים שונים הנמצאים במוקד המחקר. ארבע שעות לפני ההדמיה התוך-חיה, מזריקים 20 mg/kg של LPS IP לעכבר זכר בן 4 עד 6 שבועות ושוקלו 16 עד 20 g כדי להשרות תגובה דלקתית חיידקית מדמה. יש לחמם מראש תמיסת סליין 0.9% בבן-מרחץ בטמפרטורה של 37 °C לצורך הלחת התא הפלסטי ורקמת הקרום הצמיגי בעת זו.לאחר מכן, ודאו את עומק ההרדמה המתאים על ידי בדיקת היעדר תגובה ללחיצה על בהונות הרגליים בעכבר שטופל ב-LPS, ולאחר מכן מרחו משחה על גודל גוף החיה, גלחו את הבטן בעזרת מכשיר גילוח והסירו שיער רופף באמצעות גזה ספוגה ב-70% ethanol. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה קשתה קטנה ובמספריים כדי לפתוח את הבטן, זהו את כלי הדם האפיגסטריים ופתחו את הפריטוניאום באזור ה-linear alba כדי להגן על כלי הדם. טפטפו מספר טיפות של סליין שחומם מראש אל תוך חלל הבטן כדי לשמור על לחות הרקמה, ולאחר מכן בצעו הזרקה רטרו-אורביטלית של 50 microliters של rod Domine six G כדי לסמן את תאי הדם במחזור הדם.לאחר מכן, הניחו את העכבר בתוך צלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטרים, הוציאו לחוץ לולאה של ה-illium ומסרו את הסלין שחומם מראש מדי דקה כדי לשמור על הרקמה לחה. כדי להדגים את התגובה הדלקתית באמצעות מיקרוסקופיה אינטרא-ויטלית, הניחו את העכבר מתחת למיקרוסקופ והביאו לשדה הראייה וריד מזנטרי בעל קוטר של 200 עד 300 מיקרומטרים, עם כמות מינימלית של שומן מקיף גלוי. השתמשו בתוכנת המיקרוסקופ המתאימה.הקליטו את האינטראקציות בין תאי דם לאנדותל למשך דקה אחת בארבע ורידים שונים בכל עכבר. לאחר מכן, נתחו את התגובות בין התאים כדי לאשר את היציבות ואת תנאי זרימת הדם האישיים. כדי לכמת את מספר הלוקוציטים המתגלגלים, שרטטו קו אנכי לאורך הווריד וספרו ידנית את כל הלוקוציטים החוצים את הקו הזה במשך דקה אחת.כדי לקבוע את מהירות הגלגול, שרטטו שני קווים אנכיים דרך הווריד במרחק של 50 micrometers זה מזה, ומדדו את הזמן שלוקח ללוקוציט בודד לחצות את המרחב שבין הקווים בעודו מתגלגל באופן יציב על האנדותל. כדי למדוד את היצמדות הלוקוציטים, שרטטו ריבוע של 200 על 200 micrometer בווריד. לאחר מכן, ספרו ידנית את הלוקוציטים ההצמדים בחוזקה שאינם מראים תנועה נראית לעין בתוך הריבוע במשך 30 שניות.לבסוף, כדי לכמת את האינטראקציות בין טבקיות ללוקוציטים, ספרו ידנית את מספר הטבקיות הקשורות ללוקוציט אחד. למרות שקיימה רמה מסוימת של אקטיבציה בבעלי חיים שלא טופלו עקב הפרוצדורה עצמה, כמעט ולא נצפתה גלגול איטי או היצמדות חזקה של לוקוציטים שלא טופלו. ואכן, מספרים גבוהים יותר של לוקוציטים מתגלגלים ונדבקים נצפים, יחד עם ירידה במהירות הגלגול של תאי הדם במחזור בעכברים שחשופו ל-LPS.בניסוי זה, בוצעו בדיקות מיקרוסקופיה תוך-חיה (intravital microscopy) ללא חשיפה נוספת ל-LPS מיד לאחר טיפול תוך-peritoneal אקוטי ב-fluoxetine. שימו לב למספר הגבוה יותר של לוקוציטים הדבקים בחוזקה ולמהירות הגלגול (rolling velocity) הנמוכה יותר בבעלי החיים שטופלו ב-fluoxetine, המעידות על השפעה של הטיפול האקוטי ב-fluoxetine על האינטראקציות בין הלוקוציטים לאנדותל. יתרה מכך, כפי שנראה בתמונה מייצגת זו של אינטראקציות בין טבחים ללוקוציטים בווריד מזנטרי (mesenteric vein) במהלך פריטוניטיס המושרה על ידי LPS, ניתן להבחין בהצמדה של טבחים סביב הלוקוציטים וכן באינטראקציות של קומפלקסים אלו עם דופן כלי הדם.לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן ביצוע מיקרוסקופיה כדי לחקור אינטראקציות בין לוקוציטים לתאי אנדותל ובין פלטלטית ללוקוציטים.

intravital-microscopy-leukocyte-endothelial-platelet-leukocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מיקרוסקופיה Intravital לעקוב אחרי האירועים hemodynamic ו דלקתיות ומרחב ב microcirculation pial.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

בסרטון זה, אנו מדגימים הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות תאי דם-אנדותל בוורידים המזנטריאליים של מודל עכבר המוזרק תוך צפקית עם lipopolysaccharide.

מיקרוסקופ תוך חיוני לניתוח אינטראקציות תאי דם-אנדותל במודל עכבר דלקתי

כאן אנו מדווחים טכניקה ניסויית של מיקרוסקופיה intravital פלואורסצנטי לדמיין אינטראקציות heterotypic טסיות דם נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים. טכנולוגיה מיקרוסקופית זה תהיה יקרה כדי לחקור את המנגנון המולקולרי של מחלת כלי דם ולבדוק סוכנים תרופתיים בתנאי pathophysiological.

הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים

אנו מפרטים פרוטוקול לניטור התנהגותם של נויטרופילים ומונוציטים בוורידים מזנטריים במצב יציב ובתנאים דלקתיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית תוך-חיונית בעכברים מורדמים.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

ומונוציטים הם מתווכים חשובים של arteriogenesis בהקשר של מחלת עורקים היקפית. פרוטוקול זה באמצעות מטריקס קרום המרתף דמוי מיקרוסקופ intravital, חוקר אנגיוגנזה ביות ו הקשורות הגידול מונוציט לאחר ההזרקה מונוציט במודל מאתר מצדו בעורק הירך.

מיקרוסקופ intravital של יונת מונוציט, הקשורות הגידול אנגיוגנזה במודל מאתר של מחלת עורקים היקפית

כאן, אנו מראים כיצד לבצע מיקרוסקופ לאחר הנימי של השריר הראשי של העכבר. בדרך כלל מיושם מודלים שונים של דלקת אלח דם, במיוחד אלה המושרה על ידי נוגדנים ו ציטוקינים, אנו להדגיש את הרלוונטיות שלה במחקר של מוסקולופאאס מעורבים חדירה מוגזמת שרירי לוקיציט.

הסתננות לאוציט של שריר Cremaster בעכברים המוערך על ידי מיקרוסקופ אינטרטל

גיוס לויקוציטים וטסיות דם מהווה מרכיב חיוני הדרוש לצמיחה יעילה של עורקי בטחונות במהלך העורקים. מיקרוסקופ מולטיפוטון הוא כלי יעיל למעקב אחר דינמיקה של תאים עם רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה in vivo ופחות רעילות לאור לחקר גיוס לויקוציטים ואקסטרווסציה במהלך העורקים.

הדמיה תוך-חיונית מולטיפוטון לניטור גיוס לויקוציטים במהלך דלקת עורקים במודל מורין גפיים אחוריות

פרוטוקול זה מציג שיטה לגרימת פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה מזנטרית ולהדמיית מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) בוורידים מזנטריים באמצעות מיקרוסקופ תוך-חיוני. זרימת הדם בעורק המזנטרי העליון הוגבלה למשך שעה אחת, ואחריה רפרפוזיה, המאפשרת כימות ישיר של הידבקות לויקוציטים ו- NETosis.

הדמיה של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים בוורידים מזנטריים לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה מזנטרית באמצעות מיקרוסקופ תוך חיוני

הטכניקה לביצוע מיקרוסקופיה intravital של הצומת לימפה מפשעתי (LN) הוא התווה. טכניקה כזו מאפשרת בזמן...

מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי

אנו מתארים פרוטוקול של מיקרוסקופיה brightfield intravital למדידת דינמי נויטרופילים-אנדותל האינטראקציות התא במהלך לגיוס נויטרופילים בתגובה מקור chemoattractant נויטרופילים in vivo. זחילה נויטרופילים intraluminal, הגירה chemotaxis transendothelial ו ברקמת השריר cremaster העכבר הם דמיינו עם הצילום בזמן שחלף וידאו מעקב עם ImageJ.

מעקב זחילה Intraluminal נויטרופילים, הגירה Chemotaxis Transendothelial ועל רקמות על ידי מיקרוסקופית וידאו Intravital

למד מיקרוסקופיה אינטראוויטלית לחקירת אינטראקציות לויקוציט-אנדותל וטסיות דם-לויקוציט בעכברים. שיטה זו מאפשרת צפייה בזמן אמת בתהליכי דלקת ומספקת מידע על דינמיקת תאים בחיה.

אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים

גלה סרטונים נוספים