קולגן שכבת הפקדת-ידי שכבה במכשירי microfluidic לMicrotissue ייצוב

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפקיד מכלול קולגן דק על תאים במכשיר מיקרופלואידי. זה מושג על ידי שינוי קולגן טבעי מחומצן באמצעות מתילציה ליצירת מולקולות קולגן טעונות חיובית. השלב השני הוא שינוי קולגן טבעי מחומצן ליצירת מולקולות קולגן נטו בעלות מטען שלילי.

לאחר מכן, מכינים את המכשירים המיקרופלואידיים ונזרעים עם הפטוציטים, אותם מותר להיצמד ולהתפשט בן לילה. השלב האחרון הוא להפקיד את מכלול הקולגן על-ידי חשיפת התאים לסירוגין לתמיסות קולגן בעלות מטען חיובי ושלילי, כדי ליצור 10 שכבות דו-שכבתיות של קולגן על גבי שכבת התא. בסופו של דבר, מיקרוסקופ פאזה ואימונופלואורסצנטי ומבחני אלבומין ואוריאה משמשים כדי להראות את ההתפתחות והתחזוקה של קוטביות התא ותפקוד ההפרשה.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם בכך שהיא מאפשרת תרבית הפטוציטים במכשירי מיקרו תוך שימוש בטכניקות דומות לאלו המיושמות בתרביות צלחות במשך למעלה מ-20 שנה. זה לא דורש עיצובים מורכבים של מכשירים והמטריצה המופקדת דקה מאוד בסדר גודל של 100 ננומטר. לראשונה עלה לנו הרעיון לשיטה זו תוך כדי סיעור מוחות כיצד לתרגם טכניקות תרבית תאי Capy מכיתה מצלחות למכשירים מיקרופלואידיים.

שיטות כריך הקולגן פועלות במערכות מיקרוסקופיות פתוחות, אך ההידרוג'לים המשמשים אינם תואמים למכשירי מיקרו סגורים עם גבהי תעלה מוגבלים. מדללים 100 מיליגרם של תמיסת קולגן מחומצת מקורית לריכוז של 0.5 מיליגרם למיליליטר עם קרח, מים קרים וסטריליים, ומניחים את התמיסה על קרח כדי למנוע אלציה. לאחר מכן, התאימו את ה-pH של תמיסת הקולגן בין תשע ל-10 עם כמה טיפות של נתרן הידרוקסיד רגיל אחד וערבבו בעדינות את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

כאשר הקולגן משקע, התמיסה תתחיל להיות עכורה, תסובב את תמיסת הקולגן המשקעת ש 3000 פעמים G למשך 25 דקות. לאחר מכן, משקעים דמויי ג'ל שקופים צריכים להיות גלויים בתחתית הצינורות, לשאוב את החטיף, ולאחר מכן להשעות מחדש את הקולגן המשקע ב-200 מיליליטר מתנול עם 0.1 חומצה הידרוכלורית רגילה מאפשרים לתגובת המתילציה להתרחש תוך ערבוב בטמפרטורת החדר במשך ארבעה ימים לאחר צנטריפוגת המתילציה, התמיסה ב-3000 פעמים G למשך 25 דקות כדי לגלול את הקולגן המתיליציה, לאחר מכן שאפו והשליכו את המתנול המחומצן. לאחר מכן, ממיסים את הקולגן המתילי ב-25 מיליליטר של PBS סטרילי ומסננים את התמיסה דרך מסננת תאים של 60 מיקרון.

התאם את ה-pH של התמיסה ל-7.3 עד 7.4 באמצעות מרווחים של 20 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד רגיל אחד. העריכו את ריכוז תמיסת הקולגן באמצעות ערכת ELIZA מסחרית של קולגן חולדות או ערכת בדיקת הידרוקסיפרולין. לאחר מכן יש לדלל את התמיסה לשלושה מיליגרם למיליליטר בעזרת PBS סטרילי.

עקר את תמיסת הקולגן המתילי על ידי העברתו לבקבוק זכוכית עם מכסה בורג. מניחים בזהירות שלושה מיליליטר כלורופורם בתחתית הבקבוק ומניחים לבקבוק להתייצב למשך הלילה על ארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר.

באופן אספטי, הסר את שכבת הקולגן העליונה עם מתילציה. אחסן את הקולגן שעבר מתילציה בארבע מעלות צלזיוס והשתמש בו תוך חודש. יש לדלל עוד 100 מיליגרם של תמיסת קולגן מחומצת מקומית לריכוז של 0.5 מיליגרם למיליליטר עם קרח, מים קרים וסטריליים, ולהניח את התמיסה על קרח כדי למנוע דאטציה כפי שהוצג קודם לכן, להתאים את ה-pH של תמיסת הקולגן עם נתרן הידרוקסיד ולערבב את התמיסה בטמפרטורת החדר כדי לזרז את הקולגן.

לאחר מכן, ממיסים 40 מיליגרם של שישה אנהידריד ציני ב -10 מיליליטר אצטון. הוסיפו לאט את התערובת הזו במרווחים של 0.5 מיליליטר לתמיסת הקולגן תוך ערבוב וניטור רציף של ה-pH של התמיסה. שמור על ה-pH מעל 9.0 על ידי הוספת טיפה אחת או שתיים של נתרן הידרוקסיד רגיל אחד כאשר ה-pH מתקרב ל-9.0 תוך ערבוב מתמשך בטמפרטורת החדר למשך 120 דקות.

לאחר הוספת כל ששת התמיסות הציניות וההידרידיות, שימו לב שהתערובת מתבהרת כאשר הקולגן הסוקסינט מתמוסס, המשיכו לבדוק מעת לעת את ה-pH כדי לוודא שהוא נשאר מעל 9.0. כאשר כל הקולגן הסוקסינט התמוסס, התאם את ה-pH של התמיסה ל-4.0 באמצעות מרווחים של 20 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית רגילה אחת. התבונן בתמיסה, הפוך שוב לעכור כאשר הקולגן הסוקסינט משקע.

לאחר מכן צנטריפוגה את התמיסה ב -3000 פעמים G למשך 25 דקות. כדי לגלול את הקולגן הסוקסינט אסברי ולהיפטר מהסנאט המחומצן עם אנהידריד snic לא תגובתי, יש להמיס את הקולגן הסוקסינט עם פיפטינג חוזר ונשנה ב-25 מיליליטר של PBS סטרילי, מה שנותן ריכוז סופי של כשלושה מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן סנן את התמיסה דרך מסננת תאים של 60 מיקרון, ולאחר מכן התאם את ה-pH של התמיסה בין 7.3 ל-7.4.

באמצעות מרווחים של 20 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד רגיל אחד, העריכו את ריכוז התמיסה באמצעות ערכת ELIZA מסחרית של חולדות קולגן או ערכת בדיקת הידרוקסיפרולין. ואז לדלל את התמיסה לשלושה מיליגרם למיליליטר. שימוש ב-PBS סטרילי מעקר את תמיסת הקולגן הזו באותו אופן כמו תמיסת הקולגן המתילית.

התחל בייצור מכשיר מיקרופלואידי, בטכניקה סטנדרטית, בעל תאי תרבית תאים בגובה 100 מיקרון, רוחב של 0.4 עד 1.5 מילימטר ותעלות באורך של 1 עד 10 מילימטר לגידול תאים. השתמש במנקה פלזמה כדי לחמצן את משטחי המכשיר ובמגלשת זכוכית. לאחר מכן לחץ על השניים יחד ליצירת קשר.

לאחר עיקור המכשיר על ידי חשיפה לאור UV למשך 30 דקות לפחות. מלאו את החדר ב -15 מיקרוגרם למיליליטר, פיברונקטין ב- PBS סטרילי ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. לאחר מכן, ראה את המכשיר עם תאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

במכסה המנוע של תרבית רקמות זרימה למינרית, הכינו כמויות מספיקות של תמיסות קולגן מתילציה ואט עבור 10 יישומים של כל תמיסה לכל מכשיר, כמו גם כמה מיליליטרים קיצוניים של מדיה. שמור את הפתרונות על הקרח. לסירוגין שטיפה של המכשירים עם 20 מיקרוליטר של תמיסות קולגן מתילציה ולאחר מכן תמיסות קולגן.

המתנה של דקה בין כל בקשה. שטוף את המכשיר בסך הכל 10 פעמים לכל תמיסה. עבדו במהירות כדי למזער את משך הזמן שהתאים נמצאים ללא מדיה תוך כדי גידול שכבות הקולגן, ניתן לראות קולגן מצטבר לאט בכניסה וביציאה של המכשיר המיקרופלואידי.

אם ההתנגדות לזרימת נוזלים עולה, יש לשטוף את המכשיר פעם או פעמיים במדיה ולאחר מכן להמשיך בשכבות. לאחר מריחת כל השכבות יש לשטוף את המכשיר פעמיים במדיה טרייה ולהחזיר לחממה. מתילציה ואציה משנים את מאפייני המטען של מולקולות הקולגן.

Ation מסיר קבוצות טעונות חיובית ומחליף אותן בקבוצות טעונות שלילית, ומתילציה מסירה קבוצות טעונות שלילית, ויוצרת מולקולות טעונות חיובית נטו, מה שמאפשר שקיעה שכבה אחר שכבה של שתי גרסאות הקולגן על גבי משטחים טעונים כמו תאים. הפטוציטים ראשוניים שנזרעו על זכוכית מצופה פיברונקטין בתוך מכשיר מיקרופלואידי, יכולים להיות מצופים בשכבה זו שכבה אחר שכבה. הרכבת מטריצת קולגן, שקיעה של 10 שכבות דו-שכבתיות על התאים יוצרת עובי שכבת קולגן של כ-140 ננומטר הפטוציטים ללא קולגן עליון שכבה אחר שכבה.

מטריקס מאבדים את התכווצות הפנוטיפ המובחן שלהם ומתרוממים מעל פני השטח של מכשירים מיקרופלואידיים לאורך זמן. לעומת זאת, הפטוציטים המכוסים במכלול קולגן דק במיוחד שומרים על המורפולוגיה המובחנת שלהם, כדאיות של יותר מ-90% וקיטוב לאורך 14 יום. בנוסף למורפולוגיה וקיטוב של כדאיות התאים, טכניקת הקולגן שכבה אחר שכבה גם משחזרת ומייצבת את תפקודם של הפטוציטים ראשוניים כפי שמצוין כאן, לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע מתילציה וסוקסינט קולגן כדי ליצור תמיסות קולגן טעונות חיובית ושלילית נטו וכיצד להשתמש בהם בתצהיר שכבה אחר שכבה ליצירת מכלולי קולגן דקים על גבי תאים במכשירים מיקרופלואידיים.