התממשקות תרבויות 3D הנדסה עצבית למערכי מיקרו-אלקטרודה: חדשני במבחנה דגם ניסיוני

המטרה הכוללת של הליך זה היא להציג מודל חדשני של רשתות עצביות תלת מימדיות במבחנה יחד עם מערכי מיקרו אלקטרודות. זה מושג על ידי התניה ראשונה, החלק המרכזי של ה-MEA בתמיסה מעורבת של פולי דה ליזין ולמינין ואז ציפוי המיקרו-חרוזים בחלבוני הידבקות, למינין ופוליליזין. השלב השני הוא הפצת ההשעיה של מיקרו-חרוזים מטופלים על צלחת מרובת בארות שם הם יתאספו בעצמם ויצרו שכבה אחידה.

השלב השלישי של ההליך הוא צלחת התאים על האזור הפעיל של ה-MEA בצפיפות של 2000 תאים למילימטר רבוע כדי ליצור רשתות עצביות דו-ממדיות. שש עד שמונה שעות לאחר הציפוי מועברים המתלים מלוחות הבארות הרב-בארות ל-MEA והמיקרו-חרוזים מורשים להרכיב את עצמם במבנה קומפקטי משושה. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת להמחשת הרשתות התלת-ממדיות, המושוות לרשתות העצביות הדו-ממדיות הקונבנציונליות הגדלות על פני MEA.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו תרביות תאים ממדיות BDI במבחנה, הוא שבמודל ממדי BDI, סומטה וחרוטי גדילה משוטחים, אנדון ועלייה אינם יכולים להתפשט לכל הכיוונים. בנוסף, פעילות התפרצות שולטת בדינמיקה האלקטרופיזיולוגית של רשתות ממדיות BDI בעוד שברשתות תלת מימדיות, גם פעילות כתמים אקראית מתקיימת במקביל. הרעיון של השיטה הזו עלה לנו לראשונה כשקראנו את מאמר המחקר של סופי פוטו שפורסם ב-Nature Method ב-2008, שבו היא השתמשה במיקרוביטים כפיגום לבניית רשתות תלת-ממדיות.

לאחר מכן התאמנו לי את השיטה הזו כדי לבצע את ההקלטות התלת-ממדיות הראשונות במבחנה. להכנת אלסטומר PDMS, מערבבים את חומר הריפוי ופולימר ביחס נפח של אחד עד תשע בצלחת פטרי. לאחר מכן יש לנער את התערובת ולהניח אותה בתא הוואקום למשך 10 דקות כדי למנוע בועות אוויר.

כדי לבנות את אילוץ ה-PDMS, הכנס את חומר ה-PDMS לתבנית הישנה יותר לאחר מכן, הכניס אותו לתנור למשך 30 דקות בחום של 120 מעלות צלזיוס. אילוץ ה-PDMS צריך להיות בצורת גליל בקוטר חיצוני ופנימי של 22.0 ו-3.0 מילימטרים בהתאמה, וגובה של 650 מיקרומטר ביום שלפני הציפוי. חבר את המסכה לאזור הפעיל של ה-MEA תחת מיקרוסקופ סטריאו, ולאחר מכן עקר את מסכת ה-PDMS בתנור ב-120 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, עקרו את המיקרו-חרוזי הזכוכית בבקבוקון חרוטי של 70% אתנול למשך שעתיים, מסובבים כל 30 דקות כדי לחשוף את כל המיקרו-חרוזים לאחר מכן. מוציאים את תמיסת האתנול מהבקבוקון ושוטפים את המיקרו-חרוזים פעמיים במים מעוקרים. לאחר מכן התנו את החלק המרכזי של אזור המזרח התיכון ואפריקה התחום על ידי מסכת PDMS ב -24 מיקרוליטר של תמיסה מעורבת של פוליליזין ולמינין ב -0.05 מיקרוגרם למיליליטר.

מצפים את המיקרו-חרוזים בחלבוני הידבקות, למינציה ופוליליזין ב -0.05 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, הניחו אותם בחממה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להשיג רשת עצבית יציבה וארוכת טווח. לאחר מכן, הפיצו את ההשעיה של המיקרו-חרוזים המטופלים על הצלחת מרובת הבארות בעזרת תוספת קרום שם הם יתאספו בעצמם ויצרו שכבה אחידה.

ואז מלאו כל באר של הממברנה ב 0.5 מיליליטר בינוני. הכניסו אותו לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עד שהנוירונים מוכנים לציפוי בשלב זה. לאחר הקרבת חולדה בהריון E 18, השיגו את עוברי החולדה, ואז הסירו את ההיפופוטם קמפי מכל עובר חולדה.

הניחו אותם בהנקס קרים כקרח. איזון תמיסת מלח ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, נתק את הרקמה ב-0.125% מתמיסת הנקס המכילה 0.05% מה-DNA למשך 18 עד 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט בעזרת פיפטה פיור. עצור את העיכול האנזימטי על ידי הוספת מדיום עם 10% FBS למשך חמש דקות. לאחר מכן הסר את המדיום עם FBS ושטוף פעם אחת עם מדיום הגידול, התוסף שלו 1% L-גלוטמין וגנטמיצין ב -10 מיקרוגרם למיליליטר.

לאחר מכן, הסר את המדיום. מלאו אותו שוב ב -500 מיקרוליטר צמיחה. בינוני. התוסף שלו 1% L-גלוטמין וגנטמיצין ב -10 מיקרוגרם למיליליטר.

נתק את כדור הרקמה באופן מכני עם פיפטה PEs צרה עד שנראה השעיה חלבית של תאים. לאחר מכן, יש לדלל נפח קטן של תרחיף תאים עם מדיום הגידול כדי לקבל נפח סופי של 2.0 מיליליטר. ספור את הריכוז הסלולרי שהתקבל עם תא הציטומטר ההמו.

לאחר מכן יש לדלל ריכוז זה ביחס של אחד לחמישה על מנת להשיג את ריכוז התאים הרצוי של 600 עד 700 תאים למיקרוליטר. צלחו את התאים בצפיפות של 2000 תאים למילימטר רבוע על האזור הפעיל של ה-MEA המוגדר על ידי אילוץ ה-PDMS כדי ליצור רשת עצבית דו-ממדית. לאחר מכן, הנח את מכשיר ה-MEA לתוך החממה עם אטמוספירת פחמן דו חמצני לחה של 5% ב-37 מעלות צלזיוס.

כדי להשלים את השלב המקדים לבניית תרבית תלת מימדית, יש להפיץ 160 מיקרוליטר של התרחיף בריכוז תאים של 600 עד 700 תאים למיקרוליטר על פני המיקרו-חרוזים חד-שכבתיים הממוקמים בתוך הלוחות מרובי הבארות. לאחר מכן הנח את הלוחות מרובי הבארות בחממה עם אטמוספירה של פחמן דו חמצני לח 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, שש עד שמונה שעות לאחר הציפוי העבירו 30 עד 40 מיקרוליטר של המתלה עם מיקרו-חרוזים ונוירונים לאזור ה-MEA התחום על ידי אילוץ ה-PDMS. לאחר כל העברה, המתינו כחצי דקה כדי לאפשר למיקרו-חרוזים להתאסף בעצמם במבנה משושה.

לאחר שכל השכבות מופקדות ומורכבות באופן ספונטני ב-300 מיקרוליטר של תווך בחלק העליון של השטח התחום על ידי אילוץ ה-PDMS. שים את המבנה התלת-ממדי המחובר ל-MEA בחממה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 48 שעות. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מצע גידול עם התוסף שלו לאחר שלושה שבועות במבחנה, המבנה התלת מימדי יציב גם ללא אילוץ ה-PDMS המוצג.

הנה תמונת DIC של שכבה אחת של חרוזים המחוברים לפני השטח של MEA. מיקום הנקודות השחורות מייצג את הפריסה המרחבית של האלקטרודות. צביעה אימונו-פלואורסצנטית עבור מפה שתיים, המשתקפת על ידי האות האדום, מציגה את התפלגות העצבים הדנדריטיים וה-ADA של הנוירונים סביב המיקרו-חרוזים המחוברים ישירות למישור האלקטרודה של ה-MEA.

תמונה זו מציגה את ההקרנה המקסימלית של רצף זאק של תרבית תלת מימדית המציגה רשת מחוברת מאוד שבה נוירונים מסומנים עבור N חדש המתבטא בנוירונים פוסט-מיטוטיים בוגרים. ולגבי גאבה, הנה הרישום האלקטרופיזיולוגי המייצג של רשתות ההיפוקמפוס בתצורה תלת מימדית. והנה הרישום האלקטרופיזיולוגי המייצג של רשתות ההיפוקמפוס בתצורה דו-ממדית.

לאחר שליטה, ניתן לבצע הליך זה תוך שבע שעות. עם זאת, ראוי לשים לב שמכיוון שלהליך יש מספר שלבים שבוצעו במהלך יום שונה, הערכת הזמן למימוש ההליך כולו היא אינדיקציה בלבד. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור תחילה להצמיד שכבה דו-ממדית של משתן נוירון לאלקטרודה של ה-mea, ולאחר מכן להעביר בזהירות רבה את ההשעיה של מיקרוביטים ונוירון מהלוח הרב-באר ל-mea על מנת לממש את המבנה התלת-ממדי לאחר פיתוחו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח החישוביים לחקור כיצד קישוריות רשת יכולה לעצב את דינמיקת הרשת המתהווה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבנות רשת עצבית תלת מימדית במבחנה יחד עם מערכי מיקרו אלקטרודות.