Name: התממשקות תרבויות 3D הנדסה עצבית למערכי מיקרו-אלקטרודה: חדשני במבחנה דגם ניסיוני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: למדו לבנות רשתות עצביות תלת-ממדיות במערכי מיקרו-אלקטרודה. השיטה משתמשת בחרוזי זכוכית מצופים ומיקרוסקופיה קונפוקלית לניטור פעילות חשמלית עצבית מתקדמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים ג&#39;ורג&#39;יו Carlini לתמיכה הטכנית בפיתוח מבנה הכליאה וdott. Ornella LoBrutto לתיקון היסודי של כתב היד. המחקר שיוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מתכנית מסגרת ה -7 של האיחוד האירופי (ICT-FET FP7 / 2,007-2,013, FET צעיר מגלי ערכה) תחת 284,772 BOW BRAIN הסכם מענק (www.brainbowproject.eu).

פרוטוקול הניסוי אושר על ידי הטיפול בבעלי חיים האירופי החקיקה (2010/63 / האיחוד האירופי), על ידי משרד בריאות האיטלקי בהתאם לDL 116/1992 ובהנחיות של אוניברסיטת גנואה (Prot. נ 13,130, מאי 2011). כל המאמצים שנעשו כדי להפחית את מספר בעלי החיים לפרויקט וכדי למזער את סבלם. 1. הכנת חומרים ותומכים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות העובש לבנות PDMS האילוץ (פולי-דימתיל-siloxane) באמצעות מכונת כרסום CNC (מחשב נומרית בקרה). כגון עובש מתממש בפוליקרבונט עם הצילינדר המרכזי בpolytetrafluoroethylene (PTFE). חומר זה מאפשר מיצוי קל של המסכה פעם PDMS הקשיח. הערה: העיצוב של העובש שבוצעה על ידי בעזרת מחשב-עיצוב (CAD) ולאחר מכן מועברת למכונת כרסום CNC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את אלסטומר PDMS. PDMS הוא פולימר אורגני. הוא מורכב משני אלמנטים, סוכן ריפוי ופולימר. לערבב אותם על ידי יחס נפח של 1:10, חלק אחד של סוכן ריפוי ותשעה חלקים של פולימר. לשים את שני המרכיבים בצלחת פטרי, לנער ולהכניס את התערובת בתא הוואקום במשך 10 דקות כדי למנוע בועות אוויר. 3 גרם של PDMS מספיקים לאילוץ אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות את אילוץ PDMS. הכנס את חומר PDMS לתוך להרקב והכנסתי אותו לתנור למשך 30 דקות ב 120 מעלות צלזיוס. יש אילוץ PDMS הצורה של גליל אידיאלי עם קוטר חיצוני ופנימי של 22.0 ו -3.0 מ&quot;מ, בהתאמה וגובה של 650 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני הציפוי, זוג המסכה לאזור הפעיל של מערכי מיקרו-אלקטרודה (MEAs) באמצעות פינצטה תחת סטראו ולעקר את מסכת PDMS בתנור על 120 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את microbeads הזכוכית (קוטר נומינלי של 40 ± 2 מיקרומטר; קוטר ממוצע של 42.3 מוסמך ± 1.1 מיקרומטר) באתנול 70% לשעה 2 בבקבוקון חרוטי ולסובב EVery 30 דקות כדי לחשוף את כל microbeads. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון אתנול מהבקבוקון ולשטוף microbeads שתי פעמים עם מים מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתנות חלק משטח MEA המופרד על ידי מסכת PDMS (קוטר שווה ל 3.0 מ&quot;מ) עם 24 μl של פתרון המעורב של פולי-D-ליזין וLaminin ב0.05 מיקרוגרם / מיליליטר המרכזי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל microbeads עם חלבוני הדבקה, Laminin ופולי-D-ליזין ב0.05 מיקרוגרם / מיליליטר ולהשאיר אותם לילה בחממה על 37 מעלות צלזיוס, להשיג ברשת עצבית יציבה וארוכה טווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את גורמי ההידבקות הן ממשטח הזכוכית של MEA ומmicrobeads הזכוכית. לשאוב כ -95% מפתרון הציפוי עם טפטפת ולהחיל volume- קטן 24μl- של מים סטריליים על פני השטח MEA. לשאוב שוב יותר מ -95% מהמים ולתת יבשים MEA מתחת למכסת המנוע למינרית עבור שעה 1 לפני ציפוי התאים. הערה: במקרה של microbeads במקום, לשאוב את הציפויפתרון ולעשות כביסה ראשונה עם מים מעוקרים ואחד שני עם המדיום הבסיסי והתוספת שלה כגון B27, כדי להתנות את משטח הזכוכית שבו נוירונים יהיו מצופים. אל תתנו microbeads יבש. להשאיר אותם בהשעיה במדיום התרבות בתוך הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ, באמצעות פיפטה -200 μl-, ההשעיה של microbeads טופל (כ 32,000) על צלחת multiwell עם הוספת קרום (קוטר נקבובית 0.4 מיקרומטר) שבו הם יהיו עצמיים להרכיב יוצרי שכבה אחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא היטב בכל הקרום עם 0.5 מיליליטר של מדיום ולשים אותו בחממה (T = 37.0 מעלות צלזיוס, CO 2 = 5%) עד נוירונים מוכנים להיות מצופה (3.2). </li></ol> 2. Dissection של עוברים ודיסוציאציה של רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חולדות בוגרות בית נקבה (200-250 גרם) בטמפרטורה קבועה (C 22 ± 1 °) ולחות היחסית (50%) בלוח זמני אור הכהה רגיל (אור-על 07:00-19:00) במתקן בעלי חיים. ודא שמזון ומים זמינים באופן חופשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי נקבת עכברוש הריון לאחר 18 ימים של פיתוח (E18) באמצעות 3% isoflurane. לאחר מכן, להקריב בעלי החיים על ידי נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר hippocampi מכל עובר חולדה ולהכניס אותם לתוך הפתרון של קרח הקר האנק המאוזן מלח ללא Ca 2 + וMg 2 +. ביום 18 בהיפוקמפוס פיתוח ורקמות קליפה רכים מאוד ולא צריכים לחתוך לחתיכות קטנות. ניתן למצוא פרטים נוספים 18,19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הרקמה ב0.125% מהפתרון של טריפסין / האנק מכיל 0.05% מDNAse ל18-20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון supernatant עם טפטפת פסטר ולעצור את העיכול אנזימטי על ידי הוספה בינונית עם 10% בסרום שור עוברי (FBS) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום עם FBS ולשטוף פעם אחת עם המדיום עם התוספת שלו, 1% L- גלוטמין, גנטמיצין 10 מיקרוגרם / מיליליטר. הסר שוב בינוני עם PIP פסטרette ולמלא אותו שוב עם כמות קטנה (500 μl) של מדיום גידול עם התוספת שלו, 1% L- גלוטמין, גנטמיצין 10 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את גלולה הרקמה מכאנית עם פיפטה פסטר צרה עד השעיה חלבית של תאים היא לכאורה. אין צורך לצנטריפוגה ההשעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנפח הקטן של השעיה תא עם מדיום הגידול להשיג נפח סופי של 2.0 מיליליטר. לספור את הריכוז הסלולרי שהושג עם תא hemocytometer. לדלל ריכוז זה ב 1: 5 על מנת לקבל ריכוז התא הרצוי של 600-700 תאים / μl. </li></ol> 3. תא ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי פלייט בצפיפות של כ -2,000 תאים / מ&quot;מ 2 על האזור הפעיל של MEA, שהוגדרו על ידי אילוץ PDMS ליצור רשת עצבית 2D. הערה: כל ההיפוקמפוס מכיל כ 5 x 10 5 תאים, (1 x 10 6 לעובר יחיד). לנתח 6 עוברים כדי לקבל סכום כולל של 6 x 106 תאים 2 מיליליטר, וריכוז משוער של 3,000 תאים / μl. לדלל ריכוז זה ב 1: 5 על מנת לקבל ריכוז התא הרצוי וצלחת על 600-700 תאים / μl. אם אזור MEA המופרד על ידי אילוץ PDMS הוא על 7.065 מ&quot;מ 2, והמספר הכולל של תאים מצופים 600 תאים / μl x 24 μl = 14,400 תאים, הצפיפות הסופית של 2,038 תאים / מ&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מכשירי MEA לתוך החממה עם CO 2 אווירת humidified (5%) על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ 160 μl של ההשעיה עם ריכוז תא של 600-700 תאים / μl (כ -100,000 תאים) על פני השטח של monolayer microbeads ממוקם בתוך צלחות multiwell כדי להשלים את השלב המקדים לבניית התרבות תלת-ממדית. שים את צלחות multiwell בחממה עם CO 2 אווירת humidified (5%) על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> בניית 4. רשת העצבית 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6-8 שעות לאחר הציפוי, להעביר את ההשעיה (microbeads עם הנוירונים) מהצלחות multiwell מאוד בזהירות בתוך השטח המופרד על ידי אילוץ PDMS באמצעות פיפטה נקבעה לנפח של כ 30-40 μl. לאחר כל העברה, לחכות כחצי דק, כדי לאפשר microbeads לעצמי להרכיב במבנה קומפקטי משושה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שכל השכבות מופקדות וספונטאניות התאספו, למלא עם ירידה גדולה של כ -300 μl של מדיום העליון של האזור המופרד על ידי אילוץ PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את מבנה 3D מצמידים את MEA בחממה (T = 37.0 מעלות צלזיוס, CO 2 = 5%) למשך 48 שעות לפני הוספת נפח סופי (כ 1 מיליליטר) של תרבות מדיום גידול עם התוספת שלה. הערה: קחו למשל את המספר הכולל של חרוזים על צלחות multiwell עם הוספת הקרום (30,000) ומספר חרוזים בשכבה אחת על גבי מכשיר MEA (6000). מבנה 3D וכתוצאה מכך מורכב של 5 שכבות של מילcrobeads ותאים. אם ניקח בחשבון שהרשת העצבית 3D היא לא גיאומטרית מושלמת, מבנה 3D וכתוצאה מכך יכול להיות מורכב משכבות 5-8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לאחר ציפוי, להוסיף בזהירות את הנפח הסופי של המדיום (כ -900 μl) בתוך טבעת MEA. לשמור על תרבויות 3D בCO 2 אווירת humidified (5%) על 37 מעלות צלזיוס במשך 4-5 שבועות. להחליף מחצית בינוני פעם בשבוע. </li></ol> 5. מיקרוסקופיה confocal רכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הדגימות הביולוגיות לשלב של מיקרוסקופ בבעל. הגדר את הלייזר (ארגון, 496-555 ננומטר), מהירות הסריקה (400 הרץ) שבו לרכוש את התמונה, רווח וקיזוז (0.3%) של PMT עבור כל תמונה כדי ללכוד את מסנן פליטת רוחב פס הנכון וכדי כדי למנוע הרוויה ולהגדיל את יחס האות לרעש. תוצאות סעיף מדווח הערכים שימשו לרכישת התמונות של איור 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכישת z -stack רצף, האשוחרח &#39;בחר, הערך של עמדת z של החלק העליון והשכבה התחתונה של המדגם, ולאחר מכן בחר את גודל צעד כדי להפוך את הרכישה. </li></ol>

<ol><li>Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stability+and+developmental+changes+in+spontaneous+network+burst+firing+patterns+in+dissociated+rat+cerebral+cortex+cell+cultures+on+multi-electrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays.</a> Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).</li>
<li>Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precisely+timed+spatiotemporal+patterns+of+neural+activity+in+dissociated+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscienc%22%5BJournal%5D)">Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures.</a> Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).</li>
<li>Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectronic+system+for+high-resolution+mapping+of+extracellular+electric+fields+applied+to+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).</li>
<li>Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+microdrop+delivery+system+for+neuronal+network+patterning+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays.</a> J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).</li>
<li>Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+compartment+neurofluidic+system+for+electrophysiological+measurements+in+physically+segregated+and+functionally+connected+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroeng%22%5BJournal%5D)">Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture.</a> Front. Neuroeng. 4, (2011).</li>
<li>Kanagasabapathi, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+and+dynamics+of+cortical-thalamic+networks+co-cultured+in+a+dual+compartment+device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Eng%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device.</a> J. Neural. Eng. 9, (2012).</li>
<li>Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tissue+engineering+and+biohybridized+microsystems+for+neurobiological+investigation+in+vitro+%28Part+1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1).</a> Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Bursting+in+Cortical+Cultures+with+Closed-Loop+Multi-Electrode+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation.</a> J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).</li>
<li>Shany, B., Vago, R., Baranes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+primary+hippocampal+neuronal+tissue+on+an+aragonite+crystalline+biomatrix%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss.+Eng%22%5BJournal%5D)">Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix.</a> Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).</li>
<li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tissue+engineering%3A+strategies+for+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).</li>
<li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+stem+and+progenitor+cell+differentiation+into+functional+neuronal+circuits+in+three-dimensional+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels.</a> Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).</li>
<li>Baranes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interconnected+network+of+ganglion-like+neural+cell+spheres+formed+on+hydrozoan+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+En%22%5BJournal%5D)">Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton.</a> Tissue En. 13, 473-482 (2007).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+B%2C+Review%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: state of the art.</a> Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).</li>
<li>Schuz, A., Palm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+of+neurons+and+synapses+in+the+cerebral+cortex+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).</li>
<li>Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloid-guided+assembly+of+oriented+3D+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Method%22%5BJournal%5D)">Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks.</a> Nat. Method. 5, 735-740 (2008).</li>
<li>Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+dynamics+of+3D+engineered+neuronal+cultures%3A+a+new+experimental+model+for+in-vitro+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology.</a> Sci. Rep. 4, (2014).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+functional+brain-like+cortical+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S%22%5BJournal%5D)">Bioengineered functional brain-like cortical tissue.</a> Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cell%22">Culturing Nerve Cell</a>. , 2nd edition, MIT Press. (1998).</li>
<li>Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+culture%2C+record+and+stimulate+neuronal+networks+on+Micro-electrode+arrays+%28MEAs%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs).</a> J. Vis. Exp. (39), (2010).</li>
<li>Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chitin+and+chitosan+nanofibers+in+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Adv%22%5BJournal%5D)">Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications.</a> Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).</li>
<li>Crompton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polylysine-functionalised+thermoresponsive+chitosan+hydrogel+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterial%22%5BJournal%5D)">Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering.</a> Biomaterial. 28, 441-449 (2007).</li>
<li>3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

בעבודה זו, ניסוי חדשני בפלטפורמת מבחנה המורכבת מ3D מהונדס תרבויות עצביות מצמידים את MEAs לאלקטרופיזיולוגיה רשת כבר הציג. השימוש בmicrobeads כפיגום לאפשר תולדת דלקת העצבים לאורך -axis z כבר מותאם להיות משולב עם MEA מישוריים. בדרך זו, תוצאות מיקרו-המערכת שהושגו במבחנת מודל 3D תקף ומהימן כדי ללמוד את דינמיקת אלקטרו מתהווה 16. הגדרת הקלטת MEA <p class="jove_content" style=";t...

ברשתות מבחנה דו-ממדיות (2D) עצביות מצמידים את מיקרו-אלקטרודה מערכים (MEAs) עלה יפה אימץ ללמוד את יחסי הגומלין בין דינמיקה העצבית והקישוריות הבסיסית מודל ניסיוני זהב סטנדרטי. במהלך הפיתוח, נוירונים לשחזר רשתות מורכבות המציגות גם פעילות definedspatio-temporalpatternsof 1,2 (כלומר, התפרצויות, התפרצויות רשת, פעילות spiking אקראית). MEAs להקליט את פעילות אלקטרו מאתרים רבים (בין עשרות לאלפים microelectrodes), המאפשר חקירה מפורטת של הדינמיקה הביעה ברמת הרשת. בנוסף, השימוש בתרבויות ניתק עושה possibile לעצב מהונדסות-רשתות. זה קל יותר להבין בדרך זו את היחסים הפונקציונליים בין פעילות אלקטרו נרשמה והפרמטרים של ארגון הרשת כמו תא צפיפות 3, מידת המודולריות 4,5, נוכחות של פופ העצבי הטרוגנית6 ulations, וכו &#39;עם זאת, כל במבחנה בתאים בתרבית ניתקו מבוססת על רשתות עצביות 2D. גישה זו מובילה לפשטנותן ביחס למערכת בvivo (3 ממדים מהותי, 3D): (i) בקונוסים מודל, somata וצמיחת 2D הם שטוחים ותולדת האקסונים-דנדריטים לא יכול להתפשט לכל הכיוונים 7. (Ii) במבחנה תערוכת רשתות 2D סטריאוטיפית דינמיקת אלקטרו נשלטה על ידי מתפוצץ פעילות הכרוכה ברוב הנוירונים של הרשת 8. לאחרונה, פתרונות שונים פותחו כדי לאפשר הבנייה של במבחנה 3D ניתק רשתות עצביות. הרעיון המשותף מורכב ביצירת פיגום שבו תאי עצב יכולים לגדול בצורה 3D. כגון פיגום יכול להתממש עם ג&#39;לי פולימר ומטריצות נקבוביות מוצקות 9-13. על ידי ניצול התכונות מכאניות של הפולימרים, ניתן להטביע בתוך תאים thesמבני דואר על ידי הגדרת בלוק אחיד של תרבויות 3D של neurospheres 11. התכונה העיקרית של גישה זו היא הרכוש המכני הנוקשה של neurospheres 9,12. עם זאת, חומרים אלה נקבוביות מוגבלים, והם לא מבטיחים נדידת תאים בתוך המטריצה. כדי להתגבר על חסרון זה, פתרון אפשרי מורכב בחיתוך המטריצה ​​לתוך מודולים &#39;יחידה&#39;. למרבה הצער, את מגוון הגודל וצורה של החלקיקים עלול להקשות על האריזה למבנים שכבתיים רגילים. ב -7, קאלן ועמיתים לעבודה שנועדו לבנות עצבי 3D מורכב מתאי עצב ו / או האסטרוציטים בתוך פיגום מבוסס מטריקס ביו. כגון רקמה עצבית מהונדסת אפשרה בחקירות מבחנה ללמוד ולתפעל תגובות נוירו-ביולוגיות בתוך מיקרו-סביבות 3D. מודל זה מורכב מתאי עצב וגליה מופצים ברחבי המטריצה ​​תאית (ECM) ו / או פיגומי הידרוג&#39;ל (500-600 מיקרומטר עבה). בשיתוף זהndition, כדאיות אופטימלית תא (יותר מ 90%) נמצאה על ידי תאי ציפוי בצפיפות סופית של כ 3,750 - 5,000 תאים / מ&quot;מ 3. יש לציין שערך כגון צפיפות נמוך בהרבה מזה שבמצב in vivo, שבו צפיפות התאים בקליפת מוח העכבר היא כ 90,000 תאים / מ&quot;מ 3 14. כדי להתגבר על מגבלה זו Pautot ועמיתים לעבודה 15 הבינו במבחנה מערכת 3D שבו צפיפות תאים וקישוריות לרשת נשלטות להידמות בתנאי vivo תוך שהוא מאפשרים הדמיה של הרשת בזמן אמת. למעשה, שיטה זו מבוססת על הרעיון שניתק נוירונים בתרבית יכולים לגדול על microbeads סיליקה. חרוזים אלה מספקים משטח צמיחה גדול מספיק עבור גופי תא עצביים לדבוק ולarborizations לגדול, בוגר, להאריך, ולהגדיר קשרים סינפטיים לנוירונים אחרים. שיטה זו מנצלת את תכונות הרכבה הספונטניות של חרוזים פיזור מונו לFOrm 3D שכבתי מערכי משושים המכילים תת שונה של תאי עצב בשכבות שונות עם קישוריות מוגבלת, בין הנוירונים בחרוזים שונים. צפיפות התאים הושגו בשיטה זו הייתה על 75,000 תאים / מ&quot;מ 3. לאחרונה, יש לנו השיטה מותאמת של Pautot לMEAs 16: התוצאות שהתקבלו מראות כי פעילות אלקטרו 3D מציגה רפרטואר רחב יותר של פעילויות מזו באה לידי ביטוי על ידי רשתות 2D. תרבויות בוגרות 3D תערוכה דינמית משופר שבה שני פרץ הרשת ולהתקיים פעילות ספייק אקראית. באופן דומה, טאנג-Schomer ועמיתים לעבודה 17 הבינו פיגום נקבובי מבוסס חלבון משי אשר שומר תרבות בקליפת המוח עיקרי במבחנה במשך כמה חודשים, ורשמו את פעילות אלקטרו באמצעות אלקטרודה טונגסטן. בעבודה זו, הפרוצדורות לבנות רשתות עצביות 3D מצמידים את MEAs יתואר.

<table><tbody><tr><td>למינין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L2020</td><td>0.05 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6407</td><td>0.05 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>גיבקו</td><td>25050-014</td><td>0.125% מדולל 1:2 ב-HBSS w\o CA++, MG+++</td></tr><tr><td>DNAase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>0.05% מדולל&nbsp; בתמיסת הנקס</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco Invitrogen</td><td></td><td>מדיום תרבית</td></tr><tr><td>21103049 B27</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>17504044</td><td>2% בינוני</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-2442</td><td>10%</td></tr> <tr><td>Glutamax-I&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>0.5 מ"מ</td></tr><tr><td>גנטמיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G.1272</td><td>5 מ"ג/ליטר</td></tr><tr><td>פולי-דימתיל-סילוקסן (PDMS)</td>חומר ריפוי <td>481939 קורנינג סיגמא</td><td></td><td>והפולימר</td></tr><tr><td>מערכי מיקרו-אלקטרודות</td><td>מערכות רב-ערוציות (MCS)</td><td>60MEA200/30-Ti-pr</td><td>MEA עם: רשת אלקטרודות 8x8; מרווח וקוטר אלקטרודות 200 ו-30 ומיקרו; מ', בהתאמה; טבעת פלסטיק ללא חוט</td></tr><tr><td></td><td>Microbead Distrilab-Duke Scientific</td><td>9040</td><td>&nbsp; 1 גרם חלק זכוכית. גודל סטנדרטי 40 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Costar Sigma</td><td>CLS 3413</td><td>לוחות מרובי בארות עם תוספת ממברנה (קוטר 6.5 מ"מ נקבובי 0.4 ומיקרו; m)</td></tr><tr><td>HBSS w\o Ca++ ,Mg++&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14175-052</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Buffer Solution&nbsp;</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>טפלון</td><td>סיגמא</td><td>430935-5G</td><td>פוליטטרפלואורואתילן</td></tr><tr><td>עכברוש</td><td>ספראג דולי</td><td>וויסטאר עכברוש</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה קונפוקלית זקוף</td><td>Leica</td><td>TCS SP5 AOBS</td><td></td></tr><tr><td>20.0x0.50 מטרת מים</td><td>Leica</td><td>Leica HCX APO L U-V-I&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>40.0x0.80 מטרת מים</td><td>Leica</td><td>Leica HCX APO L U-V-I&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>25.0x0.95 מטרת מים</td><td>Leica</td><td>HCX IRAPO L</td><td></td></tr></tbody></table>

התממשקות תרבויות 3d הנדסה עצבית למערכי מיקרו-אלקטרודה: חדשני<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם ניסיוני

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

נכון לעכשיו, רשתות בקנה מידה גדול שמקורן בנוירונים מנותקים הגדלים ומתפתחים במבחנה במכשירי מיקרו-מתמרים חוץ-תאיים הם המודל הניסויי הסטנדרטי לחקר מנגנונים נוירופיזיולוגיים בסיסיים המעורבים בהיווצרות ותחזוקה של מכלולי תאים עצביים. עם זאת, מחקרי מבחנה הוגבלו לרישום הפעילות האלקטרופיזיולוגית הנוצרת על ידי רשתות עצביות דו-ממדיות (2D). עם זאת, בהתחשב בקשר המורכב בין מבנה לדינמיקה, יש צורך בשיפור משמעותי כדי לחקור את היווצרותן והתפתחותן של רשתות תלת מימדיות (תלת מימד). בעבודה זו, מוצגת פלטפורמה ניסיונית חדשה שבה רשתות היפוקמפוס או קליפת המוח תלת מימדיות מחוברות למערכי מיקרו-אלקטרודות מישוריים (MEAs). רשתות תלת מימד מתממשות על ידי זריעת נוירונים בפיגום המורכב ממיקרו-חרוזי זכוכית (בקוטר 30-40 מיקרומטר) שעליהם נוירונים מסוגלים לגדול וליצור מכלולים תלת מימדיים מורכבים המחוברים זה לזה. באופן זה ניתן לתכנן רשתות תלת מימד מהונדסות המורכבות מ-5-8 שכבות עם צפיפות תאים סופית צפויה. המורכבות הגוברת בארגון המורפולוגי של מכלול התלת מימד גורמת לשיפור הדפוסים האלקטרופיזיולוגיים המוצגים על ידי רשתות מסוג זה. בהשוואה לרשתות הדו-ממדיות הסטנדרטיות, שבהן מופיעה פעילות התפרצות סטריאוטיפית מאוד, המבנה התלת-ממדי משנה את פעילות ההתפרצות מבחינת משך ותדירות, כמו גם מאפשר תצפית על פעילות זינוק אקראית יותר. במובן זה, מודל התלת מימד שפותח דומה יותר לרשתות עצביות in vivo.

. בהליך ניסיון זה, תפקיד רלוונטי הוא שיחק על ידי microbeads המגדירים את הפיגום המכני לצמיחה של הרשת העצבית 3D איורים תצוגת 1A ו- B ההסדר של microbeads (קוטר נומינלי של 40 ± 2 מיקרומטר; קוטר ממוצע מוסמך של 42.3 ± 1.1 מיקרומטר) במטוס. הייחוד של מבנים כאלה הוא שmicrobeads באופן ספונטני עצמי להרכיב-הגדרת גיאומטריה קומפקטית משושה (איור 1 ו- C). הפיגום כך נוצר מבטיח משטח צמיחה עקבי לneurites ומרחב הבין מספיק גדול להחלפת חילוף החומרים של...

בעבודה זו, מודל ניסיוני חדשני שבו תרביות עצביות תלת-ממדיות מחוברות למערכי מיקרו-אלקטרודות מישוריים (MEAs) presented. 3D רשתות נבנות על ידי זריעת נוירונים בפיגום המורכב ממיקרו-חרוזי זכוכית שעליהם גדלים נוירונים ויוצרים מבנים תלת-ממדיים המחוברים זה לזה.

התממשקות תרבויות 3D הנדסה עצבית למערכי מיקרו-אלקטרודה: חדשני<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם ניסיוני

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להציג מודל חדשני של רשתות עצביות תלת-ממדיות in vitro המחוברות למערכי מיקרו-אלקטרודות. הדבר מושג תחילה על ידי התניית החלק המרכזי של ה-MEA עם תמיסה מעורבבת של poly de lysine ולמינין, ולאחר מכן ציפוי של מיקרו-חלקיקים (microbeads) בחלבוני הדבקה, למינין ופוליליזין. השלב השני הוא פיזור של תרחיף המיקרו-חלקיקים המטופלים על פלטה רב-בארים, שבה הם יתרחקו באופן עצמאי וייצרו שכבה אחידה.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא זריעת התאים על השטח הפעיל של ה-MEA בצפיפות של 2000 תאים לסמילימטר רבוע כדי ליצור רשתות עצביות דו-ממדיות (2D). שש עד שמונה שעות לאחר הזריעה, מועבר התליה מהפלטות בעלות מספר בארות אל ה-MEA, והמיקרו-בידס (microbeads) נותרים להתארגן עצמאית במבנה משושה דחוס. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להדמיות של הרשתות התלת-ממדיות (3D), אשר מושוות לרשתות העצביות הדו-ממדיות הקונבנציונליות שגודלו על גבי MEA.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרביות תאים דו-ממדיות in vitro, הוא שבמודל דו-ממדי, הגופים התאיים (somata) ואפי העגיבה (growth cones) נמעכים, ואדונו ורייז אינם יכולים להתפשט לכל הכיוונים. בנוסף, פעילות התפרצות (bursting activity) שולטת בדינמיקה האלקטרופיזיולוגית של רשתות דו-ממדיות, בעוד שבשלוש ממדים קיימת גם פעילות של פריקה אקראית (random spiking activity). הרעיון לשיטה זו עלה אצלנו לראשונה כאשר קראנו את מאמר המחקר של Sophie Potto שפורסם ב-Nature Method בשנת 2008, שבו השתמשה ב-MICROBITS כפיגום לבניית רשתות עצביות תלת-ממדיות.לאחר מכן התאמנו לשיטה זו כדי לבצע את ההקלטות התלת-ממדיות הראשונות in vitro. להכנת האלאסטומר PDMS, ערבבו את חומר המקשה ואת הפולימר ביחס נפחי של אחת לתשע בתוך צלחת פטרי. לאחר מכן, נערו את התערובת והניחו אותה בתא ואקום למשך 10 דקות כדי לסלק בועות אוויר.כדי להכין את הגבלת ה-PDMS, הכניסו את חומר ה-PDMS לתוך התבנית ולאחר מכן, הכניסו אותה לתנור למשך 30 דקות בטמפרטורה של 120 °C. הגבלת ה-PDMS צריכה להיות בצורת גליל עם קוטר חיצוני ופנימי של 22.0 ו-3.0 מילימטרים בהתאמה, וגובה של 650 מיקרומטרים, יום לפני הפריסה. חברו את המסכה לאזור הפעיל של ה-MEA תחת מיקרוסקופ סטריאו, ולאחר מכן עקרו את מסכת ה-PDMS בתנור בטמפרטורה של 120 °C.בשלב הבא, עקרו את חרוזי הזכוכית בתוך מבחנה קונוית עם 70% Ethanol למשך שעותיים, תוך סיבוב כל 30 דקות כדי לחשוף את כל החרוזים לאחר מכן. הסירו את תמיסת האתנול מהמבחנה ושטפו את חרוזי הזכוכית פעמיים במים סטריליים. לאחר מכן, התנו את החלק המרכזי של אזור ה-MEA המוגדר על ידי מסכת ה-PDMS עם 24 µL של תמיסה מעורבבת של polylysine ו-laminin בריכוז של 0.05 µg/mL.טפטפו על המיקרו-חרוזיים (microbeads) חלבוני הידבקות, למינאט ופולי-ליזין בריכוז של 0.05 micrograms per milliliter. לאחר מכן, הכניסו אותם למדגרה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius כדי להשיג רשת נוירונלית יציבה ועמידה לאורך זמן. לאחר מכן, חלקו את ת сусפנסיית המיקרו-חרוזיים המטופלים אל פלטת המאברים (multi-well plate) בעלת התא הממברנלי (membrane insert), שם הם יתרחקו באופן עצמי וייצרו שכבה אחידה.לאחר מכן, מלאו כל באר בממברנה ב-0.5 milliliters של מצע גידול. הכניסו אותה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 degree Celsius ו-5% carbon dioxide עד שהנוירונים יהיו מוכנים להזריעה בשלב זה. לאחר הקרבת נקבת חולדה בהריון ביום E 18, השגי אתם את עוברי החולדה, ולאחר מכן הוציאו את ה-hippo campi מכל עוברי חולדה.העבר אותם למحلול מלח Hanks קר בקרח, ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, בצע דיסוציאציה לרקמה בתמיסת tryin Hanks בריכוז 0.125% המכילה 0.05% DNAs למשך 18 עד 20 דקות בטמפרטורה של 37 °C.לאחר מכן, הסיר את העלמיות באמצעות פפית פסטור. עצור את העיכול האנזימתי על ידי הוספת מצע עם 10%FBS למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את המצע עם ה-FBS ושטוף פעם אחת עם מצע גידול, בתוספת של 1%L-glutamine ו-Gentamycin בריכוז של 10 micrograms per milliliter.לאחר מכן, הסר את המצע. מלא אותו שוב ב-500 µL של מצע גידול. תספיג אותו ב-1% L-glutamine ו-Gentamycin בריכוז של 10 µg/mL.נתקו את כדור הרקמה באופן מכני באמצעות פלסטיק-פיפט (PEs pipette) צר עד להשגת תרחיף תאים חלבי. לאחר מכן, דללו נפח קטן של תרחיף התאים בעזרת מדיום גידול כדי להגיע לנפח סופי של 2.0 milliliters. ספרו את ריכוז התאים שהתקבל באמצעות תא המידה של המוסימטר (hemocytometer chamber).לאחר מכן, דללו ריכוז זה ביחס של אחד לחמישה כדי להשיג את ריכוז התאים הרצוי של 600 עד 700 תאים למיקרוליטר. זרעו את התאים בצפיפות של 2000 תאים לממ"ר על השטח הפעיל של ה-MEA, המוגדר על ידי מגבלת ה-PDMS, כדי ליצור רשת נוירונלית דו-ממדית. לאחר מכן, הכניסו את התקן ה-MEA לאינקובטור עם אטמוספירה מלחחית של 5% פחמן דו-חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.כדי להשלים את השלב המקדים לבניית תרבית תלת-ממדית, חלקו 160 µL מהתליה בריכוז תאים של 600 עד 700 תאים ל-µL על פני השטח של השכבה האحادית של המיקרו-בידס (microbeads) הממוקמת בתוך פלטות הרב-בארים. לאחר מכן, מקמו את פלטות הרב-בארים באינקובטור עם אטמוספירה של 5% פחמן דו-חמצני (carbon dioxide) מלחח בטמפרטורה של 37 °C. שש עד שמונה שעות לאחר הפיזור, העבירו 30 עד 40 µL מהתליה הכוללת מיקרו-בידס ונוירונים לאזור ה-MEA המוגבל על ידי מגבלת ה-PDMS. לאחר כל העברה, המתינו כחצי דקה כדי לאפשר למיקרו-בידס להתרחב למבנה משושה באופן עצמאי.לאחר שכל השכבות הופקדו והורכבו באופן ספונטני ב-300 µL של מצע בחלקו העליון של האזור המוגבל על ידי אילוץ ה-PDMS. הנח את המבנה התלת-ממדי המחובר ל-MEA באינקובטור ב-37 °C ו-5% CO2 למשך 48 שעות. לאחר מכן, הוסף 1 mL של מצע גידול עם התוסף שלו; לאחר שלושה שבועות in vitro, המבנה התלת-ממדי יציב גם ללא אילוץ ה-PDMS המוצג.כאן מוצגת תמונת DIC של שכבה אחת של חרוזי מיקרו המחוברים לפני השטח של ה-MEA. מיקומם של הנקודות השחורות מייצג את הפריסה המרחבית של האלקטרודות. צביעה אימונופלואורסצנטית עבור מפה שתיים, המיוצגת על ידי האות האדום, מראה את ההפצה של ההסתעפות הדנדריטית ושל ADA של הנוירונים סביב חרוזי המיקרו המחוברים ישירות למישור האלקטרודות של ה-MEA.תמונה זו מציגה הש projection מקסימלי של רצף Z של תרבית תלת-ממדית המציגה רשת בעלת קישוריות גבוהה, שבה נוירונים סומנו עבור NeuN המובטא בנוירונים פוסט-מיטוטים בוגרים, ועבור GABA. כאן מופיעה הקלטה אלקטרופיזיולוגית מייצגת של רשתות היפוקמפליות בתצורת תלת-ממד, וכאן מופיעה ההקלטה האלקטרופיזיולוגית המייצגת של הרשתות ההיפוקמפליות בתצורת דו-ממד.לאחר השליטה בפרוצדורה, ניתן לבצעה בשבע שעות. עם זאת, כדאי לציין כי מכיוון שהפרוצדורה כוללת מספר שלבים המבוצעים בימים שונים, הערכת הזמן לביצוע הפרוצדורה כולה היא בגדר אינדיקציה בלבד. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להניח תחילה שכבה דו-ממדית (2D) של נוירונים על אלקטרודת ה-MEA, ולאחר מכן להעביר בזהירות רבה את תרחיף המיקרוביטים והנוירונים מהפלטה בעלת הרב-בארים אל ה-MEA כדי ליצור את המבנה התלת-ממדי (3D) לאחר התפתחותו.טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירו-מדע החישובי לבחון כיצד קישוריות הרשת יכולה לעצב את הדינמיקה המתהווה של הרשת. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו בונים רשת נוירונלית תלת-ממדית in vitro המשולבת במערכי מיקרו-אלקטרודות.

interfacing-3d-engineered-neuronal-cultures-to-micro-electrode-arrays

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מספק את המידע הדרוש להקמת, טיפול, הקלטה מ - ו - גירוי חשמלי תרבויות על MEAs.

איך להקליט התרבות לעידוד רשתות נוירונים על מיקרו אלקטרודה מערכים (MEAs)

סרטון זה מדגים את התפתחותה של תרבית עצבית תלת-ממדית המשולבת למערך מיקרואלקטרודות מישורי עם נוירונים בהיפוקמפוס. תאי העצב המבודדים יוצרים רשת דו-ממדית על האזור הפעיל של מערך המיקרואלקטרודות ונצמדים למיקרו-כדוריות זכוכית בצלחת מרובת בארות עם החדרת קרום. כאשר מעבירים את המיקרו-כדוריות מצופות הנוירונים האלה לאלקטרודה, הן מתארגנות לרשת עצבית תלת-ממדית מקושרת.

בניית רשתות נוירונים תלת-ממדיות המצומדות למערכי מיקרו-אלקטרודות

סרטון זה מדגים את הליך השימוש במערך רב-אלקטרודות (MEA) למדידת פיזיולוגיה סינפטית בספירות קוקולטורה תלת-ממדיות. שיטה זו מאפשרת להבין את הדינמיקה של הרשת העצבית ואת פעילות פרץ הרשת הסינפטית בתוך הספירות התלת-ממדיות.

שימוש במערכים מרובי אלקטרודות למדידת פיזיולוגיה סינפטית בספירות קוקולטורה תלת-ממדית

כתב יד זה מתאר פרוטוקול לגדול ברשתות מודולרי מבחנה המורכבת של מעגלים עצביים, מבחינה תפקודית בין מחוברים-מוגבלים במרחב. מסכת פולימרים משמשת לדפוס שכבת חלבון לקדם הידבקות סלולרית על מצע culturing. נוירונים מצופים לגדול באזורים מצופים יצירת קשרים ספונטניים ומציג פעילות אלקטרו.

עיצוב, משטח טיפול, סלולרי ציפוי, וCulturing של רשתות עצבי מודולרי מורכב ממעגלי קשרים בין פונקציונלי

אנו מציגים פרוטוקול לתרבית נוירונים של גנגליון ספירלי עכברי ראשוני על מערכי אלקטרודות מרובים כדי לחקור פרופילי תגובה עצבית ולייעל את פרמטרי הגירוי. מחקרים כאלה נועדו לשפר את ממשק הנוירו-אלקטרודה של שתלי שבלול כדי להועיל לשמיעה אצל מטופלים כמו גם לצריכת האנרגיה של המכשיר.

ספירלת גנגליון Neuron explant תרבות Electrophysiology על מערכי אלקטרודה רבות

אנו לשנות וליישם פרוטוקול שפורסם בעבר המתאר את הבידול מהירה, לשחזור, ויעיל של תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) לתוך נוירונים בקליפת המוח מעוררים 12. באופן ספציפי, השינוי שלנו מאפשר שליטה של ​​צפיפות תאים עצבית ושימוש על מערכים מיקרו-אלקטרודות למדוד תכונות אלקטרו ברמת הרשת.

בידול העצבי המהיר של גזע תאים המושרה pluripotent למדידת פעילות רשת על מערכי מייקרו-אלקטרודה

פרוטוקול זה, אנו שואפים לתאר שיטה ישימה עבור שילוב הפומבית pluripotent אנושיים לתאי גזע נגזר נוירונים, האסטרוציטים יחד לתוך 3D כדור cocultures, שמירה על אלה התחומים בתנאים צף חינם, ולאחר מכן מדידת פעילות סינפטית מעגל הכדורים עם immunoanalysis והקלטות מערך multielectrode.

Microcircuit סינפטית דוגמנות עם Cocultures 3D האסטרוציטים ו נוירונים מתאי גזע Pluripotent אנושי

פרוטוקול זה מטרתו להדגים כיצד לשלב במבחנה microelectrode מערכים להתקנים microfluidic לימוד פוטנציאל הפעולה שידור בתרבויות עצביים. ניתוח נתונים, כלומר זיהוי ואפיון של הפצת פוטנציאל פעולה, הוא שבוצעו באמצעות חדש מתקדם, אך ידידותי למשתמש, זמינה בחופשיות, כלי חישובית.

התממשקות מיקרופלואידיקה עם מערכים Microelectrode ללמוד תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב

הדפסה תלת ממדית בקנה מידה מיקרומטרי מאפשרת אב טיפוס מהיר של התקנים פולימריים עבור תרביות תאים עצביים. כהוכחה עקרונית, קשרים מבניים בין נוירונים הוגבלו על ידי יצירת מחסומים וערוצים המשפיעים על צמיחת נוירוטים, בעוד שההשלכות התפקודיות של מניפולציה כזו נצפו על ידי אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית.

פילמור שני פוטונים הדפסה תלת-ממדית של התקני תרבית תאים עצביים בקנה מידה מיקרוני

כאן, אנו משתמשים ב- HD-MEA כדי להתעמק בדינמיקה חישובית של הרכבים עצביים בקנה מידה גדול, במיוחד בהיפוקמפוס, מעגלי פקעות ריח ורשתות נוירונים אנושיות. לכידת פעילות מרחבית-זמנית, בשילוב עם כלים חישוביים, מספקת תובנות לגבי מורכבות ההרכב העצבי. השיטה משפרת את ההבנה של תפקודי המוח, ועשויה לזהות סמנים ביולוגיים וטיפולים להפרעות נוירולוגיות.

הקלטה וניתוח של דינמיקה של אנסמבל עצבי רב-מודאלי בקנה מידה גדול במערך מיקרואלקטרודות בצפיפות גבוהה משולב CMOS

פרוטוקול זה נועד להרכיב ביציבות מכלולים מאוחים גביים-גחונים על מערכים מרובי אלקטרודות לצורך מידול אפילפסיה במבחנה.

פלטפורמה מרובת אלקטרודות למידול אפילפסיה באמצעות מכלולי מוח פלוריפוטנטיים אנושיים שמקורם בתאי גזע

למדו לבנות רשתות עצביות תלת-ממדיות במערכי מיקרו-אלקטרודה. השיטה משתמשת בחרוזי זכוכית מצופים ומיקרוסקופיה קונפוקלית לניטור פעילות חשמלית עצבית מתקדמת.

התממשקות תרבויות 3D הנדסה עצבית למערכי מיקרו-אלקטרודה: חדשני

גלה סרטונים נוספים