מנוע ולמידת מרחבית Dependent בהיפוקמפוס ופניית הערכת זיכרון במודל חולדה מהונדס של מחלת אלצהיימר עם שבץ

המטרה הכוללת של בדיקות התנהגותיות אלו היא להעריך את התפקוד המוטורי, כמו גם את הלמידה המרחבית וביצועי הזיכרון במודל חולדה חדש עם תחלואה נלווית של מחלת אלצהיימר ושבץ מוחי. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הדמנציה, כגון האופן שבו פתולוגיה של שבץ ומחלת אלצהיימר מקיימות אינטראקציה, ומייצרות פנוטיפ של גירעון מוטורי מוגבר ודעיקה קוגניטיבית מואצת. היתרון המרכזי של טכניקות אלו הוא שהן בוחנות מגוון של תפקודי מוח בעוד שהן קלות לביצוע, יעילות מבחינת עלויות ומתאימות לבדיקה חוזרת בנקודות זמן מאוחרות יותר.

ההשלכות של טכניקה זו הן לכיוון מניעת דמנציה לאחר שבץ מוחי, מכיוון שניתן לבחון תרכובות מניעתיות חדשניות לצורך בחינת הפוטנציאל שלהן להקל על הפנוטיפ ההתנהגותי הנלווה. ראשית, הניחו מראה בזווית של 45 מעלות מתחת למכשיר הצילינדר המותקן קודם לכן. לאחר מכן, חברו מצלמת וידאו לחצובה ומקמו אותה במרחק של כ-50 סנטימטרים מהמכשיר.

בדקו שניתן לראות במצלמה את כל קוטרו של הגליל במראה. לאחר מכן, בחרו חולדה שעברה אקלמיטציה וכתבו על לוח לבן את מספר החיה ומידע נוסף על הניסוי. הניחו לוח זה מול המראה ולאחר מכן לחצו על כפתור ההקלטה במצלמת הווידאו.

המשך בהרמה של החולדה מבסיס הזנב והנחה אותה לתוך הגליל. לאחר מכן, הדק את המכסה של המכשיר והסר את הלוח הלבן כך שלא יחסום יותר את המראה. לאחר הסרת הלוח הלבן, התחל בהסרטת בעל החיים למשך חמש דקות, פרק זמן המהווה ניסוי בודד.

בסיום פרק זמן זה, הפסיקו את ההקלטה, החזירו את החולדה לכלוב המגורים שלה ונקו את הגליל בעזרת ניירות סופג ומים. לאחר מכן, חזרו על השלבים שתוארו קודם לכן פעמיים נוספות כדי להגיע לסך של שלושה ניסיונות לכל חולדה. לאחר איסוף הנתונים עבור כל החולדות, ייבאו את קובצי המצלמה לתוכנה לעריכת וידאו והמשיכו לכימות מספר המגעים של ארבעת הגפיים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

ראשית, מקמו שתי יחידות מדפים במרחק של כ-100 סנטימטרים אחת מהשנייה לפני קיר שחור. לאחר מכן, השתמשו בסרט הדבקה כדי לעגן את קצותיה של קורה מעץ שהושגה מבעระ למדפים, כך שיהיה כמעט מטר אחד של עץ ללא תמיכה ביניהם. לאחר מכן, הניחו מצלמת וידאו עלeמעמד ומקמו אותה כך שהמצלמה תתעד את מלוא אורכה של הקורה.

המשיכו בבחירת חולדה שעברה סשן אימון בהליכה על קורה, ורשמו את מספרה ואת פרטי הניסוי הנוספים על לוח מחיק. עם הסיום, הדביקו את הלוח לקיר מאחורי הקורה. המשיכו בהצבת כלוב הבית של בעל החיים וצינור העשרה סביבתית, המשמשים כרמז מוטיבציוני שהחולדה יכולה להיכנס אליו מיד לאחר חציית הקורה, באחד מקצותיה.

לאחר מכן, לחצו על כפתור ההקלטה במצלמת הווידאו. מיד לאחר מכן, הרימו את החולדה בבסיס הזנב והניחו אותה בקצה הנגדי של הקורה, ללא הכלוב והצינור. הקליטו את בעל החיים עד שיחצה בהצלחה את מלוא אורכו של העץ המוגבה, דבר המסמן את סיום הניסוי.

אם החולדה עוצרת באמצע מעבר על הקורה, גע בעדינות בזנבה כדי לעודד תנועה. ברגע שהבעל חיים משלים את המשימה, העבר את כלוב המחיה שלו לקצה השני של הקורה. שנה את מספר הניסוי על הלוח הלבן וחזור על הפרוצדורה כפי שתיאור קודם לכן.

לאחר שתועדו כל ניסיונות החיות, ייבא את קבצי המצלמה לתוכנה לעריכת וידאו ונתח את השלב הרלוונטי, החלקות הגפיים ונתוני הנפילות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. התחל בקיבוע מצלמת וידאו מעל מרכזו של מיכל עגול וריק. לאחר מכן, הגדר את ארבעת הרבעים של המיכל על ידי הצמדת סרט דביק לאורך שפת המיכל, ויישר אותם כראוי עם מתאר המיכל בתוכנת המעקב.

בשלב הבא, מלאו את המכל במים לעומק של 36 סנטימטרים, ולאחר מכן הוסיפו צבע שחור לא רעיל עד שהנוזל יהיה אטום, כדי להבטיח שהפלטפורמה לא תהיה נראית מתחת לפני המים וכדי לאפשר ויזואליזציה טובה יותר של חולדות לבנות. לאחר שהבריכה הוכנה, הקיפו אותה במשטחי קיר חלקים. לאחר מכן, הכינו רמזים מרחביים על ידי גזירת ארבע צורות מבריסטולים בצבעים שונים.

לאחר מכן, הצמידו צורה אחת לכל אחד מהקירות הקשורים למיקומי הבריכה בצפון, דרום, מזרח ומערב. כדי לבצע ניסוי בלמידה מרחבית, המשיכו במיקום פלטפורמה מעגלית ברביע הדרום-מערבי של הבריכה. בתוכנת המחשב הנלווית, ודאו שמבנה זה מיושר עם אזור פלטפורמה ייעודי ברביע.

המשיכו באחיזת החולדה בבסיס זנבה והנחה אותה בעדינות בנקודת ההתחלה הייעודית במים, לאורך קיר הבריכה. ברגע שהבעל חיים במיכל, התרחקו במהירות משקם כדי שלא יראו אתכם ואתנו את החוקר השני להתחיל בתוכנת המעקב. אפשרו לחולדה לשחות עד שתאתר ותטפס על הפלטפורמה.

בנקודה זו, על החוקר השני להפסיק את הניסוי במחשב. יש להשאיר את בעל החיים על הפלטפורמה למשך 30 שניות. אם החולדה אינה מוצאת את הפלטפורמה בתוך זמן הניסוי המוקצב, במקרה זה 90 שניות, הנחו את בעל החיים אל המבנה והשאירו אותו שם למשך 30 שניות.

לאחר מכן, הרימו את החולדה בבסיס הזנב והוציאו אותה מהמבוך. הניחו אותה על מגבת המונחת על זרוע. חזרו על הליך זה שלוש פעמים נוספות עבור כל חיה, עם מרווח של 20 דקות בין הניסויים, כך שכל חולדה תשלים סך הכל ארבעה ניסויים.

עם השלמת ניסוי הלמידה המרחבית, הוציאו את הפלטפורמה מהבריכה כדי להתחיל את ניסויי הבדיקה (probe trials). בתוכנה, ודאו שמיקום הפלטפורמה הקודם, ברביע הדרום-מערבי, נשאר מוגדר. לאחר מכן, הכניסו חולדה לבריכה.

הנח אותו במים לאורך דופן המיכל. כפי שנעשה קודם לכן, התרחק מיד משדה ראייתו של בעל החיים והנחה חוקר אחר להפעיל את תוכנת המעקב. בתום ניסוי הבדיקה שנמשך 30 שניות, תפוס את בעל החיים בבסיס הזנב, הוצא אותו מהמיכל ולאחר מכן הנח אותו על זרוע מכוסה במגבת.

חזור על הליך זה שבוע לאחר מכן. לאחר ביצוע ניסויי למידה מרחבית וניסויי בדיקה (probe trials) עבור כל בעלי החיים, נתח את הנתונים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. נתונים על שימוש בארבע הגפיים ממכשיר הגליל נאספו מחולדות טרנסגניות APP21 שלושה ימים לפני השראת השבץ, ושבעה ו-20 ימים לאחר מכן.

כאשר התוצאות נרמלו והושוו לערך המייצג שימוש שווה בארבע הגפיים, המסומן כאן בקו האדום, הן מעידות כי עכברים עם תחלואה נלווית אינם מראים גרעון סטטיסטי בשימוש בארבע הגפיים. תוצאות דומות התקבלו עבור חיות מסוג wild type עם או בלי שבץ מוחי, ועבור עכברים טרנסגניים מסוג APP21 בלבד. עם זאת, חיות עם תחלואה נלווית הראו הבדלים בתפקוד מוטורי הקשור ללוקומוציה.

נתוני משימת הקורה שנאספו מחולבים אלו שבעה ימים לפני ו-21 ימים אחרי השראת השבץ, חושפים עלייה משמעותית במספר הצעדים הדרושים לחציית הלוח, דבר שלא נצפה בקבוצות אחרות. תוצאות מבוך המים של מוריס חושפות גם הן ליקויים בזיכרון בבעלי תחלואה נלווית, כפי שמעיד גרף זה המראה את אחוז השינוי בזמן ההמתנה (latency), הזמן שלוקח לבעלי החיים להגיע לרבע הבריכה שבו שהתה הפלטפורמה, בין ניסיי הבדיקה הראשון והשני. כאן, חולבים מסוג APP21 שעברו שבץ לוקחים זמן ממושך משמעותית בניסוי השני כדי להיכנס לרבע היעד.

הבדל זה לא הודגם על ידי החולדות התראנסגניות לבדן או על ידי חיות מסוג בר (wild type) עם שבץ. הדבר מעיד על כך שבעלי תחלואה נלווית סובלים מגירעון בזיכרון לטווח ארוך. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור על עקביות מקסימלית של כל המשתנים לאורך ובמהלך מפגשי הבדיקה, וליצור עבור החיות סביבה נטולת סטרס.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן להעריך ביצועים מוטוריים וקוגניטיביים במודלים של חולדות לדמנציה לאחר שבץ.