כמו כריך microenvironments לרתום ניידים / חומרי אינטראקציות
4 באוגוסט 2015
הפרוטוקול הבא מתאר את ההליך להרכבת תרביות דמויות סנדוויץ' שישמשו כשלב ביניים בין סביבות תאיות דו-ממדיות (2D) ותלת מימדיות (3D). למערכות המהונדסות יכולים להיות יישומים בבדיקות מיקרוסקופיה, ביומכניקה, ביוכימיה וביולוגיה של התא.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להרכיב תרביות דמויות סנדוויץ' על מנת לחקור את התנהגות התאים בסביבה תלת מימדית רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית. זה מושג על ידי הכנה וציפוי ראשוני של מצעי הגחון והגב בחלבונים כגון פיברונקטין. לאחר מכן, התאים יושבים בדומה לתרבית דו-ממדית סטנדרטית.
ואז המצע הגבי מכוסה כך שהתאים מגורים בגחון ובגב. לבסוף, ניתן לבצע ניסויים כגון בדיקת ריפוי פצעים. בסופו של דבר, תרביות דמויות כריכים מנותחות על ידי נהלים שכבר פותחו עבור תרביות דו-ממדיות סטנדרטיות, כגון הדמיה חיה, אימונופלואורסצנציה או מיצוי תאים.
לניתוח נוסף. היתרון העיקרי של טכניקה תרבותית זו על פני מערכות תלת מימדיות קיימות הוא שהיא אפשרה לחקור פרמטרים שונים באינטראקציות חומריות כגון טופוגרפיה, כימיה, קשיחות ותכולת חלבון הן באתרי הגחון והן בגב המציעים רמה גבוהה של צדדיות. מלבד הליכים ניסיוניים שעלולים להפריע לכמה מערכות תלת מימדיות כגון ליפין, אימונופלואורסצנציה ומיצוי תאים מבוצעים בקלות כדי לייצר סרט שטוח של חומצה פולילקטית או PLLA על ידי יציקת ממס הפועלת במכסה אדים, הוסף שני גרם PLLA ל-100 מיליליטר כלורופורם וערבב בטמפרטורת החדר כשלוש שעות או עד להמסה מלאה.
הניחו מנקי נירוסטה על צלחת פטרי מזכוכית. לאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת PLLA למכונות הכביסה. השתמש בנייר אלומיניום עם כמה חורים כדי לכסות את הכלי ולתת ל- PLLA להתאדות לאט בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
לאחר מכן, מחממים את הדגימות בחום של 120 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות על מנת לאדות כל עקבות של ממס. לאחר מכן, לאחר שאפשרו לדגימות להתקרר בטמפרטורת החדר למשך כ-30 דקות, השתמשו במים של 18.2 מגה אוהם סנטימטר כדי לכסות את הדגימות בצלחת ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שמונה דקות. לאחר הדגירה, השתמש בסכין גילוח כדי לקלף את הדסקיות מצלחת הפטרי.
לאחר מכן השתמש בפינצטה כדי להסיר פגמים מקצה הדסקיות ולתת לדגימות להתייבש באוויר. מכיוון ש-PLLA מתכלה על ידי אחסון הידרוליזה, הדגימות בוואקום מתייבשות עד ליום הניסויים. בנוסף, ניתן לייצר סיבי ELLA על פי פרוטוקול הטקסט ולהשתמש בהם כמצע גבי מתחת למכסה מנוע סטרילי.
הוסף 20 מיקרוגרם למיליליטר של FI nin ב-docos PBS או DPBS עם סידן ומגנזיום לדגימות וטמפרטורת החדר המודגרת למשך שעה לאחר ציפוי החלבון. השתמש ב-DPBS כדי לשטוף את הדגימות פעמיים ולאחסן ב-DPBS עם P סידן ומגנזיום עד שיהיו מוכנים לשימוש תאי הזרע הבאים על מכסה הזכוכית מחליק ודוגר ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שלוש שעות כדי לאפשר לתאים להיצמד למצע הגחון. לאחר מכן העבירו את הדגימות לבארות חדשות של צלחת 12 בארות.
בעזרת פינצטה, כיסו בזהירות את המצע הגבי על התאים. ואז להוסיף מיליליטר אחד של בינוני. משקל מכונת הכביסה ימנע ממצע הגב לצוף.
החזר את הדגימות ל-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, והחלף את המדיום פעמיים בשבוע כדי לחקור את נדידת התאים בתוך תרבית דמוית כריך. לאחר ציפוי מצעי הגחון והגב בפיברונקטין כפי שהודגם קודם לכן, תאי זרעים על כיסוי זכוכית מחליקים בצפיפות גבוהה, דוגרים על הדגימות ומאפשרים לתאים להשיג מפגש. לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה כדי לגרד את שכבת התא החד-שכבתית על מנת ליצור שתי אוכלוסיות תאים המופרדות על ידי פער.
הנח את המצע היושב הגחוני בבאר חדשה המתאימה לרכישת זמן-lapse וגדולה מספיק כדי שמצעי הגב יתאימו פנימה. לאחר מכן בעזרת פינצטה כפי שהודגם קודם לכן, כסה את המצע הגבי על התאים ומלא מחדש במדיום. הנח את הדגימה תחת מיקרוסקופ זמן-lapse וצלם תמונות של סגירת הפער כל 20 דקות.
השתמש בתוכנה כגון mito BO מתמונה J כדי לנתח את סגירת הפער בכריך. כמו תרבות. סולפט תלוי מאוד בזמן בו מגרים את קולטני הגב ובתכונות האינטראקציה הגבית.
בדומה למערכות תלת מימד אחרות כגון הידרוג'לים, למשל, כפי שניתן לראות כאן, סיבי PLLA מסובבים אלקטרו גבי מכוונים את יישור התאים כאשר הם מצופים בפיברונקטין, אך לא כאשר הם מצופים בחלבון שאינו דביק כמו BSA. בנוסף, תרביות דמויות סנדוויץ' עם PLLA גבי רגיל גרמו לעלייה ברמת המיוגנזה באמצעות תאי C שני C 12. זה תלוי גם בגירויים הביולוגיים הגביים.
מכיוון שהאינטראקציה עם חלבוני גב שונים מביאה לשיעורי התמיינות מובהקים כפי שמודגם בסרטון זה, פיברובלסטים הנודדים בתוך הכריך כמו תרבית בבדיקת ריפוי פצעים, מאמצים מורפולוגיה מוארכת ונודדים למרחקים קצרים יותר בהשוואה לתאים. מתורבת על מצעים דו-ממדיים הדומים לפיברונקטין תלת-ממדי וג'ל קולגן. תרבית כמו סנדוויץ' מגבירה את הארגון מחדש של ECM בתיווך תאים בהשוואה לתנאים דו-ממדיים.
תהליך זה מסתמך על הגירויים המכניים הגביים ויציבות השלד הציטולוגי. מכיוון שהשימוש במעכבי התכווצות כמו BLEs, הסטטינים עיכבו את התהליך S Ok, אז לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה ברורה כיצד להרכיב תרביות כמו כריכים. שיטה זו יכולה להנדס מיקרו-סביבה דמוית תלת מימד לרפואה ריאקטיבית וסרטן, כולל יישומים במודלים של מחלות, מחקרי פיתוח ובדיקות תרופות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את הרכבתן של תרביות דמויות-סנדוויץ' כדי לגשר בין סביבות תאיות דו-ממדיות (2D) ותלת-ממדיות (3D). מערכות מהונדסות אלו ישימות במגוון של בדיקות ביולוגיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- ביוכימיה
- מיקרוסקופיה
רקע
- תרביות דמויות סנדוויץ' מספקות סביבה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית לחקר התנהגות תאים.
- תרביות אלו מאפשרות גרייה כפולה של תאים הן מהצד הוונטרלי והן מהצד הדורסלי.
- ניתן להתאים טכניקות סטנדרטיות של תרבית דו-ממדית (2D) למערכות אלו.
- היישומים כוללים בדיקות ריפוי פצעים ודימוי חי.
מטרת המחקר
- ליצירת סביבה תלת-ממדית רלוונטית יותר למחקרים תאיים.
- לניתוח התנהגות תאים תחת תנאי גירוי כפולים.
- להקל על השימוש בטכניקות ניתוח דו-ממדיות מבוססות בהקשר תלת-ממדי.
שיטות שהושתמשו בהן
- הכנה וציפוי של תשתיות בחלבונים כגון fibronectin.
- הבאת תאים למצב של התיישבות (seating) בדומה לתרביות 2D סטנדרטיות.
- הנחת התשתית הגבית מעל התאים לצורך גירויים.
- ביצוע בדיקות כגון ריפוי פצעים (wound healing) ודימוי חי (live imaging).
תוצאות עיקריות
- הרכבה מוצלחת של תרביות דמויות-סנדוויץ׳.
- הדגמה של השפעות גירוי כפול על התנהגות תאים.
- התאמה של שיטות ניתוח דו-ממדיות (2D) לתרביות תלת-ממדיות (3D).
- תובנות לגבי תגובות תאיות בסביבה מורכבת יותר.
מסקנות
- תרביות דמויות סנדוויץ' משפרות את חקר התנהגות התאים.
- מערכות אלו יכולות לגשר על הפער בין סביבות דו-ממדיות (2D) ותלת-ממדיות (3D).
- יישומים נוספים במגוון בדיקות ביולוגיות הם מבטיחים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תרביות דמויות-סנדוויץ' (Sandwich-like cultures) גשרו על הפער התרגומי שבין מודלים דו-ממדיים (2D) פשטניים מדי לבין מערכות תלת-ממדיות (3D) מורכבות, על ידי מתן אפשרות לגירוי קולטנים משני צדדים. גישה זו מגבירה את הרלוונטיות הפיזיולוגית תוך שמירה על תאימות לזרימות עבודה אנליטיות דו-ממדיות מבוססות. היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של תיקוף מטרות וסריקה פנוטיפית, על ידי אספקת מיקרו-סביבות ניתנות לכיוונון המדמות אינטראקציות של המטריצה החוץ-תאית in vivo.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות גירוי סימולטני של רצפטורים ונטרליים (בטניים) ודורסליים (גביים), ובכך מבהיר את התרומות של אותות ספציפיים למסלול.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים של מטרות פונקציונליות על ידי בידוד משתנים מיקרו-סביבתיים המשפיעים על התנהגות התאים בפורמט מבוקר וניתן לשחזור.
- ערך ניבוי: מגביר את הביטחון במעורבות המטרה (target engagement) על ידי הסטת התנהגות התאים לעבר פנוטיפים דמויי תלת-ממד (3D), ובכך משפר את ההלימה לתגובות in vivo.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מאפשר סריקה שיטתית של תכונות חומרים (טופוגרפיה, קשיחות, ציפוי חלבונים) הן על פני השטח הגחוניים (ventral) והן על הפני השטח הגביים (dorsal) כדי לזהות ממשקים ביו-אקטיביים אופטימליים.
- ערך תפעולי: מקל על סטנדרטיזציה של בדיקות על ידי ניצול קריאות תוצאות קיימות התואמות למערכות דו-ממדיות (למשל, ריפוי פצעים, אימונופלואורסצנציה), ללא צורך בפרוטוקולי מיצוי או בדיקות דימות תלת-ממדיות ייעודיות.
- מדרגיות: מאפשר בדיקה מקבילה של וריאציות במצע הגבי תחת תנאים גחוניים עקביים, ובכך תומך במסעות סריקה בעוצמה בינונית (medium-throughput).
מחקר תרגומי ופרה-קלמיני
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי שמירה על עקביות אנליטית, החל מסריקה דו-ממדית ועד להערכה פנוטיפית רלוונטית לתלת-ממד.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מפחיתה עמימות במחקרי מודולציה של מטרות על ידי בקרה של קלטים מהמיקרו-סביבה הגבית (dorsal), שעלולים להטעות את הפרשנות של גירויים גחוניים (ventral) בלבד.
- רלוונטיות למודל מחלה: תומכת במידול של אינטראקציות סטרומליות-אפיתליאליות בפיברוזיס או בסרטן, שבהם סיגנלינג דו-כיווני משפיע על תוצאות פנוטיפיות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי שיפור בדיקות תיקוף מטרות ומאפשרת מחקרי קשר מבנה-פעילות באינטראקציות בין חומרים ביולוגיים לתאים לפני זיהוי המולקולות המובילות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות הנוגעות לאיתות אינטגרינים, העברה מכנית (mechanotransduction) ושכתוב המטריקס, באמצעות כיוון עצמאי של רמזים ונטרליים ודורסליים.
- סריקה: מספקת תוצרי פנוטיפ כמותיים וניתנים לשחזור (למשל, מהירות נדידה, יישור, ארגון מחדש של ה-ECM) התואמים לפלטפורמות של הדמיה בעלת תוכן גבוה (high-content imaging).
- אנליזה: מייצרת משתנים תלויים מדידים, כגון קצבי סגירת פערים וארגון השלד התאי, המאפשרים השוואה סטטיסטית בין תנאי חומרים שונים.
- מחקר תרגומי: מקדמת רציפות עם עבודה פרה-קלינית על ידי יצירת פנוטיפים תאיים (למשל, מורפולוגיה מוארכת, נדידה מכוונת) הנצפים במטריצות תלת-ממדיות כמו ג'לי קולגן.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה מודולרית הניתנת להתאמה לסוגי תאים וציפויים חלבוניים שונים, ובכך מפחיתה את הצורך בתיקוף חוזר בעת בחינת מטרות חדשות או ביו-חומרים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרה על ידי הפחתת תוצאות חיוביות שגויות הנובעות ממודלים פשוטים מדי של גרייה ונטראלית בלבד.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והסטנדרטיזציה על ידי מתן אפשרות להשתמש בפרוטוקולים דו-ממדיים (2D) מבוססים לזריעה, צביעה והדמיה.
- ערך אסטרטגי: מסייע לקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) בשלב מוקדם יותר של התהליך, על ידי חשיפת יעילות של מטרות התלויה במיקרו-סביבה, שעלולה להתפספס במודלים דו-ממדיים.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות או ביו-חומרים מותאם סיכון, בהתבסס על ביצועיהם בתנאי גרייה כפולה המשקפים טוב יותר את מורכבות הרקמה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאים, ציפוי חלבונים והנדסת מיקרו-סביבה כדי להבטיח גרייה עקבית של הציר הגבי-בטני (dorsal-ventral).
- תלוי בגישה לציוד ליציקה של ממסים (solvent casting) ומכסות סטריליות לייצור מצעים גביים הניתנים לשחזור (למשל, סרטי PLLA או סיבים).
- מחייב סטנדרטיזציה של ריכוזי ציפוי החלבון וזמני דגירה על פני השטחים הבטניים והגביים כדי למנוע שונות מבלבלת.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה לחומרים ביומטריים שאינם דביקים או המתפרקים במהירות, העלולים לפגוע ביציבות המצע הגבי.
- מוגבל בשל הצורך בשקיפות אופטית של המצעים הגביים לצורך דימיון בהמשך, מה שמגביל את השימוש בחומרים אטומים או כאלו המפזרים אור באופן משמעותי.
