Name: במיפוי באתרו של התכונות מכניות של Biofilms ידי Microrheology מעקב חלקיקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: למד כיצד למדוד תכונות ויסקואלסטיות של ביופילמים חיידקיים באמצעות מיקרוראולוגיה מעקב חלקיקים. שיטה זו מאפשרת לחקור את תפקידי רכיבי המטריקס ותגובת הביופילם לכוחות פיזיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למחקר ומשרד החינוך סינגפור תחת מרכזו המחקר של אקסלנס תכנית, המענקים הזנק (M4330002.C70) מהאוניברסיטה הטכנולוגית נניאנג, וAcRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) ממשרד החינוך, סינגפור. המחברים מודים ג&#39;ואי ים Kuok הונג להשתתפות בהפגנה של פרוטוקול זה.

1. טיפוח Biofilm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של זני חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1 לפני טיפוח biofilm, להכין תרבויות חיידקי פלנקטון על ידי inoculating 2 מיליליטר של מדיום גידול מתאים מתרבות חיידקים קפואה. השתמש בינוני לוריא-מרק (10 L ז -1 NaCl, 10 גרם L -1 תמצית שמרים, ו -10 גרם L -1 tryptone) לפ הרירי aeruginosa והמוטציות פגומות PEL Δ Δ וPSL. דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס ו -200 תנאי סל&quot;ד רועדים. לדלל תרבויות הלילה לOD 600 של 0.40 באמצעות ספקטרופוטומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב התקנת תא זרימה, אשר תוארה בעבר 14, עדיף על תחנה ניידת או עגלה שניתן להביא לחדר מיקרוסקופ הדמיה תא הזרימה ללא פירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדיום גידול סטרילי ב 2 L או 5 בקבוקי ליטר לכל תא זרימה. השתמש בינוני מינימאלי M9 (48 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 22 מ&quot;מKH 2 PO 4, 19 מ&quot;מ NH 4 Cl, 9 מ&quot;מ NaCl, 2 מ&quot;מ MgSO 4, ו -0.1 מ&quot;מ CaCl 2) בתוספת גלוקוז 0.04% (WT / כרך) ושל 0.2% (WT / כרך) casamino חומצות) לפ aeruginosa לזרום biofilms תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microspheres ניאון Aliquot לתוך צינורות microcentrifuge ספין למטה בסטרילי H 2 O למשך 5 דקות בצנטריפוגות ב9,391.2 ז. הסר supernatant וגלול במדיום 1 מיליליטר צמיחה להסיר נתרן אזיד (חיטוי) לפני הוספה למדיום גידול ב2 L או 5 בקבוקים בינוניים L. הערה: בגדלים שונים של microspheres לבוא בריכוזים שונים וצריכים להיות מדולל בהתאם להוראות. לדוגמא, לפזר 120 μl של 1.0 מיקרומטר microspheres קוטר, 15 μl של 0.5 מיקרומטר microspheres קוטר 0.96 וμl של 0.2 מיקרומטר microspheres קוטר לתוך 2 ליטר של מדיום גידול לתת 2.18 × 10 6 מיליליטר microspheres -1 לכל גודל חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף בקבוק בינוני עד upstלקדד של תא זרימה ולאפשר צמיחה בינונית לזרום דרך כל התקנה. לעצור זרימה ולהזריק תרבויות לילה בדילול לתאי תא זרימה. לאפשר לחיידקים לצרף לתשתית coverslip עבור שעה 1 לפני שימשיך זרימה של מדיום גידול בקצב זרימה של כ 5.5 x 10 -3 שניות מ &#39;-1, או סל&quot;ד 8 עם משאבת peristaltic. הערה: Biofilms גדלים בדרך כלל בטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס) במשך 3-7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להגדרת תרבות סטטי, לדלל תרבויות לילה בצינורות microcentrifuge 100 לקפל על ידי הוספת 10 μl של תרבות הלילה עד 1 מיליליטר מדיום גידול עם חלקיקים. להגדיל את ריכוז החלקיקים במדיום הגידול לתרבות סטטית של כ 500-פי השוואה לזה המשמש לזרימה biofilms (למשל לשטוף וresuspend 600 μl של 1.0 מיקרומטר תחומי קוטר 10 מיליליטר של מדיום גידול) כbiofilms תא זרימה כל הזמן מתחדש עם חלקיקים אבל תרבויות סטטי הם לא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2001; l של תרבות הלילה מדוללת עם חלקיקים לתאי של 8 מגלשות גם. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בתנאים סטטיים. Biofilms גדלים בדרך כלל ליום 1. החלף בינוני צמיחה מותשת יומי עם מדיום גידול טרי עם חלקיקים אם biofilm הוא גדל ליותר מיום 1. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3 ו -5, לכבות את הזרימה ממשאבת peristaltic ולהביא התקנת תא זרימה לחדר מיקרוסקופי. צינורות מהדק בסמוך לכניסה והיציאה של תאי תא זרימה כדי למנוע סחף (סיבת שגיאה שיטתית על ידי שינויים בסביבה) מזרימה. מניחים את תא הזרימה על הבמה מיקרוסקופ של מיקרוסקופ זקוף. הערה: השתמש במיקרוסקופ הפוכה להדמיה של microwells. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם 40X אובייקטיבי שמן לקחת קטעי וידאו של תנועת microsphere המשובץ בbiofilm במקומות שונים (microcolonies ושכבות מובחנים שטוחות) ובימים שונים (יום 3 ו -5) לחקירות של זמן ומרחב. קח קטעי וידאו קצרים עם קצב פריימים גבוה יותר כדי לחקור את האירועים המתרחשים בתוך קשקשי זמן קצרים (למשל 1.5-3 סרטוני דקות בקצב פריימים של 25-50 פריימים לשניה לדינמיקה מהירה), וקטעי וידאו ארוכים יותר עם ​​קצב פריימים נמוך כדי לחקור את האירועים לאורך זמן ארוך יותר קשקשים (קטעי וידאו 15-30 דקות למשל במסגרת שיעור של 2.5-5 מסגרות / שנייה לדינמיקה איטית יותר). הערה: וידאו בדרך כלל מכיל 5-10 חלקיקים, והוא בדרך כלל מ1.0-2.5 GB בגודל קובץ. microcolonies הגדול יותר עשוי להחזיק יותר חלקיקים. קח 5-10 קטעי וידאו לכל קטגוריה (למשל 5-10 קטעי וידאו של microcolonies שונה ומקומות שונים בשכבות מובחנים שטוחות). יש biofilm ארכיטקטורה הטרוגניות שעשויות להיות מורכבת של microcolonies, ערוצים, חללים ושכבות מובחנים שטוחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הסרטונים בפורמט מתאים שניתן לקרוא על ידי פיג&#39;י / ImageJ (למשל czi, TIF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו קטעי וידאו ללהיסחף על ידי הגלילה בvid המוגמראיו והתבוננות שהחלקיקים לא זזים באותו הכיוון בו-זמנית. הסחף יכול להיגרם על ידי תנועת z שלבים, זרמים בתא הזרימה, חוסר איזון של שולחן נגד רעידות, לחץ אוויר או שינויי טמפרטורה. נסחף קטין נכון תוך שימוש בטכניקות שלאחר העיבוד בדרך כלל מסופקות עם תוכנת מיקרוסקופ. לבטל את כל קטעי וידאו שבו להיסחף לא ניתן לתקן. רשום את הפרמטרים הבאים, הנדרשים בחלקיקי מעקב ניתוח: הרזולוציה (פיקסלים / אום), מספר מסגרות, משך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תא זרימה מבמת מיקרוסקופ ולהפעיל מחדש את משאבת peristaltic להמשיך ולעבד את biofilm. </li></ol> 3. חלקיקים מעקב ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג מסלולי חלקיקים באמצעות התוספת TrackMate בתוכנת קוד פתוחה (ImageJ). הורד פיג&#39;י <a href="http://fiji.sc/Fiji">בhttp://fiji.sc/Fiji.</a> פתח את הווידאו עם פיג&#39;י ותחת תפריט התוספים, בחר מעקב וTrackMate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק או להתאים את הגדרות בהחלון הדואר מציע הגדרות כיול ראשוניות כדי להתאים את הפרמטרים וידאו כפי שנרשם בשלב 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות חלקיקים בTrackMate באמצעות ImageJ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה &#39;גלאי יומן&#39;, קוטר חלקיקי קלט וערך סף (למשל 1000). גלול בווידאו בזמן לחיצה על הכפתור &#39;התצוגה המקדימה&#39; כדי לבדוק שהחוגים הסגולים לעקוב אחרי החלקיקים בכל הווידאו. התאם את הקוטר וסף הערכים בהתאם לצורך: להגדיל את ערך הסף אם עיגולים סגולים מופיעים בחלל הריק. להפחית את ערך הסף אם לא מספיק חלקיקים מזוהים. לחץ על הכפתור הבא כדי להשלים גילוי החלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור הבא כאשר מוצג עם האפשרות להוסיף או להסיר חלקיקים שהתגלו ב&#39;thresholding הראשונית &#39;,&#39; בחר תצוגה &#39;ו&#39; בחר מסנן &#39;חלונות להמשיך ללא התאמה אם גילוי חלקיקים ראשוני היה משביע רצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה &#39;גשש LAP פשוט&#39; בoptiעל הבר של &#39;בחר שיטת גשש&#39; חלון כחלקיקים לעתים רחוקות לצאת מהפוקוס בbiofilm ולעקוב בקלות. השתמש בערכי מרחק מקסימום המקשר הציעו או נמוך ופער-סגירה, ולחץ על הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק שמעקב החלקיקים הוא משביע רצון על ידי גלילה בווידאו כדי לראות שחלקיקים על פי המסלולים שצוירו על ידי TrackMate, ושאין מסלולים לא רצויים או חסרים. דלג על צעדי סינון השונים. עבור לחלון הסופי &quot;בחר פעולה&quot;. בחירת &#39;מסלולי יצוא לקובץ XML&#39; מתפריט הנפתח ולחץ על &#39;ביצוע&#39;. בחר תיקייה כדי לשמור את המסלולים. הערה: ישנן תוכניות שונות הזמינים בתחום הציבורי לניתוח מסלולי חלקיקים ושימוש בmicrorheology. msdanalyzer וTrackArt הם דוגמאות לתוכניות ניתוח חלקיקי מעקב הפועלות בסביבת Matlab. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Matlab לייבא מסלולי חלקיקים בקבצי XML על ידי בחירה בתפריט שלקובץ Matlab&gt; נתיב הגדר ... ולהוסיף סקריפטים תיקייה זמינים עם חבילת פיג&#39;י. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את מסלולי חלקיקים עם msdanalyzer, להוריד את הקישור לקובץ zip או קובץ tar.gz at <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories</a> . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ את תיקייתmsdanalyzer 15 ושחרר אותו בתיקייה ששייכת לנתיב Matlab (למשל C: Documents and Settings &lt;שם משתמש&gt; המסמכים שלי Matlab). התחל Matlab וליזום את המנתח על ידי הקלדה: ma = msdanalyzer (2, &#39;אום&#39;, &#39;שניות&#39;) שבו אום ושניות הן יחידות הזמן והמרחב הפיזיות בווידאו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבא את מסלולי חלקיקים על ידי הקלדה: [שירים, MD] = importTrackMateTracks (, &#39;clipZ&#39; &#39;FileName.xml&#39;;, &#39;ScaleT&#39;) ma = ma.addAll (מסלולים); איפה clipZ &#39;מסיר את ממד Z לוידאו 2D, ו&#39;scaleT&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה המסלולים על שימוש בגרף: ma.plotTracks; ma.labelPlotTracks; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את MSDS של החלקיקים באמצעות: ma = ma.computeMSD; ma.msd </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה MSDS של כל חלקיק: דְמוּת ma.plotMSD </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב מסלולי חלקיקים מסרטונים אחרים של אותו categery (למשל חלקיקים המוטבעים בmicrocolonies wild-type ביום 3) על ידי חזרה 3.5.1.1 ל3.5.1.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה מרושעת הרכב או ממוצע על כל הקימורים: ma.plotMeanMSD לשנות את y- וציר x ליניארי לסולם לוגריתמים. לעתים פיגור ארוך, עקומות MSD להיות רועשות בשל סטטיסטיקה די בלוחות זמנים ארוכים יותר. עקומות MSD יכולות גם לעלות בתלילות עקב שגיאה דינמית. אזורים אלה של העקומה ניתן להסיר על ידי שימוש בכלי המברשתכדי לבחור את הסוף של העקומה ובחירה &#39;צחצוח&#39;&gt; &#39;הסר לא מוברש&#39; בתפריט כלים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד Ezyfit <a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">בhttp://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a> ולהוסיף Ezyfit לתיקייה השייכים לדרך Matlab (למשל C: Documents and Settings &lt;שם משתמש&gt; המסמכים שלי Matlab). התקן את תפריט Ezyfit על ידי הקלדה בסביבת עבודת Matlab efmenu להתקין. הפעל מחדש MATLAB עם תפריט Ezyfit בחלון הדמות. להתאים את קימורי MSD לחוק החשמל על ידי בחירה בתפריט Ezyfit &#39;הצג Fit&#39;&gt; &#39;הכוח&#39;&gt; &#39;* x ^ n&#39; היו n הוא α המעריך diffusive המוערך. הערה: msdanalyzer דורש Curve Fitting ארגז כלים ב- Matlab להתאמה של עקומות MSD. Ezyfit היא אלטרנטיבה ותוכנה חופשית שיכול לבצע עקומה הולמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסלולים ברורים הנוכחיים חלקיקים וMSDS לחשב MSDS חלקיקים החדש במקומות או זמן אחרים: בָּרוּר </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החישוב של עקומות שונות ממוצע MSD של חלקיקים במדיום (שליטה), וmicrocolonies ואזורים מובחנים של זנים שונים, להעתיק ולהדביק את העקומות לתוך גרף אחד להשוואה. נוקשות מדגם ועליית crosslinking עם ערכי MSD נמוכים יותר. יש עקומות שטוחים α נמוך ומדגם הוא גמיש יותר מאשר עיקולים תלולים יותר עם ​​α גבוה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את העקומה וללכת &quot;כלים&quot; להסתכל על סטטיסטיקת נתונים, כגון חציון וטווח. MSD של חרוז הוא פרופורציונאלי לעמידת השרץ, J (t) של החומר שבו חרוז מוטבע על פי היחס, <img alt="משוואת 1" src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" /> שבו J = ציות השרץ, קוטר d = חלקיקים, k B = T = טמפרטורה קבועה בולצמן, וt = זמן. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li>
<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+extracellular+polymeric+substances+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).</li>
<li>Chew, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Remodeling+of+Microbial+Biofilms+by+Functionally+Distinct+Exopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides.</a> mBio. 5 (4), (2014).</li>
<li>Irie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-produced+exopolysaccharide+is+a+signal+that+stimulates+biofilm+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).</li>
<li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psl+trails+guide+exploration+and+microcolony+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Nature. 497, 388-391 (2013).</li>
<li>Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+and+PQS+mediated+subpopulation+interactions+involved+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation.</a> Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+differentiation+in+co-culture+biofilms+formed+by+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).</li>
<li>Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+involved+in+matrix+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms.</a> Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).</li>
<li>Bokranz, W., Wang, X., Tschäpe, H., Römling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+cellulose+and+curli+fimbriae+by+Escherichia+coli+isolated+from+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract.</a> J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).</li>
<li>Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+methods+for+characterisation+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microchim+Acta%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical methods for characterisation of biofilms.</a> Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).</li>
<li>Waigh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrheology+of+complex+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">Microrheology of complex fluids.</a> Rep Prog Phys. 68, 685-742 (2005).</li>
<li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-Tracking+Microrheology+of+Living+Cells%3A+Principles+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications.</a> Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).</li>
<li>Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa.+and+Saccharomyces+cerevisiae.+Biofilm+in+Flow+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells.</a> J Vis Exp. , e2383(2011).</li>
<li>Tarantino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+and+IL-1+exhibit+distinct+ubiquitin+requirements+for+inducing+NEMO-IKK+supramolecular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures.</a> Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharides+serve+as+scaffold+of+biofilms+formed+by+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).</li>
<li>Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+starvation-induced+dispersion+in+Pseudomonas+putida+biofilms%3A+genetic+elements+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms.</a> Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).</li>
<li>Qin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autolysin-mediated+DNA+release+in+biofilm+formation+of+Staphylococcus+epidermidis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis.</a> Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).</li>
<li>Stoodley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+fluid+shear+and+AlCl3+on+the+material+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa.+PAO1+and+Desulfovibrio+sp.+EX265+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms.</a> Water Science & Technology. 43, 113-120 (2001).</li>
<li>Jäger-Zürn, I., Grubert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podostemaceae+depend+on+sticky+biofilms+with+respect+to+attachment+to+rocks+in+waterfalls%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls.</a> International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).</li>
<li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackArt%3A+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

Microrheology הוא כלי שימושי למדידות rheological מקומיות במערכות הטרוגניות, כגון biofilms חיידקים. זוהי טכניקה שאינה הרסנית, המאפשרת ניטור של שינויי rheological בתוך המדגם זהה ביולוגי על נקודות זמן מרובות בזמן אמת. בפרוטוקול זה, microrheology מעקב חלקיקים היה מוחל על פל ומוטציות exopolysaccharide PSL כדי לחקור כיצד הם משפיעים על הגמישות וcrosslinking היעיל של מטריצת biofilm. PSL מעדיף את ההתפתחות של biofilms אלסטי עם crosslinking היעיל גבוה, ואילו פל מעדיף viscoelastic וbiofilms ה...

רוב תאי חיידקיים יכולים להעסיק שני הפלנקטון (חיים-חינם) ומצבים-מצורף פני השטח (נייחים) של 1 צמיחה. במצב של צמיחה המצורפת המשטח, תאי חיידקים מפרישים ולשים בארגז את עצמם בכמויות גדולות של חומרים פולימריים תאיים (EPS) כדי ליצור biofilms. EPS מורכב בעיקר חלבונים, exopolysaccharide, DNA תאי וחיוני להיווצרות biofilm 2. היא משמשת כפיגום פיזי שבו חיידקים יכולים להשתמש בו כדי להבחין במרחב ובמגנים על החיידקים מהתנאים סביבתיים מזיקים ותגובות מארחות. יש מרכיבים שונים של EPS תפקידים שונים בbiofilm היווצרות 3 ושינויים בביטוי של רכיבי EPS באופן דרמטי יכול לשפץ מבני biofilm 4. רכיבי EPS יכולים גם לתפקד כמולקולות איתות 5, ומחקרים שנעשה לאחרונה הראו רכיבי EPS מסוימים אינטראקציה עם תאי חיידקים כדי להדריך את הבדל ההגירה וbiofilmerentiation 6-8. מחקר על הרווח למניה שמאוד מתקדם, המבוסס על הניתוח מורפולוגי של biofilms מיוצר על ידי מוטציות פגומות ברכיב ספציפי של EPS 9,10. בנוסף, EPS מאופיין בדרך כלל במאקרו בקנה המידה (אפיון תפזורת) 11. מורפולוגיים מנתח זאת יכול חסר פירוט כמותי ואפיון בתפזורת, אשר מחזיר ערכים ממוצע, מאבד את הפירוט שקיים בתוך ההטרוגניות של biofilm. יש עכשיו מגמה גוברת כדי להתקדם לאפיון תכונות המכונאי של EPS בזמן אמת במייקרו בקנה המידה. פרוטוקול זה מדגים כיצד microrheology חלקיקי המעקב הוא מסוגל לקבוע את השפעות spatiotemporal של רכיבי מטריצת פל וexopolysaccharides PSL על crosslinking viscoelasticity והיעיל של biofilms aeruginosa Pseudomonas 4. microrheology הפסיבי הוא RH פשוט וזולשיטת eology המספקת את התפוקה הגבוהה ביותר של דגימת microrheological המרחבי של חומר לתאריך 12,13. בmicrorheology הפסיבי, תחומי בדיקה ממוקמים במדגם והתנועה בראונית, מונעת על ידי אנרגיות תרמיים (B T k) ואחריו על ידי מיקרוסקופ וידאו. ניתן לעקוב כמה חלקיקים בו זמנית, ואת הקואורדינטות של החלקיקים תלויי הזמן לעקוב אחרי הליכה אקראית קונבנציונלית. לכן, בממוצע, החלקיקים להישאר באותה התנוחה. עם זאת, סטיית התקן של ההתקות או הממוצעת בריבוע העקירה (MSD) של החלקיקים, הוא לא אפס. מאז נוזלים צמיגים הזרימה, החלקיקים MSD בנוזל צמיג גדל באופן ליניארי ככל שזמן מתקדם. לעומת זאת, crosslinking פולימרים מצא בviscoelastic או חומרים אלסטיים לעזור להם להתנגד לזרימה, והחלקיקים להיות מוגבלים בעקירתם, שהובילו למישורים בעקומת MSD (איור 1 א). תצפית זו כדלקמן ביחס MSDαt <sעד&gt; α, שבו α הוא המעריך diffusive הקשור יחס של תרומות אלסטי וצמיג של החומר. עבור חלקיקים הנעים בנוזלים צמיגים α = 1, בחומרי viscoelastic, וב0 &lt;α &lt;1 חומרים אלסטיים α = 0. גם MSD ניתן להשתמש כדי לחשב את עמידת השרץ, המהווה את הנטייה של החומר כדי לעוות באופן קבוע על זמן ומעריך כיצד בקלות מרווחי חומר. הכימיה גודל, הצפיפות ופני שטח של החלקיקים הן קריטיות ליישום הנכון של ניסוי microrheological ונבחר ביחס למערכת למדה (במקרה זה הפולימרים של מטריצת biofilm, ראו איור 1). ראשית, החלקיקים מודד את rheology של החומר עם מבנים שהם הרבה יותר קטנים מאשר החלקיקים עצמו. אם המבנים של החומר הם בקנה מידה דומה לחלקיקים, התנועה של נקובticle הוא מוטרד על ידי הצורה והכיוון של המבנים הבודדים. עם זאת, אם המבנים המקיפים את החלקיקים קטנים בהרבה, השפעה זו קטנה וממוצע החוצה, הצגת סביבה הומוגנית לחלקיקים (איור 1). שנית, צפיפות החלקיקים צריכה להיות דומה למדיום (1.05 גר &#39;מיליליטר -1 למדיומים על בסיס מים) באופן שהשקיעה הוא נמנעה וכוחות אינרציה הם זניחים. רוב החלקיקים עם סורגי קלקר עומדים בקריטריונים לעיל. באופן אידיאלי, החלקיקים אינו אינטראקציה עם הפולימרים של מטריצת biofilm כפרשנות rheological של MSD חלקיקים תקף רק אם התנועה היא אקראית, מונע על ידי אנרגיה והתנגשות תרמית עם מבני חומר. זה יכול להיות שנצפה על ידי בדיקה אם חלקיק הבדיקה נוטה להיקשר או להקפיץ את פני השטח של biofilm מראש מבוגר. עם זאת, למרות חוסר המשיכה לbiofilm, החלקיקים חייבים להיות מסוגלים להיות משולב לתוך המטריצה.בנוסף, ההטרוגניות physiochemical של biofilm עלולה לגרום לחלקיקים שונים להיות יותר מתאימים כמו בדיקות באזורים שונים של biofilm. כך, חלקיקים בגדלים שונים וכימיה של פני השטח צריכים להיות מוחלים על biofilm. ככזה, חלקיקי MSD הוא מסוגל לספק מידע שימושי על מרכיבים שונים תורמים לrheology והפצה של biofilm. יתר על כן, השימוש בבדיקות שונות מאפשרים להפיק מידע על ההטרוגניות physiochemical המרחבי של biofilm. שיטה זו יכולה לשמש כדי לבחון את הטיפול אנטי-מיקרוביאלי השפעה על התכונות מכאניות של biofilm, או להחיל biofilms מינים המעורב לחקור כיצד התכונות מכאניות של biofilm משתנות מהקדמה של מין אחר. החלקיקים MSDS יכול להיות גם שימושי לאפיון פיזור biofilm. מחקרים כאלה יהיו מועילים בהבנה של biofilms, פוטנציאל שיפור טיפולי biofilmהנדסת nd של biofilms לפעילות מועילה.

<table><tbody><tr><td>Fluorspheres</td><td>Invitrogen</td><td>F-8821</td><td>1.0 & #956; מיקרוספירות פלואורסצנטיות אדומות (580/605) עם שינוי קרבוקסילט</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager M1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי</td></tr><tr><td>Masterflex L/S כונן דיגיטלי 07523-80</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07523-80</td><td>משאבה פריסטלטית</td></tr><tr><td>תאי זרימה תאים</td><td>האוניברסיטה הטכנית של דנמרק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלכודת בועות</td><td>האוניברסיטה הטכנית של דנמרק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות סיליקון</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>3 מ"מ קוטר חיצוני, 1&nbsp; מ"מ קוטר פנימי</td></tr><tr><td>מחברי פלסטיק פוליפרופילן שקופים&nbsp;</td><td>קול פארמר</td><td>06365-83</td><td>1/16 אינץ' (1.588 מ"מ)</td></tr><tr><td>קליפס</td><td></td><td></td> קלסר <td>כדי להדק צינורות</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thermo Scientific&trade; נונק ומסחר;</td>מזרק <td>50X24 מ"מ</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"ל</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 &nbsp; מחט G</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &nbsp; L בקבוקי אחסון/מדיה</td><td>VWR&reg;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עגלה</td><td></td><td></td><td>להחזקת מערך ביופילם</td></tr></tbody></table>

במיפוי באתרו של התכונות מכניות של biofilms ידי microrheology מעקב חלקיקים

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

תאי חיידקים מסוגלים ליצור קהילות ביופילם מחוברות לפני השטח הידועות כביופילמים על ידי עטיפת עצמם בחומרים פולימריים חוץ-תאיים (EPS). ה-EPS משמש כפיגום פיזי ומגן המאכלס את תאי החיידקים ומורכב ממגוון חומרים הכוללים חלבונים, אקסופוליסכרידים ו-DNA. הרכב ה-EPS עשוי להשתנות, אשר מעצב מחדש את התכונות המכניות של הביופילם כדי להמשיך לפתח או לתמוך במבני ביופילם חלופיים, כגון סטרימרים, כתגובה לרמזים סביבתיים. למרות זאת, ישנם מעט תיאורים כמותיים על האופן שבו רכיבי EPS תורמים לתכונות המכניות ולתפקוד של ביופילמים. ריאולוגיה, חקר זרימת החומר, רלוונטית במיוחד לביופילם מכיוון שביופילמים רבים גדלים בתנאי זרימה וחשופים כל הזמן ללחץ גזירה. הוא גם מספק מדידה ותובנה על התפשטות הביופילם על פני השטח. כאן, מיקרוריאולוגיה של מעקב אחר חלקיקים משמשת לבחינת הצמיגות ותפקידי הצלבה היעילים של רכיבי מטריצה שונים בחלקים שונים של הביופילם במהלך ההתפתחות. גישה זו מאפשרת לחוקרים למדוד תכונות מכניות של ביופילמים בקנה מידה מיקרו, מה שעשוי לספק מידע שימושי לבקרה והנדסה של ביופילמים.

מאפייני viscoelastic המקומיים של biofilm באזורים שונים של biofilm, שכלל החללים (בינוני מעל biofilm), מישורים (שכבה שטוחה של תאים שלא עברה התמיינות) וmicrocolonies (ראה תוויות באיור 2 א) נחקרו. השינויים זמניים בנכסי viscoelastic של biofilm במהלך התבגרות מימים 3 עד 5 היו גם נקבעו. MSD של החלקיקים בחללים שימש כביקורת והשוואה לMSD של חלקיקים במדיום טהור. לעומת זאת, חלקיקים שנלכדו בbiofilm רטט בעמדות קבועות וערכי MSD נעו בין אלה אופייניים לחומרי viscoelastic לג&#39;לי ...

מיקרוריאולוגיה של מעקב אחר חלקיקים חוקרת את הצמיגות של חומרים. כאן, הטכניקה משמשת לקביעת הצמיגות, תאימות הזחילה ותפקידי הצלבה יעילים של רכיבי מטריצה שונים של ביופילם חיידקי. המטריצה מורכבת מחומרים פולימריים המופרשים על ידי החיידקים ומרכיביה קובעים את מבנה הביופילם ואת התכונות המכניות.

במיפוי באתרו של התכונות מכניות של Biofilms ידי Microrheology מעקב חלקיקים

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא להראות כיצד למדוד את התכונות הלוגיות האמיתיות בתוך מיקרו-דומיינים של ביופילמים סטטיים ותאי זרימה הטרוגניים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביופילמים, כגון כיצד רכיבי מדד ספציפיים, מינים שונים או תרכובות משפיעים על הנוירו-ביולוגיה של הביופילם, ולבחון את תגובתו לכוחות פיזיים כגון גזירה. זוהי טכניקה לא-הרסנית בעלת רזולוציה מרחבית גבוהה, וניתן לבצעה באמצעות ציוד סטנדרטי למעבדות ביולוגיות.לאחר הכנת תרביות חיידקים ללילה, אספקות ומצע להקמת תא זרימה, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, העבירו מנות של מיקרוספירות פלורסצנטיות במים סטריליים למבחנות מיקרו-צנטריפוגה כדי להסיר את נתרן האזיד, סובבו את המבחנות למשך חמש דקות בסביבה סטרילית כגון מapay flow hood, הסירו את העליון (supernatant) והשתמשו ב-1 mL של מצע גידול כדי לתלות מחדש את המיקרוספירות. לאחר מכן, הוסיפו את המיקרוספירות לשאר מצעי הגידול עבור תרבית תא הזרימה. הגדירו את תרבית תא הזרימה בהתאם לפרוטוקול הכתוב עבור הגדרת תרבית סטטית לביופילמים הגדלים בתאי מיקרו-באר (micro well chambers); דללו את התרביות מהלילה בדילול של 100-פעם במבחנות מיקרו-צנטריפוגה על ידי הוספה של 10 µL מתרבית הלילה ל-1 mL של מצע גידול.מדיום המכיל מיקרוספירות. לאחר מכן, השתמשו בתרביות המדוללות למילוי תאי המיקרו-בארים והדגירו בטמפרטורה של 37 °C בתנאים סטטיים. ביומיים השלישי והחמישי, כבו את הזרימה ממשאבת הפריסטלטיקה והעבירו את מערך תא הזרימה לחדר המיקרוסקופיה.לאחר מכן, הדקו את הפיתולים ליד הכניסה והיציאה של תאי תא זרימה (flow cell) כדי למנוע סחיפה כתוצאה מהזרימה. הניחו את תא הזרימה על המשטח של מיקרוסקופ זקוף, ובעזרת עדשת שמן 40x ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הקליטו את תנועת המיקרו-ספירות המוטמעות בביופילם במיקומים שונים, כגון מושבות מיקרוסקופיות ושכבות שטוחות לא מובחנות, לצורך בדיקות זמניות ומרחביות. עבור אירועים המתרחשים בפרק זמן קצר, הקליטו סרטונים קצרים יותר בקצב פריימים מהיר יותר כדי לבחון דינמיקה מהירה. עבור אירועים ארוכים יותר, צלמו סרטונים ארוכים יותר בקצב פריימים איטי יותר.עבור דינמיקה איטית יותר, שמרו את הסרטונים בפורמט מתאים שניתן לקרוא באמצעות Fiji image J, כגון CZI או Tiff. ודאו שלא מתרחשת סחיפה (drift). עברו על סרטון שהושלם ואשרו כי החלקיקים אינם נעים בו-זמנית באותו הכיוון, אלא שהתנועה היא אקראית.הסר את תא הזרימה (flow cell) מבמה המיקרוסקופ והפעל מחדש את משאבת הפריסטלטיקה כדי להמשיך בגידול של הביופילם. כדי להוציא מסלולי מעקב אחר חלקיקים מהסרטונים שהוקלטו, פתח את Fiji וטען קובץ. בתפריט ה-plugins, בחר ב-tracking ולאחר מכן ב-trackmate. בדוק או כוון את פרמטרי הרזולוציה וקצב הפריימים בהגדרות הכיול הראשוניות כך שיתאימו לפרמטרי הסרטון. כדי לזהות חלקיקים, בחר ב-LOG detector והזן את קוטר החלקיק ואת ערך הסף.לדוגמה, 1000. בדקו את כפתור התצוגה המקדימה וגללו לאורך הסרטון כדי לוודא שהעיגולים הסגולים עוקבים אחר החלקיקים לאורך כל הסרטון. הגבירו את ערך הסף.אם העיגול הסגול מופיע בחלל הריק, הפחית את ערך הסף. אם לא זוהו מספיק חלקיקים, לחץ על כפתור ההמשך (next) כדי להשלים את זיהוי החלקיקים. אם זיהוי החלקיקים הראשוני היה משביע רצון ואין צורך להוסיף או להסיר חלקיקים, לחץ על כפתור ההמשך. בשלושת החלונות הבאים, קביעת סף ראשונית, בחירת תצוגה ובחירת מסנן, בצע את הבחירה ללא התאמה.בשלב הבא, בסרגל האפשרויות של חלון בחירת שיטת מעקב (tracker method), בחרו ב-simple LAP tracker. מכיוון שחלקיקים בביופילם נעים לעגמאות מחוץ למיקוד רק לעיתים רחוקות וניתן לעקוב אחריהם בקלות, השתמשו בערכים המוצעים או בערכים נמוכים עבור linking and gap closing max distance ולחצו על Next. ודאו שמעקב החלקיקים משביע רצון על ידי גלילה דרך הסרטון כדי לוודא שהחלקיקים עוקבים אחר הנתיבים ששורטטו על ידי TrackMate וכי אין נתיבים מיותרים או חסרים.מסננים שונים מסופקים כדי להחריג חלקיקים בהתבסס על תוצאות המעקב האישיות שלהם. אם אין בכך צורך, עברו לחלון האחרון, בחרו בפעולה (action) מהתפריט הנפתח, בחרו בייצוא מסלולים לקובץ XML (export tracks to XML file) ולחצו על ביצוע (execute). בחרו תיקייה ושמרו את המסלולים ב-matlab.הכינו את קבצי ה-XML של מסלולי החלקיקים לייבוא על ידי בחירת נתיב סט הקבצים והוספת תיקיית הסקריפטים המצורפת לחבילת Fiji לצורך ביצוע ניתוח מסלולי חלקיקים. התחילו בהורדת ה-MSD analyzer. חלצו את תיקיית ה-msd analyzer והניחו אותה בתיקייה השייכת לנתיב של MATLAB.הפעילו את MATLAB והתניעו את המנתח על ידי הקלדת הפקודה הבאה, כאשר micrometers ו-seconds הם יחידות המרחב והזמן הפיזיים בסרטון. לאחר מכן, ייבאו את מסלולי החלקיקים על ידי הקלדת הפקודה הבאה, כאשר clip Z מסירה את ממד Z. עבור סרטון וקנה מידה דו-ממדיים, T משנה את קנה המידה של היחידות בממד הזמן מפרימיימים לשניות, והוסיפו את העקבות כדי להציג את מסלולי החלקיקים.הזינו את הנתונים הבאים, חשבו את ההעתק הריבועי הממוצע או ה-MSDS של החלקיקים באמצעות הפקודות המוצגות כאן. כדי להציג את ה-MSDS של כל חלקיק, השתמשו ב-figure וב-MA dot plot msd. לאחר מכן, שלבו מסלולי חלקיקים מסרטונים אחרים מאותה קטגוריה.ייבאו את המסלולים באמצעות הפקודה import trajectory, ולאחר מכן הפיקו גרפים וחשבו msds כפי שהודגם כעת, כדי להציג את הממוצע של המכלול או את העקומות הממוצעות הכלליות. הקלידו את הפקודה הבאה. לאחר מכן, שנו את ציר Y וציר X מסקאלה לינארית לסקאלה לוגריתמית.כדי להסיר אזורים בעקומה עם זמני השהיה ארוכים או כאלו העולים בחדות עקב שגיאה דינמית, השתמשו בכלי המברשת כדי לבחור את קצה העקומה. ובתפריט הכלים, בחרו באפשרות brushing. הסירו את unbred לאחר התקנת easy FITT והפעלה מחדש של MATLAB עם תפריט easy בחלון הדמות.בהתאם לפרוטוקול הכתוב, התאימו את עקומות ה-MSD לחוק החזקה על ידי בחירה ב-show fit power A times X to the N, כאשר N הוא המעריך הדיפוזיבי המשוער alpha. לאחר מכן, כדי לחשב MSD חדש של חלקיקים במיקומים אחרים או בנקודות זמן אחרות, הקלידו clear כדי למחוק את מסלולי החלקיקים ואת ה-MSDs הנוכחיים. לאחר חישוב עקומות MSD שונות עבור החלקיקים במיקומים שונים של זני biofilm שונים ובנקודות זמן שונות, העתיקו והדביקו את העקומות לתוך גרף אחד.להשוואה, בחר את העקומה ועבור לכלים כדי לבחון את הסטטיסטיקה של הנתונים, כגון טווח החציון. ה-MSD של החלקיק פרופורציונלי לציות הזחילה (creep compliance) JFT של החומר שבו מוטמע החלקיק, בהתאם לקשר המוצג בנוסחה זו, כאשר J שווה לציות הזחילה. D שווה לקוטר החלקיק ו-KB שווה ל-boatman's.T רישית מייצגת טמפרטורה ו-t רישית מייצגת זמן. בניסויים אלה, נבחנו תכונות ויסקו-אלסטיות של אזורים שונים בביופילם של זני P arosa מסוג wild type ושל מוטציות delta PE A, כולל חללים, מישורי חיתוך ומיקרו-מושבות. ה-MSD של חלקיקים בחלל שימש כביקורת והיה דומה ל-MSD של חלקיקים במצע טהור.בניגוד לכך, חלקיקים שנלכדו בביופילם רטטו בעמדות קבועות, וערכי ה-MSD נעתקו מאלו האופייניים לחומרים ויסקו-אלסטיים ועד לג'לים אלסטיים חזקים. בביופילמים שנוצרו על ידי זן הבר (wild type) וזני delta Pele, ה-MSD של החלקיקים במיקרו-מושבות ביום השלישי היה בלתי תלוי בזמן עבור לגי של 0.1 שניות עד 10 שניות, מה שמעיד על כך שהמיקרו-מושבות היו אלסטיות. צמיגות הזחילה (creep compliances) החציונית שחושבה מ-MSDs התואמים של החלקיקים הייתה 4.3 × 10⁻² Pa⁻¹ ו-3.6 × 10⁻² Pa⁻¹, בהתאמה.ביום החמישי, תאיות הזחילה (creep compliance) של המיקרו-מושבות במאבט wild type עלו ל-2.5 times 10 to the negative one, pascals to the negative one, מה שמעיד על הפחתה בקשירה הצולבת האפקטיבית בתוך המטריצה. ביופילמים שנוצרו על ידי זן המוטנט delta P-S-L-B-C-D היו פחות מובחנים ועיכוב בהתפתחותם, עם מישורים עבים שפיתחו מיקרו-מושבות לאחר היום השלישי. מערכי ערכי ה-MSD הראו כי הביופילמים היו בעלי קשירה צולבת פחות אפקטיבית באופן משמעותי מאשר במאבטי ה-wild type וה-delta Pele. נלקחו נתונים סטטיסטיים מספיקים ממיקרו-דומיין כאשר ניתוח של סרטונים נוספים לא הוסיף מידע חדש לעקומת ה-MSD.חשוב לבצע מיקרוביולוגיה באמצעות מגוון רחב של חלקיקים השונים בכימיה של השטח ובגודלם. ניתן להוסיף ניסויים נוספים לפרוטוקול כדי לבחון את מצב הבריאות. כוחות פיזיקליים, כגון כוחות גזירה או טיפול כימי, משפיעים על רדיולוגיה של הביופילם. מיקרוביולוגיה מחלצת מידע מבני שאינו ניתן להשגה בקלות בשיטות אחרות בקנה מידה של מיקרומטרים.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד לעקוב אחר חלקיקים, לנתח את ה-msds שלהם ולהשיג מעריכי דיפוזיה של ביופילמים. אין לשכוח כי עבודה עם פתוגנים חיידקיים עלולה להיות מסוכנת. יש להעביר את כל הפסולת באוטוקלאב ולהשליכה כראוי.

in-situ-mapping-mechanical-properties-biofilms-particle-tracking

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מקור: קורץ, ד. ל. ואחרים. פלטפורמה מיקרופלואידית לחקר סגימה ביולוגית במדיה נקבובית. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לחקר יצירת ביופילם. השעיה חיידקית מוכנסת לתעלה המיקרו, ואחריה אינקובציה לאפשר התפתחות ביופילם. לאחר מכן מתחדשת הזרימה, וניטור לחץ יחד עם הדמיה משמש לזיהוי היווצרות ביופילם וחסימת נקבוביות לאורך זמן.

מכשיר מיקרופלואידי להדמיה בזמן אמת ומעקב לחץ במהלך יצירת ביופילם

מאמר זה מציג את המתודולוגיה מקורית המבוססת על actuation מרחוק של חלקיקים מגנטיים זורעים בbiofilm חיידקים וההתפתחות של פינצטה המגנטית ייעודית למדידה באתרו את התכונות מכאניות המקומיות של החומר החי המורכב שנבנה על ידי מיקרו אורגניזמים בממשקים.

הפעלה של שלט מגנטי של בדיקות מיקרומטר<em&gt; באתר</em&gt; 3D מיפוי של תכונות פיסיקליות biofilm חיידקים

microrheology מעקב חלקיק יכול להיות בשימוש למי שאינו הרסני לכמת ומרחבית מפת שינויים בתכונות מכאניות מטריצה ​​תאית במודלי גידול 3D.

מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3D באמצעות Microrheology מעקב חלקיקים

לביופילמים יש אינטראקציות מורכבות עם הסביבה הסובבת אותם. כדי לחקור באופן מקיף אינטראקציות בין ביופילם לסביבה, אנו מציגים כאן סדרה של שיטות ליצירת סביבה כימית הטרוגנית להתפתחות ביופילם, לכימות מהירות זרימה מקומית ולניתוח הובלת מסה בתוך מושבות ביופילם ובסביבתן.

שיטות לאפיון Co-הפיתוח של Biofilm ובית גידול הטרוגניות

מאמר זה מציג שיטה לגידול ממבנה biofilm עבור בחיי עיר יון משני זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה למיפוי כימי במצב רטוב, מופעל על ידי כור microfluidic, מערכת לניתוח-הממשק ואקום נוזלי. מר Shewanella oneidensis -1 עם פלורסצנטיות ירוק חלבון שימשה כמודל.

בחיי עיר אפיון Biofilms MR1 Shewanella oneidensis על ידי SALVI וסימס תוף

העדר כלים למדידת תכונות החומר, הפרמטרים tensional ויוו מונע אימות התפקידים שלהם במהלך הפיתוח. אנחנו מועסקים מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ומעקב nanoparticle לכמת תכונות מכניות על התא חלמון העובר תקין דג זברה במהלך epiboly. שיטות אלה הינם אמינים החלים נרחב הימנעות התערבויות פולשניות.

AFM ו Microrheology בתא חלמון עובר דג זברה

ביויודים מורכבים באופן מורכב מארכיטקטורות מורכבות ומתפתחות לדפוסי מרחבי מאוד תלויי קנה מידה. כאן, אנו מציגים מערכת ניסיונית (קשה ותוכנה) עבור רכישה אוטומטית של מערכות הנתונים של טומוגרפיה אופטית 3D קוהרנטית (OCT). ערכת כלים זו מאפשרת אפיון לא פולשני ורב-ממדי של הביוגנזה מורפוליולוגיה במרחב ובזמן.

אוטומטי 3D הטומוגרפיה האופטית קוהרנטית כדי להבהיר ביויובואר מורפוגנזה מעל סולמות מרחביים גדול

הפרוטוקול מציג זרימת עבודה מלאה לניסויים בננו-אינדנציה של חומרים רכים, כולל הידרוג'לים ותאים. ראשית, מפורטים הצעדים הניסיוניים לרכישת נתוני ספקטרוסקופיית כוח; לאחר מכן, הניתוח של נתונים כאלה מפורט באמצעות תוכנת Python קוד פתוח שפותחה לאחרונה, אשר ניתן להוריד בחינם מ- GitHub.

זרימת עבודה ניסיונית וניתוח נתונים עבור ננו-אינדנציה של חומר רך

מאמר זה מדגיש את יעילותה של טכניקת האלסטוגרפיה הקוהרנטית האופטית (OCE) באפיון מהיר ולא הרסני של תכונות אלסטיות של ביופילם. אנו מבהירים הליכי יישום OCE קריטיים למדידות מדויקות ומציגים את ערכי המודולוס של יאנג עבור שני ביופילמים גרעיניים.

כימות תכונות אלסטיות של ביופילמים סביבתיים באמצעות אלסטוגרפיה קוהרנטית אופטית

מאמר זה מתאר את ההליכים הבסיסיים לעריכת ניסויים מיפוי אופטי בלב Langendorff-perfused הארנב באמצעות מערכת הדמיה פנורמית, ואת שיטת כפול (מתח סידן) הדמיה.

Multiparametric מיפוי אופטי של הלב Langendorff-perfused הארנב

למד כיצד למדוד תכונות ויסקואלסטיות של ביופילמים חיידקיים באמצעות מיקרוראולוגיה מעקב חלקיקים. שיטה זו מאפשרת לחקור את תפקידי רכיבי המטריקס ותגובת הביופילם לכוחות פיזיים.

במיפוי באתרו של התכונות מכניות של Biofilms ידי Microrheology מעקב חלקיקים

גלה סרטונים נוספים