Bare Metal פרומגנטי סטנט ללכיד תא האנדותל ושייר

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לפתח סטנט מתכתי חשוף פרומגנטי המסוגל ללכוד ולשמר תאי אנדותל המסומנים בננו-חלקיקים מגנטיים. דבר זה מושג על ידי תכנון סטנט מפל nierless steel 2205 באמצעות תוכנות לתכנון בעזרת מחשב (CAD) וניתוח אלמנטים סופיים (FEA), כדי להבין כהלכה את ההתנהגות המכנית של חומר הסטנט ומבנהו במהלך כיווץ והרחבה. לאחר מכן, הסטנט המיוצר עובר כיווץ והרחבה מכנית כדי להדגים את השלמות המכנית שלו, ונלמדת השמרות של השדה המגנטי בסטנט, דבר המאשש את ההתנהגות המגנטית.

לאחר מכן, התומכים (סטנטים) מושתלים בחזירים ותאי אנדותל המסומנים בננו-חלקיקים מגנטיים מוחדרים, וזאת כדי לוודא את לכידת התאים והשימור שלהם במחזור הדם הכלילי. התוצאות מראות כי התומך הפרו-מגנטי שפותח במחקר זה מסוגל ללכוד ולשמר תאי אנדותל המסומנים מגנטית, על בסיס ניתוח היסטולוגי של כלי דם שהוצאו בניסויי in vivo. ההשלכות של טכניקה זו פתוחות לפיתוח של מכשירים קרדיווסקולריים שונים, מאחר שפרוקירציה (endothelialization) מהירה עשויה לקדם ריפוי ולשפר את התאימות עם הדם.

בדרך כלל, אנשים שאינם מורגלים בשיטה זו יתקלו בקשיים בשל מורכבותם של הליכי ה-CAD וה-FEA המעורבים בתכנון סטנטים; גם תרביות תאים עלולות להוות אתגר עבור מתחילים. בשל החשיבות של שמירה על סביבה סטרילית קפדנית, ביקשנו לשפר את התהליך של הצמדת תאים לסטנטים והעלינו את הרעיון להשתמש בכוחות מגנטיים כדי להצמיד תאים חיים לסטנטים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי הפיתוח של הסטנט והצמדת התאים קשים ללמידה בשל מורכבות התנהגות החומר במהלך הדחיסה (crimping) וההתרחבות, וכן בשל החדשנות של לכידת תאים מגנטית בסטנט.

כדי להתחיל, השתמש בתוכנת CAD כדי ליצור גליל חלול בשיטת בליטה (extruded hollow cylinder) על ידי בחירה במאפיין בסיס בליטה (extruded boss base feature) עם עובי דופן השווה לעובי תומך הסטנט. תכנן תבנית סטנט במישור שרטוט שונה המ tangents לגליל הבליטה. הגדר את רוחב התבנית השטוחה כך שיתאים להיקף הגליל החלול שנוצר.

בעזרת תכונת העטיפה (wrap), העבירו את תכנון התבנית השטוחה אל הגליל החלול. שמרו את החלק בפורמט המקורי שלו וכן בפורמט ACEs לצורך ייצוא ל-FEA. כדי לבצע ניתוח אלמנטים סופיתים, ייבאו את הגאומטריה המוצקה שנשמרה בפורמט ACEs למודול החלקים של תוכנת ה-FEA לצורך ניתוח נוסף במודלר החלקים של התוכנה. דגמו שני גלילים אנליטיים באופן קו-אקסיאלי לסטינט. לחצו פעמיים על פריט עץ המופעים (instances tree) של המודלר ההרכבה כדי להרכיב את החלקים במיקומים יחסיים עם מודול רשת של תוכנת ה-FEA.

הגדירו את האלמנט כאלמנט מסוג 20 node hexed עם אינטגרציה מופחתת. הגדירו את גודל האלמנט ובצעו רשת (mesh) לסטנט בתוך מאפייני האינטראקציה של עץ המודל. הגדירו זוגות מגע קשיחים ללא חיכוך בין הסטנט לבין שני הגלילים בהתאמה.

הקצה את התנהגות המאמץ-מעמס (stress strain) של פלדת אל חלודה 2205 ל-ELAs של מודל הסטנט. הגדר תנאי שפה כדי לכווץ תחילה את הגליל החיצוני למידה של 1 מילימטר, דבר המדמה את תהליך הכיווץ. הסר את הגליל החיצוני כדי לדמות את הרפיה של הסטנט המכווץ.

הרחב את הגליל הפנימי לשלושה מילימטרים כדי לסמל התפשטות, ובסוף הסר את הגליל הפנימי כדי לסמל את נסיגתו של הסטנט. עם השלמת הסימולציה, פתח את קובץ התוצאות ובצע עיבוד לאחר (post process) לתוצאות כדי לבחון את המאמצים הראשיים ולשפר את תכנון הסטנט באופן איטרטיבי, במטרה להגיע למאמץ ראשי של 20%, שהוא נמוך מגבול הכשל של החומר.

לאחר השגת צינורות הפלדה שאינה חלודה 2205 וחיתוך התומכים (stents) בהתאם לפרוטוקול הכתוב תחת מapay, תוך שימוש בציוד מגן מתאים, בצעו הדרת חומצה (acid pickling) לתומך לצורך פסיבציה של פני השטח של התומכים שעברו פוליש אלקטרומגנטי, על ידי טבילתם ב-50% hydrochloric acid למשך 10 דקות, ולאחר מכן ב-10% sodium bicarbonate למשך 10 דקות נוספות להשלמת הדרת החומצה. השתמשו באתנול ולאחר מכן במים דה-יוניים לשטיפת התומכים. לאחר מכן, כדי לבחון את התומכים לצורך כיווץ (crimping), החזיקו תומך ובלון תלת-קיפול.

בעזרת כלי הריסקו (crimping tool) ידני, לחץ על הידית כדי לעוות את הסטנט שריסוקו על הבלון. לאחר בדיקת הסטנט המרוסק תחת המיקרוסקופ כדי לוודא ריסוק אחיד והיעדר סימני כשל, הרחב את הסטנט לקוטר התכנוני של שלושה מילימטרים באמצעות שימוש במים להגברת הלחץ בבלון התלת-קיפול. בחן את הסטנטים המורחבים לאיתור שברים מיקרוסקופיים והרחבה אחידה באמצעות מגנט נאודימיום חזק.

מגנטו את התומכים (stents) באופן קוטרי על ידי החזקת התומך על אחד מהפנים השטוחים כאשר הקוטר שלו נמצא לאורך קווי השדה המגנטי. לחלופין, מגנטו את התומכים באופן צירי על ידי החזקת התומך לצד הפני השטוח הצילינדרי כאשר הציר שלו נמצא לאורך קווי השדה המגנטי. החזיקו את התומך קרוב למגנט החזק למשך כדקה אחת.

עבור המגנטיזציה, הרכיבו את התומכים (stents) באופן פרטני על גבי גלילי זכוכית (glass mandrels) ולאחר מכן הרכיבו את גלילי הזכוכית בתוך המקבע המדויק של מתקן הבדיקה המגנטית. באמצעות שלבי ה-X, Y, Z של הרכבת מתקן הבדיקה המגנטית, מנחו במדויק את גשש המיקרו-סנסור המגנטי בקרבת התומך מבלי לגעת במשטח. מדדו את קריאת הבסיס של המיקרו-סנסור המגנטי במרחק רב מהתומך, ולאחר מכן השתמשו בשלבי ה-x, y, Z כדי למקם את הגשש ולמדוד את השדה המגנטי השיורי על פני השטח של התומך.

לאחר הפקת תאי צמיחה אנדותליאליים (EOCs) מדם היקפי של חזיר כפי שמתואר בפרוטוקול תרבית הטקסט, תרב את התאים בבאלחום T 75 עד להגעה למצב של כ-80% התמסכות (confluent). לאחר סינתז של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל סופר-פרמגנטיים (pyon), הוסף pyon ל-EOCs במצע תרבית תאים בריכוז של 200 µg/mL. דגיר בטמפרטורה של 37 °C למשך 16 שעות.

שאבו בעדינות את מצע תרבית התאים והוסיפו 10 מיליליטר של PBS לבקרה. לאחר מכן, נערו בעדינות ושאבו. הוסיפו חמישה מיקרוגרם למיליליטר של צבע פלואורסצנטי כגון CM DAI ל-10 מיליליטר של מצע תרבית כדי לצבוע את התאים לפי הוראות היצרן, והדגירה ב-37 degrees Celsius למשך 30 דקות.

השתמש ב-PBS כדי לשטוף בעדינות את התאים כפי שנעשה קודם לכן, ולאחר מכן הוסף תמיסת 0.25% trypsin EDTA והדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות כדי לנתק את התאים מהבקrecipient.

השתמש ב-PBS כדי לתלות מחדש את התאים בריכוז של מיליון עד 2 מיליון תאים למיליליטר. עבור מחקרי תאים in vitro, תכנן ובנה מתקן פשוט להחזקת התומך (stent) מעט מעל פניו של כיסוי זכוכית. השתמש במנחלק (demagnetizer) אלקטרומגנטי כדי לבטל את המגנטיות של תומך, או בעזרת מגנט נאודימיום חזק, הגנט תומך באופן קוטרי או צירי. העבר באמצעות פיפט את ה-SPION הלabeled e ooc התלוים ב-PBS אל תוך הצלחת המכילה את התומכים המגנוטים צירית, מגנוטים קוטרית או תומכי הביקורת שאינם מגנוטים.

לאחר מכן, באמצעות תמונה של מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך, את התמיכות עם EOC תלוים ב-PBS להעברת השתלה של התמיכות לאחר מתן תרופות נוגדות טסיות לארבעה חזירי Yorkshire בריאים והרדמה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו בטכניקת צנתור לב סטנדרטית כדי להשתיל תמיכה אחת מגנטית ותמיכה אחת לא מגנטית בעורק הכלילי הימני או RCA. לאחר שימוש בתיל מנחה להעברת הבלון והתמיכה באמצעות בלון מסוג over the wire, חסמו את זרימת הדם בתוך ה-RCA פרוקסימלית לתמיכות המושתלות. לאחר מכן, לאורך תקופה של שתי דקות, העבירו כ-2 מיליון תאי EOC אוטולוגיים המסומנים ב-s scions התלוים בארבעה מיליליטרים של PBS דרך הצנתר המרכזי; לאחר שתי דקות נוספות של חסימה, השביחו את זרימת הדם ל-RCA, הוציאו את התמיכה ובצעו היסטולוגיה. בהתאם לפרוטוקול הכתוב כפי שמוצג כאן, תכנון חוזר של התמיכה המבוסס על FEA הצביע על תמיכה שיכולה להתכווץ ולהתרחב עם מאמץ עיקרי של 20%, שהוא נמוך מהמאמץ הסופי של 30%.

סטנט חתוך בלייזר ומלוטש אלקטרונית, שהצמד (crimped) על קטטר בלון תריפל והורחב לשלושה מילימטרים באמצעות בלון תריפל, לא הראה סימנים לשבירה. תמונות של הסטנט המעוות הראו התאמה טובה לעיוות שחושב ב-FEA, וכן תמונות מיקרוסקופיה לא הראו שברים, כפי שצפוי ממדידות השדה המגנטי שנשמר. SPY על תאים מסומנים נמשכו באופן מועדף למקטעי Ben בסטנטים בעלי מגנטיזציה צירית, ונמשכו באופן אחיד יותר למקטעים ישרים.

בסטנטים בעלי מגנטיזציה דיאמטרית, תמונות היסטולוגיות הראו צביעת ברזל סביב תומכי הסטנט, מה שאישר את המשיכה והשימור של EOC לסטנט במהלך תקופת השתלה של שבעה ימים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להבין את מושגי ה-FEA וה-CAD עם פרמטרי קלט שגויים. דבר זה יוביל לתכנון שגוי של הסטנט, שיהיה קשיח מדי או בעל נטייה לשבר של הסטנט.

בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקות עייפות מואצות ובדיקות רעילות, על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון מהי העמידות לטווח ארוך והביו-תאימות של הסטנטים? לאחר מספר שנות פיתוח, יש לנו כעת טכנולוגיה פונקציונלית שתוקפה במודל חזירים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לפתח תומך (stent) פרומגנטי ולבחון לכידה ושימור של תאים עורקיים ותיוג מגנטי.