מוצקים שומנים חלקיקים (SLNs) אפליקציות לתאיות מיקוד

המטרה הכוללת של הליך זה היא לסנתז אוכלוסיות קטנות במיוחד של ננו-חלקיקים תואמים ביולוגית, לאפיין את תכונותיהם הפיזיקליות ולחקור אינטראקציות בין תאי חלקיקים. זה מושג על ידי שימוש ראשון בשיטת טמפרטורת היפוך פאזה כדי לסנתז את ננו-חלקיקי השומנים. במהלך תהליך זה, השומנים ופעילי השטח נמסים בתחילה במקביל.

לאחר הוספת כמות מסוימת של מים, מחממים את התערובת עד שמתרחשת הפרדת פאזה. לאחר מכן מערבבים את התערובת ברציפות עד ליצירת תחליב ננו והשלמת הסינתזה של ננו-חלקיקי שומן מוצקים או sln. לאחר מכן, פיזור אור דינמי או DLS משמש למדידת גודל החלקיקים ופיזור הפולי.

קלורימטריית סריקה דיפרנציאלית או DSC היא טכניקה נוספת המשמשת לקביעת נקודת ההיתוך והחום הסמוי של ההיתוך על מנת לאפיין עוד יותר את החלקיקים, בסופו של דבר ניתן להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי וציטומטריית זרימה כדי לחקור את האינטראקציות בין תאי החלקיקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות באנרגיה גבוהה כגון מיקרופלואיד אולטרה סוניקציה והומוגניזציה בלחץ גבוה, הוא שמדובר בטכניקת סינתזה עדינה יחסית, שהיא גם פשוטה וגם ניתנת להרחבה. כדי לסנתז את ה-LNS יש לשלב 0.6 מיליגרם של צבע פלואורסצנטי או תרכובת ליפופילית אחרת ו-0.10 גרם של אלקן או ליפיד ליניארי.

בליבת בקבוקון של 15 מיליליטר ממיסים את הרכיבים ב-90 מעלות צלזיוס ומערבבים מוסיפים 0.11 גרם של חומר פעילי שטח ליניארי לא יוני. לאחר מכן מלכו את התערובת המתקבלת בחום של 90 מעלות צלזיוס וערבבו. לאחר מכן, הוסף 1.79 גרם מים סטריליים לתערובת חום ל 90 מעלות צלזיוס ופקח חזותית על התמיסה עד שנצפו שני שלבים.

כעת מערבבים את התערובת עד שנוצרת תחליב ננו שקוף. הכן תחליב ננו נפרד במקביל מבלי להוסיף את הצבע הפלואורסצנטי על מנת לשמש כדגימת בקרה. יש לעקר עוד יותר כל תחליב ננו באמצעות מסנן סטרילי של 0.2 מיקרון.

השתמש ב-DLS כדי למדוד את גודל החלקיקים ופיזור הפולי של ה-S lns באמצעות זכוכית בתכנון מכשיר למדידת גודל החלקיקים לפני מדידת הדגימות, יש למדוד את גודל החלקיקים של שני תקנים ידועים בהתאם לפרוטוקול היצרן להכנה ומדידה של התקנים. לאחר מכן, מדוד את הדגימות כפי שהוכנו לכל אחת מהן. השתמש בזמן ריצה של 100 שניות, מקדם השבירה של המים וצמיגות המים ב -20 מעלות צלזיוס.

דווח על קוטר החלקיקים הממוצע ופיזור הפולי של התפלגות גודל החלקיקים כדי לחקור את ההתנהגות התרמית של ה-S lns באמצעות פיפטה ראשונה של DSC את ה-S LNS לתוך מחבת אלומיניום של 40 מיקרוליטר עם מסה של כ-25 מיליגרם. אטום הרמטית את המחבת באמצעות מכבש לחיצה אוניברסלי כדי למזער את אובדן הלחות במהלך סריקת ה-DSC. לפני מדידת כל תחליב ננו מחמש עד 80 מעלות צלזיוס, דווח על נקודת ההיתוך והחום הסמוי של ההיתוך מחלקת DSC שבה העמק מייצג את נקודת ההיתוך ואת האינטגרל של השטח שמתחת לעקומה.

בתרשים DSC, חלקי כמות החומר מייצג את החום הסמוי של תרבות ההיתוך. פיברובלסטים אנושיים ראשוניים על פי הוראות היצרן במדיום נוזלי לתרבית פיברובלסטים עוריים אנושיים. בתוספת ערכת תוסף הגדילה הנמוכה בסרום, שמור על התאים באווירה לחה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ותת-תרבית עם הגעה למפגש של 80% הן עבור תאי זרע MTT והן עבור תאי זרע לניתוח הדמיה.

בצלחת 96 באר בצפיפות של 20, 000 תאים לבאר. אפשר לתאים להתייצב ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני החשיפה ל-SLN בזמן אפס דילול s SLMs בתווך שלם כדי להשיג את ריכוז השומנים הרצוי ולהוסיף 10 מיקרוליטר לבאר לכל באר שכפול בצלחת 96 הבארות לאחר 24 שעות של דגירה עם S lns, לקבוע את הכדאיות התאית באמצעות בדיקת MTT על פי פרוטוקול היצרן. שוטפים את התאים פעם אחת ומוסיפים 100 מיקרוליטר מדיום טרי לכל אחד.

ובכן, הרגו את בארות הבקרה על ידי דגירה בתמיסת מתנול של 70% למשך 10 דקות לפני החלפתם במדיום טרי. הוסף את מגיב ה-MTT ב-10 מיקרוליטר לבאר לכל באר של המיקרו-צלחת ודגר למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס לאחר דגירה של לילה, המיס צורה תוך תאית וגבישים עם 100 מיקרוליטר מתמיסת הניקוי המסופקת. על פי פרוטוקול היצרן, יש לדגור את התאים בתמיסת חומר הניקוי למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר לפני קבלת ערכי ספיגה.

שימוש בקורא מיקרו-פלטות להכנה למיקרוסקופיה. שוטפים את הפיברובלסטים פעמיים במי מלח תפוחים פוספט סטרילי. תקן את התאים למשך 10 דקות עם קר, 70% מתנול בנקודות זמן ספציפיות לאחר מינון של פיברובלסטים עם lns.

לאחר 10 דקות, החלף את המתנול בתמיסת מלח פוספט או PBS לפני צילום תמונות באמצעות מיקרוסקופ הפוך. ה-S SLN שסונתז הביא לבקרה S LNS עם קוטר חלקיקים ממוצע של 18.59 ועם פיזור פולי של 5.83 ו-SLMs טעונים באדום נילוס עם קוטר חלקיקים ממוצע של 16.87 ננומטר ועם פיזור פולי של 4.47 באמצעות בדיקת MTT. השפעת תגובת המינון על חילוף החומרים התאי נמדדה כאשר הגדלת ריכוז החלקיקים הביאה לירידה בכדאיות התאים.

לא נצפה הבדל ברעילות בין תאים שנחשפו ל-SLN בלבד לעומת תאים טעונים באדום הנילוס. SLN. במקביל נבדקו תאים ויזואלית להיצמדות לתרבית הרקמה. פוליסטירן ותמונות צולמו כדי להדגים הן את המורפולוגיה התאית המייצגת והן את ספיגת החלקיקים הפלואורסצנטיים לאורך זמן, תוך שימוש במינון השווה לחמישה מיקרוגרם למיליליטר.

ספיגת חלקיקי השומנים נצפתה שעתיים לאחר החשיפה. רמת שילוב הננו-חלקיקים נקבעה על ידי מדידת עוצמת הקרינה האדומה של הנילוס בתאים דנדריטיים שמקורם במח עצם עכבר, או B MDCs באמצעות ציטומטריית זרימה. נצפה מתאם ישיר בין ריכוז ה-SNS בשימוש לבין כמות הקרינה המוערכת ב-B MDCs.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסנתז אוכלוסיות קטנות במיוחד של ננו-חלקיקים תואמים ביולוגית, לאפיין את התכונות הפיזיקליות שלהם ולחקור אינטראקציות בין תאי חלקיקים.