Name: שיטות לעכב קטריאלי Pyomelanin ייצור וקבעו את הגידול המקביל ברגישות לסטרס חמצונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: חקור את השפעת NTBC על ייצור פיומלנין בחיידקים ועל רגישותם לסטרס חמצוני. השיטה מדגימה כיצד עיכוב הפיגמנט מגביר את הרגישות לחמצן ומסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לדארה פרנק וקארי הארווד על תרומתם הנדיבה של הזנים. קרן המחקר של אוניברסיטת ויסקונסין מילווקי מחזיקה בפטנט מס' 8,354,451; עם טענות המכוונות באופן נרחב לטיפול או עיכוב התקדמות זיהום של מיקרואורגניזם בחולה על ידי מתן תרכובת מעכבת 4-הידרוקסיפנילפירובאט דיאוקסיגנאז כגון 2-[2-ניטרו-4-(טריפלואורומתיל)בנזויל]-1,3-ציקלוהקסנדיון (NTBC). הממציאים הם גרהם מורן ופאנג הה. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R00-GM083147). ספריית המוטאנטים של אוניברסיטת וושינגטון P. aeruginosa transposon נתמכת על ידי NIH P30 DK089507.

<ol><li>Rodriguez-Rojas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+hmgA++of+Pseudomonas+aeruginosa++to+pyomelanin+hyperproduction%2C+stress+resistance+and+increased+persistence+in+chronic+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection.</a> Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).</li>
<li>Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+cenocepacia++Produces+a+Pigment+with+Antioxidant+Properties+Using+a+Homogentisate+Intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate.</a> J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).</li>
<li>Schmaler-Ripcke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Pyomelanin%2C+a+Second+Type+of+Melanin%2C+via+the+Tyrosine+Degradation+Pathway+in+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).</li>
<li>Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+Function+of+Pyomelanin%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers+In+Tech%22%5BJournal%5D)">Properties and Function of Pyomelanin.</a> Biopolymers In Tech. Elnashar, M. , 449-472 (2010).</li>
<li>Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+chemicals+to+melanins+re-examined%3A+adsorption+of+some+drugs+to+the+surface+of+melanin+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles.</a> Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).</li>
<li>Barza, M., Baum, J., Kane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+antibiotic+activity+in+vitro+by+synthetic+melanin%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin.</a> Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Melanin+on+Microbial+Virulence+and+Clinical+Resistance+to+Antimicrobial+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).</li>
<li>Arias-Barrau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Homogentisate+Pathway%3A+a+Central+Catabolic+Pathway+Involved+in+the+Degradation+of+L-Phenylalanine%2C+L-Tyrosine%2C+and+3-Hydroxyphenylacetate+in+Pseudomonas+putida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida.</a> J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).</li>
<li>Ernst, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+mosaicism+is+conserved+but+not+unique+in+Pseudomonas+aeruginosa++from+the+airways+of+young+children+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis.</a> Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).</li>
<li>Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+tyrosine+degradation+in+Vibrio+cholerae++The+strain+ATCC+14035+as+a+prokaryotic+melanogenic+model+of+homogentisate-releasing+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+B+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell.</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).</li>
<li>Hunter, R. C., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Putative+ABC+Transporter%2C+HatABCDE%2C+Is+among+Molecular+Determinants+of+Pyomelanin+Production+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).</li>
<li>Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NTBC+treatment+of+the+pyomelanogenic+Pseudomonas+aeruginosa++isolate+PA1111+inhibits+pigment+production+and+increases+sensitivity+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress.</a> Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).</li>
<li>Kavana, M., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+%284-Hydroxyphenyl%29pyruvate+Dioxygenase+with+the+Specific+Inhibitor+2-%5B2-Nitro-4-%28trifluoromethyl%29benzoyl%5D-1%2C3-cyclohexanedione%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione.</a> Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).</li>
<li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+minimum+inhibitory+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Determination of minimum inhibitory concentrations.</a> J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).</li>
<li>Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+melanin-overproducing+transposon+mutants+of+Pseudomonas+putida+F6%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6.</a> FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Roy-Burman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+protein+secretion+is+associated+with+death+in+lower+respiratory+and+systemic+Pseudomonas+aeruginosa+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections.</a> J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).</li>
<li>Jacobs, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).</li>
<li>Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanogenesis+in+dermatophyte+species+in+vitro++during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection.</a> Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).</li>
<li>Khajo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+Melanized+Cryptococcus+neoformans+Lethal+Dose+Gamma+Irradiation+Involves+Changes+in+Melanin%27s+Chemical+Structure+and+Paramagnetism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism.</a> PLoS ONE. 6, e25092(2011).</li>
<li>Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from:
	 
 <a target="_blank" href="http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm">http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm</a> (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

שיטת הטיטרציה של NTBC המתוארת בפרוטוקול זה תאפשר למשתמש לקבוע אם NTBC יכול להפחית או לחסל את ייצור הפיומלנין בחיידקים, ולקבוע את ריכוז ה-NTBC הנדרש. השלב הקריטי ביותר בבדיקת הטיטרציה של NTBC הוא קביעת טווח ריכוזי ה-NTBC לשימוש בבדיקה. לזנים שונים של P. aeruginosa יש רגישויות שונות ל-NTBC, וזני מעבדה עשויים להיות רגישים יותר ל-NTBC מאשר מבודדים קליניים12 (איור 2). לכן, יש צורך לבדוק טווח של ריכוזי NTBC עבור כל זן הנבדק. רצוי להתחיל בריכוזים נמוכים יותר ולהגדיל לריכוזים גבוהים יותר לפי ...

Pseudomonas aeruginosa הוא חיידק גרם שלילי המייצר מגוון פיגמנטים כולל פיומלנין, פיגמנט אדום-חום המסייע בהגנה מפני עקה חמצונית1-4 וקושר מגוון תרכובות, כולל אנטיביוטיקה אמינוגליקוזיד5-7. ייצור פיומלנין נגרם על ידי פגם במסלול הקטבוליזם של טירוזין4,8, בין אם באמצעות מחיקות או מוטציות של הגן המקודד הומוגניזאט 1,2-דיאוקסיגנאז (HmgA)1,9 או באמצעות חוסר איזון באנזימים השונים במסלול10. הומוגניזט מצטבר עקב השבתת ה-HmgA, והוא מופרש ומתחמצן ליצירת פיומלנין11. ניתן לבטל או להפחית את ייצור הפיומלנין באופן תלוי מינון באמצעות טיפול בקוטל העשבים 2-[2-ניטרו-4-(טריפלואורומתיל)בנזויל]-1,3-ציקלוהקסנדיון (NTBC)12, המעכב 4-הידרוקסיפנילפירובאט דיאוקסיגנאז (Hpd) במסלול הקטבוליזם של טירוזין13. Hpd נדרש להיווצרות הומוגניזציה, ולכן פיומלנין11. 
אנו מתארים בפירוט שלוש טכניקות שהיו חשובות במחקרינו על טיפול NTBC בזנים המייצרים פיומלנין של P. aeruginosa. טכניקות אלה כוללות טיטרציה של NTBC כדי לקבוע את הריכוזים שיבטלו או יפחיתו את ייצור הפיומלנין בזנים המייצרים פיומלנין במעבדה וקלינית, קביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של אנטיביוטיקה כאשר חיידקים מטופלים ב-NTBC, והרגישות הנובעת מכך לעקה חמצונית עם טיפול ב-NTBC.
בדיקת הטיטרציה שפיתחנו משרתת שתי מטרות. ראשית, הבדיקה תאפשר למשתמש לקבוע אם NTBC יכול לבטל או להפחית את ייצור הפיומלנין בחיידק הנחקר ובאילו ריכוזים. זה יאפשר למשתמש לקבוע רגישות ל-NTBC, מכיוון שזנים שונים של חיידקים עשויים להיות בעלי רגישויות שונות לתרכובת זו, כפי שנצפה ב-P. aeruginosa12. שנית, בדיקת הטיטרציה של NTBC תאפשר למשתמש לקבוע את הריכוז המתאים של NTBC לשימוש במבחנים הבאים, כגון אנטיביוטיקה MIC ומבחני תגובת עקה חמצונית, אם המטרה היא לבטל או להפחית את ייצור הפיומלנין ולקבוע את ההשפעות של הפחתת פיגמנט. 
בדיקת הטיטרציה פועלת מכיוון שניתן לראות הבדל גלוי בייצור פיומלנין בזנים שטופלו ב-NTBC וההבדלים בייצור פיומלנין תלויים במינון12. בנוסף, ניתן ליישם טכניקה זו לחקר תרכובות אחרות שעשויות לחסל או לשפר את ייצור הפיגמנט בחיידקים.
MICs אנטיביוטיים משמשים לקביעת רגישות החיידקים לאנטיביוטיקה. ישנן מספר שיטות לקביעת MICs, כולל צלחות דילול אגר ודילול מרק14. ניתן לבצע דילול מרק במבחנות קטנות או בצלחת מיקרוטיטר של 96 בארות. שיטת לוחית המיקרוטיטר לקביעת MIC המתוארת כאן תאפשר למשתמש לבדוק מגוון רחב של אנטיביוטיקה תוך שימוש במינימום משאבים. הבדיקה מספקת יכולת שחזור כמו גם גמישות במספר האנטיביוטיקה והזנים שנבדקו בשיטה זו. בנוסף, עם שילוב NTBC בבדיקה, המשתמש יכול לקבוע אם חיסול או הפחתה של ייצור פיומלנין משנה את הרגישות לאנטיביוטיקה בחיידקים המייצרים פיומלנין.
ניתן לבחון את תגובת החיידקים לעקה חמצונית במספר דרכים. השיטות הנפוצות ביותר המתוארות הן ספירות ברות קיימא של חיידקים הנתונים ללחץ חמצוני למשך תקופה מסוימת1, או מבחני דיפוזיה של דיסק מתח חמצוני15. שיטות אלו נוטות להשתמש בריכוזים גבוהים של גורמי לחץ חמצוני כדי לבחון את ההשפעות של עקה חמצונית בחיידקים והתוצאות יכולות להיות משתנות למדי בין שכפולים ביולוגיים. בדיקת הספירה הקיימא נוטה גם להשתמש ביותר לוחות אגר מאשר השיטות האחרות. בדיקת לוחית הספוט שאנו מתארים משתמשת בריכוזים נמוכים של H2O2 ומאפשרת למשתמש לבדוק את תגובת העקה החמצונית של זנים מרובים באמצעות מינימום צלחות. הבדיקה ניתנת לשחזור באופן עקבי בין שכפולים טכניים וביולוגיים. מכיוון שפיומלנין מעורב בעמידות בפני מתח חמצוני, שילוב NTBC בבדיקה מאפשר למשתמש לקבוע את ההשפעות של חיסול ייצור פיומלנין על עמידות לעקה חמצונית.

<table><tbody><tr><td>2-[2-ניטרו-4-(טריפלואורומתיל)בנזויל]-1,3-ציקלוהקסנדיון (NTBC)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SML0269-50 מ"ג</td><td>נקרא גם ניטיסינון.&nbsp; מסיס ב-DMSO.</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td>30 wt. % in H2O.&nbsp; התייצב.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gold Bio</td><td>G-400-100</td><td>מסיס ב-H2O.&nbsp; מסננים לעקר.</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>מסיס ב-H2O.&nbsp; מסננים לעקר.</td></tr><tr><td>Tobramycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>מסיס ב-H2O.&nbsp; מסננים לעקר.</td></tr></tbody></table>

שיטות לעכב קטריאלי pyomelanin ייצור וקבעו את הגידול המקביל ברגישות לסטרס חמצונים

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

פיומלנין הוא פיגמנט חוץ-תאי אדום-חום המיוצר על ידי מספר מינים של חיידקים ופטריות. פיגמנט זה נגזר ממסלול הקטבוליזם של טירוזין ותורם לעמידות מוגברת לעקה חמצונית. ייצור פיומלנין ב-Pseudomonas aeruginosa מופחת באופן תלוי מינון באמצעות טיפול ב-2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). אנו מתארים שיטת טיטרציה המשתמשת בריכוזים מרובים של NTBC כדי לקבוע את ריכוז התרופה שתפחית או תבטל את ייצור הפיומלנין בחיידקים. לשיטת הטיטרציה יש תוצאה הניתנת לכימות בקלות, הפחתה ניכרת בייצור הפיגמנט עם עלייה בריכוזי התרופות. אנו מתארים גם שיטת צלחת מיקרוטיטר לבדיקת ריכוז מעכב מינימלי של אנטיביוטיקה (MIC) בחיידקים. שיטה זו משתמשת במינימום משאבים וניתן להרחיב אותה בקלות כדי לבדוק מספר אנטיביוטיקות בצלחת מיקרוטיטר אחת עבור זן אחד של חיידקים. ניתן להתאים את בדיקת ה-MIC לבדיקת ההשפעות של תרכובות שאינן אנטיביוטיות על צמיחת חיידקים בריכוזים ספציפיים. לבסוף, אנו מתארים שיטה לבדיקת רגישות חיידקים לעקה חמצונית על ידי שילוב H2O2 בצלחות אגר ואיתור דילולים מרובים של חיידקים על הצלחות. רגישות לעקה חמצונית מסומנת על ידי הפחתה במספר המושבה וגודלה עבור הדילולים השונים בצלחות המכילות H2O2 בהשוואה לביקורת ללא H2O2. בדיקת לוחית המתח החמצוני משתמשת במינימום משאבים ובריכוזים נמוכים של H2O2. חשוב לציין, יש לו גם יכולת שחזור טובה. ניתן להתאים את בדיקת לוחית הספוט הזו לבדיקת רגישות חיידקים לתרכובות שונות על ידי שילוב התרכובות בצלחות אגר ואפיון גידול החיידקים שנוצר.

titrations טיפול עם NTBC Titrations הטיפול עם NTBC שימש כדי לקבוע אם הטיפול עם NTBC היה מסוגל להפחית את ייצור pyomelanin בפ aeruginosa, וגם לזהות את הריכוז בטיפול עם NTBC שמבטל או מקטין pyomelanin ייצור לשימוש במבחנים נוספים. ייתכנו שינויים ברמות של pyomelanin מיוצר בחזרות שונות, אבל מגמות כלליות יישארו קבועות. Assay טיטרציה הטיפול עם NTBC גם יכול להיות שונה כדי לבדוק את תרכובות אחרות שעשוי להשפיע על ייצ...

ייצור פיומלנין חיידקי מביא לעמידות מוגברת לעקה חמצונית ולאלימות. אנו מדווחים על טכניקות שניתן להשתמש בהן כדי לקבוע עיכוב של ייצור פיומלנין ולבדוק את העלייה ברגישות כתוצאה מכך לעקה חמצונית בחיידקים, כמו גם לקבוע ריכוז מעכב מינימלי של אנטיביוטיקה (MIC).

שיטות לעכב קטריאלי Pyomelanin ייצור וקבעו את הגידול המקביל ברגישות לסטרס חמצונים

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

המטרות הכלליות של הניסויים הבאים הן לקבוע את השפעות ה-NTBC על ייצור P mein ועל הרגישות לעקה חמצונית, וכן את הריכוזים העיכובים המינימליים (MICs) של אנטיביוטיקה. דבר זה מושג על ידי הוספת NTBC לתרביות חיידקים כדי לקבוע, בשלב שני, את הריכוז המפחית את ייצור ה-p melanin. תרביות חיידקים מטופלות ב-NTBC ובאנטיביוטיקה, מה שיאפשר למשתמש לקבוע אם לטיפול ב-NTBC יש השפעה על ה-M mics של האנטיביוטיקה.תרביות מטופלות ב-NTPC נחשפו למימן פרוקסיד על מנת לקבוע רגישות לעקה חמצונית, כאשר תוצאות הטיפול ב-NTPC מראות כי טיפול בחיידקים גנוג'ניים ב-NTPC מוביל להפחתה בייצור פיגמנט ולהגברת הרגישות לעקה חמצונית, בעוד שאין לו השפעה על ה-MIC של האנטיביוטיקה, בהתבסס על פלטות נקודות לתגובת עקה חמצונית ובדיגות MIC במיקרוטיטר, בהתאמה. היתרון המרכזי של טכניקת פלטות הנקודות לעקה חמצונית על פני שיטות קיימות, כגון ספירת תאים חיים ובדיגות דיפוזיה של דיסקיות, הוא שניתן להשתמש בריכוזים נמוכים יותר של מימן פרוקסיד במקום בריכוזים הגבוהים המשמשים בבדיגות אחרות. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את שיטתנו לקביעת MIC של אנטיביוטיקה יתקשו בכך, כיוון שחוסר דיוק בטכניקת הפ pipetteת יוצר שונות בין חזרות.שונות זו עלולה להקשות על קביעה מדויקת של ה-MIC לאנטיביוטיקה. יום אחד לפני ביצוע בדיקת ה-MIC, הכין תרביות של הזנים לבדיקה ב-LB עם ובלי.2,4,6-טרי-ניטרו-1,3-בנזיל-ציקלוהקסאן-דיון, או NTBC. הדגמה זו משתמשת בריכוז מייצג של 300 µM של NTBC. שיטת התיחור לקביעת הריכוז המתאים של NTBC מתוארת בטקסט של הפרוטוקול; יש להדגיר את התרביות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם אוורור, וביום למחרת.הכינו תמיסות מאסטר של LB פלוס NTBC ו-LB פלוס DMSO עבור בדיקת ה-MIC, כדי לבחון אנטיביוטיקה אחת עבור זן אחד; הוסיפו 600 micromolar של NTBC לשני מיליליטר של LB וערבבו. להכנת תמיסת המאסטר של NTBC: ה-NTBC מתווסף בריכוז של 600 micromolar מכיוון שהוא ידולל פי שניים כאשר יתווסף התוסף (inoculum).כדי להגיע לריכוז סופי של 300 micromolar, הוסיפו נפח שווה של ה-DMSO המשמש כנושא לשני מיליליטר של LB וערבבו ליצירת תמיסת המאסטר NO NTBC. שתי תמיסות מאסטר אלו ישמשו להכנת תמיסות מלאי של אנטיביוטיקה, כמו גם להקמת סדרת הדילוציות בלוחות 96 בארות. לאחר מכן, הכינו את תמיסות האנטיביוטיקה בתוך תמיסות המאסטר של LB פלוס NTBC או LB פלוס DMSO.הכינו תמיסת אם של Gentamycin עם או ללא NTBC בריכוז של 64 micrograms per milliliter. הכינו תמיסת אם של KANAMYCIN עם או ללא NTBC בריכוז של 256 micrograms per milliliter. הכינו תמיסת אם של tobramycin עם או ללא NTB בריכוז של eight micrograms per milliliter.לאחר הכנת תמיסות האנטיביוטיקה בריכוז 2x, העבירו 100 µL מכל תמיסת אנטיביוטיקה לארבעה בארות בפלטת 96 בארות בשורה A. לדוגמה, יש להוסיף gentamycin לבארות 1 עד 4, kanamycin לבארות 5 עד 8, ו-tobramycin לבארות 9 עד 12. הוסיפו 50 µL של תמיסת המאסטר LB plus NTBC או LB plus DMSO לשורות B עד H בפלטת 96 הבארות; ודאו כי פלטה אחת מכילה LB plus NTBC ופלטה אחת מכילה LB plus DMSO. באמצעות מיקרופיפטה, בצעו דילו guess-סדרתיים פי שניים של האנטיביוטיקות על ידי העברה של 50 µL מהתמיסה משורה A לשורה B. ערבבו את התמיסה, החליפו את טיפי הפיפטה והעבירו 50 µL מהתמיסה משורה B לשורה C. חזרו על הפעולה עבור שאר השורות לאחר דילול שורה G. הסירו 50 µL מהתמיסה מאותה שורה והשליכו אותם.השתמשו בשורה H כביקורת ללא אנטיביוטיקה עבור גדילה חיידקית. שלפו את התרביות שגדלו למשך הלילה לאחר שטיפת כל התרביות כדי להסיר la-nin הנמצא במצע. מדדו את ה-OD 600 של התרביות. דללו את תרביות הלילה ב-lb, באמצעות מיקרופיפט רב-ערוצי.הוסיפו 50 מיקרוליטר של תרבית החיידקים המדוללת לבארים המתאימות. הוסיפו חיידקים לשלוש בארות עבור כל זן וריכוז אנטיביוטיקה. הוסיפו 50 מיקרוליטר של LB לבאר הרביעית כדי שתשמש כביקורת לזיהום חיידקי.כסו את פלטות ה-96 באריות בפילם (perfil) והדגירו למשך כ-24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למחרת. בחנו את הפלטות באופן ויזואלי כדי לזהות צמיחה בקטריאלית בבאריות. ה-MIC הוא הריכוז הנמוך ביותר של האנטיביוטיקה שבו לא נצפתה צמיחה בקטריאלית בכל שלושת החזרות של כל זן.כדי להתחיל בהליך זה, הגדירו תרביות לילה של הזנים לבדיקה ב-LB עם ובלי NTBC כפי שהודגם בעבר ליום למחרת. הכינו APLs של LB המכילים מי חמצן כגורם למעקה חמצוני. ראשית, המסו את בקבוקי האגרו של ה-LB קררו את המצע לטמפרטורה של כ-50 מעלות צלזיוס בטמפרטורת החדר.בשלב הבא, הוסיפו מי חמצן ישירות למצע המקורר בריכוזים הרצויים. סובבו את הבקבוק כדי לערבב טווח של ריכוזי מי חמצן מאפס עד אחד. מילימולרי הוא נקודת התחלה טובה.יש למזוג את המצעים לצלחות באופן מיידי ולהלהיב את פני השטח כדי להסיר בועות. התפוקה היא ארבע צלחות ל-100 milliliters של lb agar. סמנו את הצלחות עם ריכוז ה-hydrogen peroxide.הניחו את הצלחות ללא כיסוי במכסה זרימה ביולוגית כאשר המאוורר פועל למשך 30 דקות כדי להסיר לחות עודפת מהצלחות. יש להשתמש בצלחות באותו היום. בזמן שהצלחות מתייבשות, יש לשטוף ולמדוד.יש לנרמל את ה-OD 600 של תרביות הלילה לערך ה-OD 600 הנמוך ביותר מבין קבוצת הזנים הנבדקים. לשם כך, קבע את נפח התרבית הדרוש כדי לדלל אותה ל-OD 600 הנמוך ביותר בנפח כולל של מיליליטר אחד. לדוגמה, אם לתרבית יש OD 600 של 3 וה-OD 600 הנמוך ביותר עבור קבוצת הזנים הוא 2.5, בצע את החישוב הבא, אשר יניב 0.833 מיליליטרים כנפח התרבית הדרוש; העבר 0.833 מיליליטרים של תרבית לפסולת מיקרו-צנטריפוגה (microfuge tube).בשלב הבא, חשבו את הכמות של LB בתוספת NTBC או LB בתוספת DMSO הדרושה כדי להביא את נפח התרבית למילליטר אחד. בדוגמה זו, הכמות תהיה 0.167 מיליליטר. ערבבו באמצעות וורטקס כדי לשמור על תרביות בריכוז קבוע של NTBC או DMSO. בצעו דילול סדרתי של פי עשרה לתרביות הלילה המנורמליות ב-PBS בתוספת NTBC או PBS בתוספת DMSO. הכינו תמיסות מלאי של PBS בתוספת NTBC ו-PBS בתוספת DMSO, תוך הגדלה או הקטנה של הכמויות בהתאם למספר הזנים הנבדקים. עבור סט אחד של דילולים עבור זן אחד, ערבבו 300 מיקרומולר של NTBC או נפח שווה של DMSO עם PBS, לנפח כולל של 720 מיקרוליטר. הוסיפו 90 מיקרוליטר של PBS בתוספת NTBC או PBS בתוספת DMSO לפרוטות המיקרוצנטריפוגה המתאימות המסומנות עבור דילול סדרתי מ-10⁻¹ ועד 10⁻⁷.הוסיפו 10 µL של תרבית למבחנת הדילול 10⁻¹ המתאימה, ערבבו באמצעות וורטקס (vortex), והעבירו 10 µL מדילול ה-10⁻¹ למבחנת הדילול 10⁻². החליפו טיפים של פיפטה בין כל דילול וחזרו על הפעולה עד לסיום כל הדילולים. טפטפו 5 µL מדילול 10⁻³ ועד 10⁻⁷ על מצעי LV עם מי חמצן (hydrogen peroxide) בשניחלוף.עבור כל זן, השתמשו בקצה פפיתה אחד. אם הנקודות נזרעות מהדילול הגבוה ביותר לנמוך ביותר, אין להטות את הפלטה עד שהנוזל יתייבש לתוכה. דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 עד 48 שעות, בהתאם לזן.לאחר הופעת מושבות בגודל מתאים, צלם את הפלטות באמצעות מצלמת CCD מעל טרנסילומינטור (transluminator). טיטראציות של NTBC שימשו כדי לקבוע אם NTBC מסוגל להפחית את ייצור ה-p melanin ב-p aerogen, וכדי לזהות את ריכוז ה-NTBC המבטל או מפחית את ייצור ה-p melanin לצורך שימוש במבחנים נוספים, כפי שמוצג כאן. NTBC הפחית את ייצור ה-PY melanin באופן תלוי מינון ביצרני p melanin, אך לא השפיע על ייצור הפיגמנט בזנים שאינם מייצרים p melanin.טבלה זו מציגה תוצאות של בדיקת MIC עבור זנים שונים של p aerogen שטופלו עם ובלי NTBC ואנטיביוטיקות שונות; ה-MICs תועדו כריכוז הנמוך ביותר של האנטיביוטיקה אשר עיכב את הצמיחה החיידקית. לטיפול ב-NDBC לא הייתה השפעה על ה-MICs של האנטיביוטיקה עבור הזנים שנבחנו. בדיקת spot plate לתגובת עקה חמצונית בוצעה על זני PIO מייצרי מלנין ולא מייצרי מלנין שטופלו עם ובלי NDBC.הלוח עם ריכוז של אפס מילימולר של מימן פראוקסיד הראה כי כל הזנים דוללו כראוי, ונצפתה רגישות מוגברת לעקה חמצונית כאשר חיידקים המייצרים מלנין מסוג PIO טופלו ב-NTBC; זנים שאינם מייצרים מלנין מסוג PIO היו רגישים יותר לעקה חמצונית מאשר זנים המייצרים מלנין מסוג p. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן לקבוע את השפעות הטיפול ב-NTBC על ייצור מלנין מסוג PIO, באמצעות בדיקת רגישות לעקה חמצונית וערכי MIC לאנטיביוטיקה.

methods-to-inhibit-bacterial-pyomelanin-production-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Cheng, C., et al. השבתת פתוגנים באמצעות פוטוליזה באור נראה של ריבופלבין-5'-פוספט. J. Vis. Exp. (2022).בסרטון זה, תערובת תגובה חוצצת המכילה L-מתיונין, טטרזוליום כחול ניטרו (NBT) ופלבין מונונוקלאוטיד (FMN) מוקרנת באור סגול כדי לגרום לייצור מיני חמצן תגובתיים (ROS). זה מוביל להשבתת חיידקים ולהיווצרות פורמזאן הניתן לזיהוי ספקטרומטרי.

כימות של השבתה חיידקית הנגרמת על ידי אור באמצעות יצירת מיני חמצן תגובתיים

סרטון זה מדגים בדיקת לוחית נקודתית המותאמת להערכת תגובות העקה החמצונית של זני חיידקים. זנים מסוימים מייצרים פיומלנין, פיגמנט נוגד חמצון. לעומת זאת, זנים המטופלים בחומר בדיקה, המוביל לייצור מופחת של פיומלנין, מפגינים רגישות מוגברת לעקה חמצונית, וכתוצאה מכך כדאיות התא פוחתת בהשוואה לזנים מייצרי פיומלנין.

בדיקת צלחת נקודתית להערכת תגובות עקה חמצונית בזני חיידקים

סרטון זה מדגים שיטה מבוססת צלחת מיקרוטיטר לקביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של אנטיביוטיקה לבדיקה נגד חיידקים. עם הוספת תרחיף של הפתוגן החיידקי Pseudomonas aeruginosa לצלחת מיקרוטיטר המכילה דילולים סדרתיים של אנטיביוטיקה לבדיקה, ומעכב ייצור פיומלנין על ידי החיידקים, נמדדת הצפיפות האופטית של הבארות כדי לחשב את הריכוז המעכב המינימלי של האנטיביוטיקה, ואת ההשפעה של מעכב ייצור פיומלנין על הרגישות לאנטיביוטיקה של החיידקים.

שיטת צלחת מיקרוטיטר להערכת הריכוז המעכב המינימלי של אנטיביוטיקה

כתב יד זה מתאר את השימוש fluorogenic מקודד גנטית כתבים ביישום של הדמיה לחיות תאים עבור הבחינה של xenobiotic-induced סטרס חמצוני. זו גישה נסיונית מציע רזולוציית ייתכן ללא תחרות, רגישות וספציפיות תוך הימנעות רבים את חסרונותיה של שיטות קונבנציונליות המשמש את הגילוי של רעילות סטרס חמצוני.

הדמיה גישות הערכות של רעילות לחץ חימצוני באמצעות חיישנים Fluorogenic מקודד גנטית

המטרה של פרוטוקול זה היא לפקח spectrophotometrically טרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תחבורה ניצול אלקטרון חוץ-תאית acceptors לנתח אנזימטי אינטראקציות העלולות להתעורר עם אלה acceptors אלקטרון חוץ-תאית.

מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי C2C12 Myotubes

אנו מתארים שלוש שיטות להערכת הפעילות היפופיגמנטציה של כימיקלים במבחנה: כימות של פעילות tyrosinase 1) סלולר ותוכן 2) מלנין, או 3) מידה של מלנין מאת צביעת תאי המלנין וניתוח התמונה.

כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

פרוטוקול זה מתאר את ההערכה של מצב החמצון הייחודי של תא משנה בתוך התא. בדיקה פלואורסצנטית תלויית-חמצון רגישה מאפשרת ניתוח טימטרי נוח בתאים שלמים.

הערכה של חמצון הסלולר באמצעות מערכת משנית ספציפי לחמצון-רגיש ירוק פלורסנט ירוקה

אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח ושימוש במודל סטרס חמצוני על ידי טיפול בתאי אפיתל פיגמנט רשתית עם H2O2, ניתוח מורפולוגיה של תאים, כדאיות, צפיפות, גלוטתיון, ורמת UCP-2. זהו מודל שימושי לחקור את ההשפעה נוגדת החמצון של חלבונים המופרשים על ידי תאים transposon-transfected לטיפול ניוון neuroretinal.

אינדוקציה וניתוח של עקה חמצונית ב היפהפייה הנרדמת טרנספוסון-transposon-transfected תאי אפיתל פיגמנט רשתית אנושית

פרוטוקול זה מספק ניתוחים איכותיים וכמותיים של סך כל הסידרופורים, פיוברדין ופיוצ'לין מ - Pseudomonas aeruginosa.

ניתוח איכותני וכמותי של ייצור סידרופור מ Pseudomonas aeruginosa

פרוטוקול סטנדרטי להשראת הזדקנות מוקדמת ב-HNM באמצעות tBHP, פרוטוקולים סטנדרטיים לניתוח סמנים מרכזיים של הזדקנות, כולל עצירת גדילה, פעילות SA-β-גלקטוזידאז וגורמי SASP.

פרוטוקול סטנדרטי להשראת הזדקנות מוקדמת הנגרמת מלחץ במלנוציטים ראשוניים בבני אדם באמצעות טרט-בוטיל הידרופרוקסיד

חקור את השפעת NTBC על ייצור פיומלנין בחיידקים ועל רגישותם לסטרס חמצוני. השיטה מדגימה כיצד עיכוב הפיגמנט מגביר את הרגישות לחמצן ומסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפול.

שיטות לעכב קטריאלי Pyomelanin ייצור וקבעו את הגידול המקביל ברגישות לסטרס חמצונים

גלה סרטונים נוספים