שיטות לעכב קטריאלי Pyomelanin ייצור וקבעו את הגידול המקביל ברגישות לסטרס חמצונים

המטרות הכלליות של הניסויים הבאים הן לקבוע את השפעות ה-NTBC על ייצור P mein ועל הרגישות לעקה חמצונית, וכן את הריכוזים העיכובים המינימליים (MICs) של אנטיביוטיקה. דבר זה מושג על ידי הוספת NTBC לתרביות חיידקים כדי לקבוע, בשלב שני, את הריכוז המפחית את ייצור ה-p melanin. תרביות חיידקים מטופלות ב-NTBC ובאנטיביוטיקה, מה שיאפשר למשתמש לקבוע אם לטיפול ב-NTBC יש השפעה על ה-M mics של האנטיביוטיקה.

תרביות מטופלות ב-NTPC נחשפו למימן פרוקסיד על מנת לקבוע רגישות לעקה חמצונית, כאשר תוצאות הטיפול ב-NTPC מראות כי טיפול בחיידקים גנוג'ניים ב-NTPC מוביל להפחתה בייצור פיגמנט ולהגברת הרגישות לעקה חמצונית, בעוד שאין לו השפעה על ה-MIC של האנטיביוטיקה, בהתבסס על פלטות נקודות לתגובת עקה חמצונית ובדיגות MIC במיקרוטיטר, בהתאמה. היתרון המרכזי של טכניקת פלטות הנקודות לעקה חמצונית על פני שיטות קיימות, כגון ספירת תאים חיים ובדיגות דיפוזיה של דיסקיות, הוא שניתן להשתמש בריכוזים נמוכים יותר של מימן פרוקסיד במקום בריכוזים הגבוהים המשמשים בבדיגות אחרות. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את שיטתנו לקביעת MIC של אנטיביוטיקה יתקשו בכך, כיוון שחוסר דיוק בטכניקת הפ pipetteת יוצר שונות בין חזרות.

שונות זו עלולה להקשות על קביעה מדויקת של ה-MIC לאנטיביוטיקה. יום אחד לפני ביצוע בדיקת ה-MIC, הכין תרביות של הזנים לבדיקה ב-LB עם ובלי.

2,4,6-טרי-ניטרו-1,3-בנזיל-ציקלוהקסאן-דיון, או NTBC. הדגמה זו משתמשת בריכוז מייצג של 300 µM של NTBC. שיטת התיחור לקביעת הריכוז המתאים של NTBC מתוארת בטקסט של הפרוטוקול; יש להדגיר את התרביות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם אוורור, וביום למחרת.

הכינו תמיסות מאסטר של LB פלוס NTBC ו-LB פלוס DMSO עבור בדיקת ה-MIC, כדי לבחון אנטיביוטיקה אחת עבור זן אחד; הוסיפו 600 micromolar של NTBC לשני מיליליטר של LB וערבבו. להכנת תמיסת המאסטר של NTBC: ה-NTBC מתווסף בריכוז של 600 micromolar מכיוון שהוא ידולל פי שניים כאשר יתווסף התוסף (inoculum).

כדי להגיע לריכוז סופי של 300 micromolar, הוסיפו נפח שווה של ה-DMSO המשמש כנושא לשני מיליליטר של LB וערבבו ליצירת תמיסת המאסטר NO NTBC. שתי תמיסות מאסטר אלו ישמשו להכנת תמיסות מלאי של אנטיביוטיקה, כמו גם להקמת סדרת הדילוציות בלוחות 96 בארות. לאחר מכן, הכינו את תמיסות האנטיביוטיקה בתוך תמיסות המאסטר של LB פלוס NTBC או LB פלוס DMSO.

הכינו תמיסת אם של Gentamycin עם או ללא NTBC בריכוז של 64 micrograms per milliliter. הכינו תמיסת אם של KANAMYCIN עם או ללא NTBC בריכוז של 256 micrograms per milliliter. הכינו תמיסת אם של tobramycin עם או ללא NTB בריכוז של eight micrograms per milliliter.

לאחר הכנת תמיסות האנטיביוטיקה בריכוז 2x, העבירו 100 µL מכל תמיסת אנטיביוטיקה לארבעה בארות בפלטת 96 בארות בשורה A. לדוגמה, יש להוסיף gentamycin לבארות 1 עד 4, kanamycin לבארות 5 עד 8, ו-tobramycin לבארות 9 עד 12. הוסיפו 50 µL של תמיסת המאסטר LB plus NTBC או LB plus DMSO לשורות B עד H בפלטת 96 הבארות; ודאו כי פלטה אחת מכילה LB plus NTBC ופלטה אחת מכילה LB plus DMSO. באמצעות מיקרופיפטה, בצעו דילו guess-סדרתיים פי שניים של האנטיביוטיקות על ידי העברה של 50 µL מהתמיסה משורה A לשורה B. ערבבו את התמיסה, החליפו את טיפי הפיפטה והעבירו 50 µL מהתמיסה משורה B לשורה C. חזרו על הפעולה עבור שאר השורות לאחר דילול שורה G. הסירו 50 µL מהתמיסה מאותה שורה והשליכו אותם.

השתמשו בשורה H כביקורת ללא אנטיביוטיקה עבור גדילה חיידקית. שלפו את התרביות שגדלו למשך הלילה לאחר שטיפת כל התרביות כדי להסיר la-nin הנמצא במצע. מדדו את ה-OD 600 של התרביות. דללו את תרביות הלילה ב-lb, באמצעות מיקרופיפט רב-ערוצי.

הוסיפו 50 מיקרוליטר של תרבית החיידקים המדוללת לבארים המתאימות. הוסיפו חיידקים לשלוש בארות עבור כל זן וריכוז אנטיביוטיקה. הוסיפו 50 מיקרוליטר של LB לבאר הרביעית כדי שתשמש כביקורת לזיהום חיידקי.

כסו את פלטות ה-96 באריות בפילם (perfil) והדגירו למשך כ-24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למחרת. בחנו את הפלטות באופן ויזואלי כדי לזהות צמיחה בקטריאלית בבאריות. ה-MIC הוא הריכוז הנמוך ביותר של האנטיביוטיקה שבו לא נצפתה צמיחה בקטריאלית בכל שלושת החזרות של כל זן.

כדי להתחיל בהליך זה, הגדירו תרביות לילה של הזנים לבדיקה ב-LB עם ובלי NTBC כפי שהודגם בעבר ליום למחרת. הכינו APLs של LB המכילים מי חמצן כגורם למעקה חמצוני. ראשית, המסו את בקבוקי האגרו של ה-LB קררו את המצע לטמפרטורה של כ-50 מעלות צלזיוס בטמפרטורת החדר.

בשלב הבא, הוסיפו מי חמצן ישירות למצע המקורר בריכוזים הרצויים. סובבו את הבקבוק כדי לערבב טווח של ריכוזי מי חמצן מאפס עד אחד. מילימולרי הוא נקודת התחלה טובה.

יש למזוג את המצעים לצלחות באופן מיידי ולהלהיב את פני השטח כדי להסיר בועות. התפוקה היא ארבע צלחות ל-100 milliliters של lb agar. סמנו את הצלחות עם ריכוז ה-hydrogen peroxide.

הניחו את הצלחות ללא כיסוי במכסה זרימה ביולוגית כאשר המאוורר פועל למשך 30 דקות כדי להסיר לחות עודפת מהצלחות. יש להשתמש בצלחות באותו היום. בזמן שהצלחות מתייבשות, יש לשטוף ולמדוד.

יש לנרמל את ה-OD 600 של תרביות הלילה לערך ה-OD 600 הנמוך ביותר מבין קבוצת הזנים הנבדקים. לשם כך, קבע את נפח התרבית הדרוש כדי לדלל אותה ל-OD 600 הנמוך ביותר בנפח כולל של מיליליטר אחד. לדוגמה, אם לתרבית יש OD 600 של 3 וה-OD 600 הנמוך ביותר עבור קבוצת הזנים הוא 2.5, בצע את החישוב הבא, אשר יניב 0.833 מיליליטרים כנפח התרבית הדרוש; העבר 0.833 מיליליטרים של תרבית לפסולת מיקרו-צנטריפוגה (microfuge tube).

בשלב הבא, חשבו את הכמות של LB בתוספת NTBC או LB בתוספת DMSO הדרושה כדי להביא את נפח התרבית למילליטר אחד. בדוגמה זו, הכמות תהיה 0.167 מיליליטר. ערבבו באמצעות וורטקס כדי לשמור על תרביות בריכוז קבוע של NTBC או DMSO. בצעו דילול סדרתי של פי עשרה לתרביות הלילה המנורמליות ב-PBS בתוספת NTBC או PBS בתוספת DMSO. הכינו תמיסות מלאי של PBS בתוספת NTBC ו-PBS בתוספת DMSO, תוך הגדלה או הקטנה של הכמויות בהתאם למספר הזנים הנבדקים. עבור סט אחד של דילולים עבור זן אחד, ערבבו 300 מיקרומולר של NTBC או נפח שווה של DMSO עם PBS, לנפח כולל של 720 מיקרוליטר. הוסיפו 90 מיקרוליטר של PBS בתוספת NTBC או PBS בתוספת DMSO לפרוטות המיקרוצנטריפוגה המתאימות המסומנות עבור דילול סדרתי מ-10⁻¹ ועד 10⁻⁷.

הוסיפו 10 µL של תרבית למבחנת הדילול 10⁻¹ המתאימה, ערבבו באמצעות וורטקס (vortex), והעבירו 10 µL מדילול ה-10⁻¹ למבחנת הדילול 10⁻². החליפו טיפים של פיפטה בין כל דילול וחזרו על הפעולה עד לסיום כל הדילולים. טפטפו 5 µL מדילול 10⁻³ ועד 10⁻⁷ על מצעי LV עם מי חמצן (hydrogen peroxide) בשניחלוף.

עבור כל זן, השתמשו בקצה פפיתה אחד. אם הנקודות נזרעות מהדילול הגבוה ביותר לנמוך ביותר, אין להטות את הפלטה עד שהנוזל יתייבש לתוכה. דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 עד 48 שעות, בהתאם לזן.

לאחר הופעת מושבות בגודל מתאים, צלם את הפלטות באמצעות מצלמת CCD מעל טרנסילומינטור (transluminator). טיטראציות של NTBC שימשו כדי לקבוע אם NTBC מסוגל להפחית את ייצור ה-p melanin ב-p aerogen, וכדי לזהות את ריכוז ה-NTBC המבטל או מפחית את ייצור ה-p melanin לצורך שימוש במבחנים נוספים, כפי שמוצג כאן. NTBC הפחית את ייצור ה-PY melanin באופן תלוי מינון ביצרני p melanin, אך לא השפיע על ייצור הפיגמנט בזנים שאינם מייצרים p melanin.

טבלה זו מציגה תוצאות של בדיקת MIC עבור זנים שונים של p aerogen שטופלו עם ובלי NTBC ואנטיביוטיקות שונות; ה-MICs תועדו כריכוז הנמוך ביותר של האנטיביוטיקה אשר עיכב את הצמיחה החיידקית. לטיפול ב-NDBC לא הייתה השפעה על ה-MICs של האנטיביוטיקה עבור הזנים שנבחנו. בדיקת spot plate לתגובת עקה חמצונית בוצעה על זני PIO מייצרי מלנין ולא מייצרי מלנין שטופלו עם ובלי NDBC.

הלוח עם ריכוז של אפס מילימולר של מימן פראוקסיד הראה כי כל הזנים דוללו כראוי, ונצפתה רגישות מוגברת לעקה חמצונית כאשר חיידקים המייצרים מלנין מסוג PIO טופלו ב-NTBC; זנים שאינם מייצרים מלנין מסוג PIO היו רגישים יותר לעקה חמצונית מאשר זנים המייצרים מלנין מסוג p. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן לקבוע את השפעות הטיפול ב-NTBC על ייצור מלנין מסוג PIO, באמצעות בדיקת רגישות לעקה חמצונית וערכי MIC לאנטיביוטיקה.