ניתוח של Enterocolitica Yersinia מפעיל טרנסלוקציה לתאי מארח שימוש בטא לקטמאז מפעיל Fusions

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד טרנסלוקציה של חלבון אפקטור לתאי מארח באמצעות מערכת ההפרשה של ורניה סוג שלוש. זה מושג על ידי דגירה של תאי heela עם מוטציות yersinia המבטאות היתוך בטא לקטמאז אחד של אפקטור TEM כדי לאפשר טרנסלוקציה של היתוך אפקטור לתאי HELOC. כשלב שני, תאי ה-HELOC הנגועים נטענים בתרכובת מדווח סריג תאים, המעובדת על ידי אסטרו תאי לטעון ב-CCF 4 פלואורסצנטי ובכך נלכדת בתוך התא.

הפיצול הבא של CCF 4 על ידי בטא-לקטמאז הממוקם בטרנס גורם לשיבוש של fre, אשר נרשם על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר על מנת לנתח את עוצמות הקרינה של התורם והמקבל. התוצאות מראות כמויות שונות של אפקטור טרנס ממוקם TEM היתוך בטא לקטמאז אחד בהתבסס על קינטיקה שונה של עליית הקרינה של התורם. אחד היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שהעיבוד הבין-תאי של תרכובת CCF 4 מספק כלי ספציפי ורגיש ביותר למדידת טרנסלוקציה.

השיטה יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפתוגנזה של חיידקים, כגון כיצד טרנסלוקציה מכווננת במהלך האינטראקציה בין חיידקים ותאים מארחים יום לפני ההדבקה. יש לחסן שלושה בקבוקונים נפרדים המכילים שלושה מיליליטר של מדיום LB ואת האנטיביוטיקה הנדרשת עם מושבה אחת מכל אחד מהזנים המותמרים של Y enterocolitica שהוכנו כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. הכינו גם צלחות המכילות תאי הילה יום לפני ההדבקה על ידי זריעת 15,000 תאים ב-200 מיקרוליטר של מדיום תרבית לתשע בארות של צלחת של 96 בארות דגרו את התאים באינקובטור של 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס ביום ההדבקה.

יש לחסן שני מיליליטר מתרבית הלילה ל-40 מיליליטר של מדיום טרי ללא אנטיביוטיקה. דגרו על החיידקים במשך 90 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בשייקר ב-180 סל"ד. זה יגרום לביטוי של מערכת ההפרשה מסוג 3 לאחר 90 דקות, יעביר את התרביות לצינור טרי וישמור את התרביות על קרח.

מנקודה זו והלאה. צנטריפוגה של התרביות למשך 10 דקות בטמפרטורה של 5,000 גרם וארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול את החיידקים. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה בשניים עד שלושה מיליליטר של PBS קר כקרח, דללו את תרחיף החיידקים לריכוז של 800 מיליון יחידות יוצרות מושבה למיליליטר, ולאחר מכן הניחו את התרביות על קרח.

לאחר מכן קבע את הצפיפות האופטית המתאימה של כל תרבות. הוסף 3.5 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים מכל זן לבארות שונות של ה-96 המוכן. צלחת היטב וערבב על ידי פיפטינג עדין של המדיום פעמיים, אפשר לחיידקים לשקוע על התאים במוטיה של זיהום של כ -100 חיידקים לתא.

בצע מהלך זמן על ידי התחלת זיהומים במרווחים של 30 דקות ושמירה על התאים בתא של 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר כל זיהום, 90 דקות לאחר ההדבקה הראשונה, שאפו בזהירות את המדיום מבלי להסיר אף אחד מתאי ההלה. לאחר מכן מוסיפים 50 מיקרוליטר PBS המכילים 20 מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול, ו -2.5 מילי-מולרי פרוניק.

זה יעצור את ביטוי האפקטורים ויפחית את הייצוא של CCF 4. להכנת מיקרוסקופיה, הקפידו על טבילה רציפה על ידי פיזור מדיום טבילה לתחתית הבארות, באמצעות מזרק מיליליטר אחד. הימנע מלכידת בועות אוויר במדיום הטבילה.

לאחר מכן העבירו את צלחת 96 הבארות לשלב המיקרוסקופ ואתרו נקודות מתאימות לניתוח מאוחר יותר בכל אחת מהן. ובכן, סיים שלב זה תוך 10 דקות. לאחר מכן הוסף 70 מיקרוליטר של תמיסת טעינה CF 4:00 AM לכל אחד.

ובכן דגרו את הצלחת למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאפו את תמיסת הטעינה והוסיפו 100 מיקרוליטר PBS המכילים 20 מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול, ו -2.5 מילימול פרוניק. לאחר מכן התחל במהירות במיקרוסקופיה.

הנח מטרת טבילה עם צמצם מספרי גבוה בהגדלה של פי 20 למקומה ופתח את חור הגלאי ל-2.5 יחידות אווריריות והעביר את צלחת 96 הבארות לתוך סריקת הלייזר הקונפוקלי stage. לאחר מכן, בחר גלאי פוספט גליום ארסניד ברגישות גבוהה עם ערוצי תורם ומקבל פעילים בו זמנית. ממוצע מסגרת משולש בעומק שמונה סיביות ומרגש עם 10% מלייזר דיודה של 405 ננומטר.

כדי להבטיח כימות נכון, הגדר את הגבר הגלאי של שני הערוצים לאותו ערך והימנע מפיקסלים רוויים. לאחר מכן, הפעל את האור המועבר ובדוק מחדש את שדות הראייה המייצגים בכל כוונן היטב ושמור מחדש את המיקומים לפי הצורך באמצעות אוטומטי מכוילtagה. לבסוף, הגדירו את הזמן לשתי דקות, את משך הזמן לשעתיים, והתחילו לצבור תמונות.

לאחר רכישת תמונה, ייבא את מערך הנתונים לתוכנה המאפשרת חישובים אריתמטיים של מטריצות פיקסלים. הפחיתו את הרקע בשני הערוצים באמצעות אותו היסט על ידי לחיצה ראשונה על התפריט, ולאחר מכן עברו לעיבוד תמונה ובחרו חיסור בסיסי. לאחר מכן בחר כל אחד מהערוצים והזן את ערך קו הבסיס.

תקן את הדימום דרך הערוץ התורם, תעל אחד לערוץ המקבל שתיים עם מקדם התיקון שנקבע מראש, וצור ערוץ ערוץ חדש שני ראשוני למטרה זו. לחץ על התפריט ולאחר מכן בחר עיבוד תמונה ואחריו אריתמטיקה של ערוץ והזן את הערך המוחלט של ערוץ שתיים מופחת בנקודה 33 פעמים. ערוץ ראשון לאחר מכן, מחק את ערוץ 2 וודא שהדימום דרך ערוץ המקבל המתוקן יישאר כערוץ החדש השני.

לאחר מכן צור ערוץ חדש עם הפעולה המוצגת כאן כדי לקבוע את מקדם השריג היחסי. לאחר מכן, חזור לתפריט אריתמטיקה של הערוץ והיכנס לערוץ שני מחולק בערוץ אחד פלוס ערוץ שני להדמיה נכונה של ערוץ הפריט. בתמונה של שמונה סיביות, צרו ערוץ רביעי ערוץ ארבע, השווה ל- 255 פעמים ערוץ שלוש.

שנו את צבע הערוץ באמצעות מעבר לתפריט מאפייני התמונה, בחרו ערוץ ארבע, לאחר מכן צבע ממופה, ולאחר מכן קובץ טבלת צבעים, ובחרו jet. לאחר מכן, החל מסנן חציוני של שלוש על שלושה על ערוצים שלוש וארבע. זה יפחית את הרעש בתמונות על ידי כניסה לתפריט עיבוד התמונה ובחירת החלקה.

ואחריו מסנן חציוני, בחר את שני הערוצים והחל גודל מסנן שלושה על שלושה אחד לכימות האותות הסלולריים. זהה את התאים בערוץ ארבע על ידי בחירת מעבר לתצוגה ולחיצה על הסמל. הוסף משטחים חדשים.

הגדר את הפרמטרים של אלגוריתם הזיהוי בחלון המשטח והפעל את שתי תיבות הסימון. פלח רק אזור עניין ועבד את התמונה כולה. לבסוף, לאחר מכן, הגדירו את אזור העניין על ידי עריכת הממדים שלו.

בחר ערוץ ארבע כערוץ המקור והגדר את הסף על-ידי מעבר לתפריט הסף ובחירה בחיסור ברקע. הגדר את הקוטר ל-10 מיקרומטר, את סף העוצמה המינימלי באופן ידני לאפס ואת הסף המקסימלי לעוצמה המקסימלית. סנן את המבנים לפי שטח והגדר את הערך המינימלי ל -187 מיקרומטר רבוע.

לאחר מכן סיים את זיהוי פני השטח. לבסוף, חלץ את הערכים הממוצעים עבור עוצמת הקרינה של התורם בערוץ הראשון ומקדם השריג היחסי בערוץ שלוש, יחד עם סטיות התקן שלהם בישות התאית. כדי להראות את היכולת של שיטה זו לנתח כמותית טרנסלוקציה של אפקטור לתאי מטרה, נחקרו שני זני ירסיניה עם קינטיקה שונה של טרנסלוקציה באמצעות מקדמי פלואורסצנציה של תורם ומקדמי שריג יחסיים.

התאים הנגועים מסוג הבר מראים עלייה בעוצמת הקרינה לאורך זמן. כצפוי, השיפוע המקסימלי של עוצמת הקרינה נמצא בקורלציה חיובית עם אורך ההדבקה, מה שמצביע על כך שניתן להבחין בריכוזים שונים של בטא לקטמאז מתורגם בהתאם למחקרים קודמים. תאים הנגועים במוטציה של מחיקת yersinia YOPE מציגים עלייה מהירה יותר בעוצמת הקרינה בהשוואה לזן מסוג פראי.

מעניין שהרחבת הזיהום ל-90 דקות לא האיצה עוד יותר את עליית הקרינה של התורם בהשוואה ל-60 דקות של זיהום בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי העיבוד של תרכובת CCR 4 מתחיל מיד לאחר הוספתו. לכן, חשוב להתחיל ברכישת תמונות בזמן.