טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד הפרשת חלבון מתאים בודדים ברזולוציה גבוהה בזמן ובמרחב. זה מושג על ידי ייצור ליטוגרפי של ננו-חיישני פלזמון זהב על פתקי כיסוי זכוכית להדמיה ללא תווית של הפרשות תאים בודדים. כשלב שני, שבב החיישן מנוקה ומצופה בשכבה החד-שכבתית בהרכבה עצמית ולאחר מכן מתפקד עם ליגנדים בעלי זיקה גבוהה לחלבוני האנליטים המופרשים.

תאי Next משולבים בשבבי החיישנים הפונקציונליים על מנת למדוד את הפרשותיהם במרחב ובזמן. התוצאות מראות כי ניתן למפות הפרשות חלבון מתאים בודדים הן מבחינה מרחבית והן מבחינה זמנית ללא צורך בתיוג. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התקשורת הבין-תאית, כגון כיצד מסלולי איתות פרקריניים ואוטוקריניים שולטים בתנועתיות התאים.

כדי להתחיל בהליך זה, הפקידו סרט דק כרום של 10 ננומטר על החלקות כיסוי שנוקו בעבר על ידי אידוי קרן אלקטרונים כדי למנוע השפעות מטען במהלך הדפוס וההדמיה של ננו-מבנים. לאחר סיבוב זה, השכבה הראשונה של התנגדות דו-שכבתית המורכבת מאתיל-לקטט, קופולימר מתיל-מתאקרילט ב-2000 סל"ד למשך 45 שניות. לאחר מכן אופים את המצע בחום של 150 מעלות צלזיוס לאחר שאפשרו למצע להתקרר לטמפרטורת החדר.

סובבו את השכבה השנייה של פולימתיל-מתאקרילט ב-3000 סל"ד למשך 45 שניות ואפו את המצע ב-150 מעלות צלזיוס.תבנית. השכבה הדו-שכבתית מתנגדת באמצעות ליתוגרפיה של קרן אלקטרונים או EBL. פתח אלכוהול איזופרופיל או IPA מתיל איזובוטיל קטון, או MIBK ביחס של שניים לאחד ושטוף ב-IPA.

הסר כרום מהאזור המפותח של ננו-מבנים באמצעות תחריט רטוב באמצעות תחריט CR שבע למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן שטוף במים מזוקקים דה-יונים ומזוקקים הפקידו סרט זהב טיטניום על המצע באמצעות מאייד קרן האלקטרונים לאחר שקיעת הזהב. הרם את שכבת הקופולימר הדו-שכבתית. התנגד על ידי השריית המצע באצטון למשך ארבע שעות.

לאחר מכן, בדוק את המצע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לאשר את הצורה והגודל של הננו-מבנה. הננו-מבנים המתקבלים מופרדים בדרך כלל על ידי גובה של 300 ננומטר. מערכים של 20 על 20 של ננו-מבנים מרווחים ב-30 מיקרון ממרכז למרכז.

משאיר מקום רב להדמיית תאים, שבב טיפוסי יכיל 300 מערכים. הסר את הכרום שנותר מהמצע באמצעות קצה רטוב באמצעות תחריט CR 7 למשך 60 שניות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שוטפים את המצע במים מזוקקים דה-יונים.

לאחר מכן בדוק תת-קבוצה של מערכים באמצעות מיקרוסקופ הכוח האטומי לאימות גודל ואחידות. ניתן להשתמש בהחלקת כיסוי זכוכית מעוצבת זו מספר פעמים כל עוד מקפידים על הליכי הניקוי המתאימים לניקוי וחידוש פלזמת המשטח המקומית ושבבי התהודה או LSPR. אפר פלזמה בהספק של 40 וואט ב-300 מילי, לתערובת של 5% מימן ו-95% ארגון למשך 45 שניות.

פונקציונליזציה של משטח הזהב ומבני הננו מיד לאחר אפר הפלזמה. על ידי טבילת השבב בתמיסת אתנול תיול דו-רכיבית המורכבת מיחס של שלושה לאחד של SPO ו-SPC. לאחר השארת השבב בתמיסת התיול למשך הלילה ליצירת שכבה חד-שכבתית בהרכבה עצמית, שטפו אותו באתנול וייבשו בגז חנקן העמיסו את שבב ה-LSPR בתוך מחזיק מיקרו-נוזלי בהתאמה אישית על ידי הנחת השבב על חתיכה תחתונה מאלומיניום.

לאחר מכן סנדוויץ' את השבב בין החלק התחתון הזה לאטם סיליקון וחתיכה עליונה מפלסטיק שקופה באמצעות ארבעה ברגים כדי להדק את המכלול. ליישום תיול טיפוסי מבוסס SPC, ציפוי זרוק 300 מיקרוליטר של תערובת אחד לאחד של 133 מילי-מולרי EDC ו-33 מילי-מולרי NHS במים מזוקקים דה-יונים כדי להפעיל את קבוצות הקרבוקסיל של רכיב התיול SPC. לאחר המתנה של 10 דקות, יש לשטוף ידנית את המשטח עם PBS של 10 מילי-מולאר לאחר מכן להצמיד את קבוצת הקרבוקסיל המופעלת עם הליגנד המעניין על ידי ציפוי טיפה של 300 מיקרוליטר מתמיסת הליגנד.

לאחר המתנה של שעה ושטיפת המשטח עם קוד טיפה PBS של 10 מילי-מולרי, 300 מיקרוליטר של 0.1 אתנולמין מולארי ב-PBS על השבב כדי למזער קשירה לא ספציפית. לאחר המתנה של 10 דקות יש לשטוף את האתנולמין עם PBS המכיל 0.005% בין 20 ל-PBST 20. לאחר מכן, הנח חתיכת קוורץ מעל השבב כדי להפחית את התנודות בנתונים הקשורים למניסקוס משתנה.

שמור את השבב רטוב עם מאגר PBST 20 בזמן ההרכבה על המיקרוסקופ. חבר את הצינור המיקרופלואידי למכלול ולמאגר הזרימה עד להגעה למצב יציב. לאחר מכן הנח את מכלול שבבי ה-LSPR בחוזקה לתוך מחזיק הדגימה של הבמה המחוממת.

ההגדרה האופטית לשיטה זו מוצגת כאן. האור ממנורת הלוגן מועבר דרך מסנן מעבר ארוך של 593 ננומטר כדי לחסל אורכי גל, שאינם תורמים לתגובה הננו פלזמונית. לאחר מכן האור מקוטב ליניארית והדגימה מוארת באמצעות יעד צמצם מספרי של 40 x 1.4 לעירור של ננו-מבני הזהב הפלזמוניים.

האור המפוזר נאסף על ידי המטרה ומועבר דרך מקטב חוצה כדי להפחית את אות הרקע ממצע הזכוכית. מפצל אלומה של 50 50 מוכנס לנתיב האור שנאסף לניתוח ספקטרוסקופי והדמיה בו זמנית. לאחר שאפשרת למכלול ולמיקרוסקופ להתאזן למשך שעתיים לפחות, יישר את השבב באמצעות הג'ויסטיק כך שהמערך המרכזי מיושר עם הסיב האופטי לספקטרוסקופיה.

לאחר גידול וגלולה של תאי DOMA היברידיים על ידי צנטריפוגה, קצרו אותם, ולאחר מכן בדקו את הכדאיות לפני הכנסתם לשבבי LSPR. לאחר מכן, הכנס 50 מיקרוליטר מתמיסת התא באופן ידני על שבבי LSPR בעזרת מיקרו פיפטה. לבסוף, שטפו את התאים הנותרים בתמיסה עם מדיה טרייה ללא סרום באמצעות מערכת שפע מיקרופלואידית להכנת שבבי ה-LSPR להדמיה.

שכבת-על של תמונת הדמיית LSPR, המדגישה את המערכים המרובעים ותמונה מוארת באור משודר, המדגישה את התא בפינה השמאלית התחתונה, מוצגת כאן. תא מוכתם במוט צבע ממברנה פלואורסצנטית דומין, DHPE מציג הרחבות דמויות פילופודיה. אם הרחבות כאלה היו חופפות למערכים, הן היו נותנות תוצאה חיובית כוזבת לנתוני ספקטרומטריית הפרשת חלבונים לפני ואחרי הכנסת תמיסה רוויה של נוגדנים אנטי-CMIC למערכים הפונקציונליים של CMIC מוצגת כאן.

שיטה זו משמשת על מנת לכייל את המערכים. כיול המערכים מסייע בנורמליזציה של תגובת החיישנים ובקביעת התפוסה החלקית על סמך פרופיל הפונקציונליזציה הביולוגית של כל ריצה. מכשיר SPR מסחרי משמש לקביעת קבוע הדיסוציאציה וכן לחקר ההתנגדות לקשירה לא ספציפית באמצעות אותו פרוטוקול כפי שמתואר עבור שבב LSPR.

ערכים מנורמלים משני מערכים מוצגים כאן. מערך אחד היה בטווח של 10 מיקרומטר מהתא בעוד שהביקורת הייתה במרחק של 130 מיקרומטר מהתא. העלייה הפתאומית בתגובה המנורמלת של המערך הקרוב ביותר לתא ביחס לתגובה השטוחה של מערך הבקרה מעידה על פרץ מקומי של נוגדנים מופרשים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד הפרשות חלבון מתאים בודדים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.