Name: מבחני ויראלי המוקדם כניסה לזיהוי והערכה של אנטי תרכובות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: למדו פרוטוקול להערכת אפקטים אנטי-ויראליים של תרכובות בניסויי כניסה ויראלית מוקדמת. השיטה משתמשת בתאי HUH 7.5 ובמדידות לוציפראז לזיהוי סוכנים אנטי-ויראליים חדשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מימון מבית החולים האוניברסיטאי הרפואי של טאיפיי (102TMU-TMUH-19) ומשרד המדע והטכנולוגיה של טייוואן (MOST103-2320-B-038-031-MY3).

הערה: ודא שכל ההליכים כרוכים בתרבית תאים וזיהום בנגיף מתנהלים בברדסי בטיחות ביולוגית מוסמכים המתאימים לרמת הבטיחות הביולוגית של הדגימות בטיפול. לצורך המתאר את הפרוטוקולים, HCV-מתויג כתב בלוציפראז Gaussia משמש כוירוס מודל 32. בהקשר של תוצאות הנציג, חומצת chebulagic תרכובות (CHLA) וpunicalagin (PUG) משמשים כאנטי-נגיפיים מועמד כי יעד אינטראקציות גליקופרוטאין נגיפיים עם glycosaminoglycans פני תא בכניסת ויראלי מוקדם שלבים 31. הפרין, אשר ידוע להפריע לכניסה של וירוסים רבים 30,31,33,34, משמש כטיפול שליטה חיובי בהקשר כזה. לרקע בסיסי על טכניקות וירולוגיה, התפשטות של וירוסים, קביעת כייל נגיף, וביטוי של מינון זיהומיות ביחידות פלאק ויוצרים (PFU), להתמקד יחידות יוצרים (FFU), או ריבוי של זיהום (משרד הפנים), הקורא הוא מחדשהופנה להתייחסות 35. לדוגמאות קודמות ותנאים מותאמים המשמשים לאיתור וירוסים המוצגים בתוצאות הנציג, הקורא נקרא אזכור 30-32,36-39 כמו גם פרטים המופיעים בטבלה 1, איור 1 א, ואיור 2 א. תרבות 1. תא, הכנת מתחם, וCytotoxicity מתחם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול קו התא המתאים למערכת הזיהום בנגיף להיות מנותח (טבלה 1). לHCV, לגדול הא-7.5 תאים בינוניים השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), 200 U / פניצילין G מיליליטר, 200 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תרכובות בדיקה ובקרת שימוש בממסים שלהם: למשל, לפזר CHLA ופג בsulfoxide דימתיל (DMSO); להכין הפרין במים מזוקקים כפולים סטרילי. לכל דילולים הבאים, להשתמש בתקשורת ובתרבות. הערה: concent הסופימנה של DMSO בטיפולי מתחם מבחן היא פחות מ -1% בניסויים; DMSO 1% כלולים כטיפול ביקורת שלילי במבחנים להשוואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע הרעיל של תרכובות הבדיקה (למשל, CHLA וPUG) בתאים לזיהום ויראלי באמצעות קביעת כדאיות תא מגיב כמו XTT (2,3-bis [2-methoxy-4-ניטרו-5-sulfophenyl] -5-Phenylamino) -carbonyl] -2H-tetrazolium הידרוקסיד): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לHCV, זרע הא-7.5 תאים בצלחת 96-היטב (1 × 10 4 תאים לכל טוב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2 O / N להשיג שכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל שליטת DMSO (1%) או ריכוזים הולכים וגדל של CHLA תרכובות בדיקה וPUG (לשעבר. 0, 10, 50, 100, ו -500 מיקרומטר) לבארות התרבות בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות, ואז להשליך את המדיום בצלחת ולשטוף את התאים עם 200 μl של נאגר מלוח פוספט (PBS) פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף assayin של 100 μlפתרון גרם מערכה במבחנה assay טוקסיקולוגיה מבוססת XTT לכל היטב דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך עוד 3 שעות כדי לאפשר XTT ייצור formazan. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הספיגה עם קורא microplate באורך גל של 492 ננומטר בדיקה ואורך גל של 690 ננומטר התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את אחוז הישרדות תאים באמצעות הנוסחה הבאה: כדאיות תא (%) = ב/ כ× 100%, שבו &#39;ב&#39;ו&#39; בשם &#39;מתייחס לספיגה של תרכובות הבדיקה ובקרת הממס (לשעבר DMSO 1%. טיפולים), בהתאמה. קבע את הריכוז של 50% רעילים סלולארי (CC 50) של תרכובות בדיקה מתוכנה אנליטיים כגון GraphPad פריזמה על פי הפרוטוקול של היצרן. </li></ol></li></ol> 2. Readout של זיהום ויראלי הערה: קריאת הנתונים של זיהום ויראלי תלוי במערכת הווירוס השתמשה ויכולות לערב שיטות כגון מבחני פלאק או מאה שSuring אותות כתב מוירוסים מתויג כתב. השיטה לאיתור זיהום הכתב-HCV מבוסס על פעילות הכתב בלוציפראז מתוארת להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף supernatants מהבארות נגועות ולהבהיר ב17,000 XG ב microcentrifuge למשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 20 μl של supernatant מבחן 50 μl של מצע בלוציפראז מערכת assay בלוציפראז Gaussia ולמדוד ישירות עם luminometer לפי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגעה infectivity HCV כיומן 10 יחידות יחסי אור (RLU) לקביעת עיכוב נגיפי (%) ולחשב את 50% הריכוז יעיל (EC 50) של תרכובות הבדיקה נגד זיהום HCV באמצעות אלגוריתמים מהתוכנה GraphPad פריזמה על פי הפרוטוקול של היצרן. </li></ol> 3. ויראלי האיון Assay הערה: דוגמאות לתקופת דגירה ומינון נגיפי לוירוסים שוניםמחדש מופיע באיור 1 א. ריכוזים גבוהים יותר של הווירוס יכולים גם להיבדק על ידי הגדלת משרד הפנים / PFU. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע הא-7.5 תאים בצלחת 96-היטב (1 × 10 4 תאים לכל טוב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2 O / N להשיג שכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תרכובות בדיקה או ביקורת (ריכוזים סופיים הם: CHLA = 50 מיקרומטר; PUG = 50 מיקרומטר; הפרין = 1,000 מיקרוגרם / מיליליטר; DMSO = 1%) עם חלקיקי HCV על ​​37 מעלות צלזיוס (איור 1 א, &#39;לטווח ארוך &quot; ) ביחס של 1: 1. לדוגמא, לבידוד נגיף 100 μl המכיל 1 x 10 4 FFU, להוסיף לדילול עובד 100 מיקרומטר CHLA 100 μl; זה מניב טיפול CHLA בריכוז סופי של 50 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תערובת הסמים וירוס ריכוז ל&quot; תת-טיפולי &quot;(יעיל) של תרכובות הבדיקה. לדוגמא, הריכוז יעיל של CHLA וPUG נגד HCV הוא במיקרומטר 1 31; לכןזה דורש דילול של פי 50 מתערובת הסמים וירוס שיכול להיות מושלמת עם 9.8 מיליליטר של המדיום בסיסי (בינוני culturing תא עם 2% FBS). הערה: הדילול לריכוז תת-טיפוליים מונע אינטראקציה משמעותית בין תרכובות הבדיקה ופני השטח של התא המארח, ומאפשר בדיקה של השפעת טיפול על virions התא ללא. שים לב שדילול זה תלוי בתגובת המינון אנטי של תרכובות המבחן נגד זיהום ויראלי מסוים, והוא נקבע לפני ביצוע assay המסוים הזה 31. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם השוואה, לערבב את הווירוס עם תרכובות בדיקה ומייד לדלל (אין תקופת דגירה) לריכוז תת-טיפולי לפני הזיהום (איור 1 א, &#39;לטווח קצר &quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את התערובת של HCV-התרופה מדוללת 100 μl על הא-7.5 monolayer התא (כמות הנגיף היא עכשיו ב1 x 10 2 FFU; משרד הפנים סופיים = 0.01) ודגירה של 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר נגיפיספיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הזיהום, להסיר את inocula המדולל ולשטוף בעדינות את הבארות עם 200 μl של PBS פעמיים. הערה: בצע שטיפה בעדינות כדי למנוע הרמת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ממדיום בסיס 100 μl היטב כל אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הזיהום וכתוצאה מכך על ידי מנסה לאמוד את supernatant לפעילות בלוציפראז כמתואר ב&#39;2. קריאת נתונים של זיהום ויראלי &#39;. </li></ol> 4. Assay הקובץ המצורף ויראלי הערה: דוגמאות לתקופת דגירה ומינון נגיפי לוירוסים שונים המופיעות באיור 2 א, &#39;קובץ מצורף&#39;. ריכוזים גבוהים יותר של הווירוס יכולים גם להיבדק על ידי הגדלת משרד הפנים / PFU. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע הא-7.5 תאים בצלחת 96-היטב (1 × 10 4 תאים לכל טוב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2 O / N להשיג שכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום צמרמורת monolayers התא בצלחות ב 4 ° C FOR 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף לטפל בתאים עם הבידוד HCV (משרד הפנים = 0.01) ותרכובות בדיקה או ביקורת (ריכוזים סופיים הם: CHLA = 50 מיקרומטר; PUG = 50 מיקרומטר; הפרין = 1,000 מיקרוגרם / מיליליטר; DMSO = 1%) בשעת 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. לדוגמא, לבידוד נגיף 90 μl המכיל 1 x 10 2 FFU, להוסיף 10 μl של דילול עובד 500 מיקרומטר CHLA; זה מניב טיפול CHLA בריכוז סופי של 50 מיקרומטר וזיהום על ידי HCV במשרד הפנים = 0.01 על monolayer התא. הערה: חשוב לבצע את הניסוי על 4 מעלות צלזיוס שכן הוא מאפשר לוירוס מחייב אך מונע כניסה אשר מתרחשת באופן יעיל ביותר על 37 מעלות צלזיוס. בצע את התוספת של תרכובות וירוס ובדיקה על קרח והדגירה שהתפתחה במקרר 4 ° C על מנת להבטיח שהטמפרטורה נשמרת על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולשטוף בעדינות את monolayer התא עם 200 μl של PBS קר כקרח פעמיים. הערה: בצע שטיפה בעדינות כדי למנוע הרמת התאים &lt;./ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ממדיום בסיס 100 μl היטב כל אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הזיהום וכתוצאה מכך על ידי מנסה לאמוד את supernatant לפעילות בלוציפראז כמתואר ב&#39;2. קריאת נתונים של זיהום ויראלי &#39;. </li></ol> 5. כניסה / Assay Fusion ויראלי הערה: דוגמא לתקופות דגירה ומינון נגיפי לוירוסים שונים המפורטות ב&#39;הכניסה / היתוך &#39;איור 2 א. ריכוזים גבוהים יותר של הווירוס יכולים גם להיבדק על ידי הגדלת משרד הפנים / PFU. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע הא-7.5 תאים בצלחת 96-היטב (1 × 10 4 תאים לכל טוב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2 O / N להשיג שכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום צמרמורת monolayers התא בצלחות על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק את התאים עם HCV (משרד הפנים = 0.01) בשעת 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. לדוגמא, השתמש הבידוד נגיף 100 μl המכיל 1 x 10 2 FFU. הערה: בצע addition של הבידוד הנגיפי על קרח והדגירה שהתפתחה במקרר 4 ° C כדי לשמור על הטמפרטורה 4 ° C, המאפשר כניסה מחייבת אך לא ויראלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולשטוף בעדינות monolayers התא עם 200 μl של PBS קר כקרח פעמיים. הערה: בצע שטיפה בעדינות כדי למנוע הרמת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את הבארות עם תרכובות בדיקה או ביקורת (ריכוזים סופיים הם: CHLA = 50 מיקרומטר; PUG = 50 מיקרומטר; הפרין = 1,000 מיקרוגרם / מיליליטר; DMSO = 1%) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. לדוגמא, להוסיף 10 μl של דילול עובד 500 מיקרומטר CHLA 90 μl של תקשורת, לערבב, וטיפול בבארות; זה מניב טיפול CHLA בריכוז סופי של 50 מיקרומטר. הערה: המעבר מ4 מעלות צלזיוס עד 37 מעלות צלזיוס עכשיו מקלה אירוע כניסה / היתוך הנגיפי ולכן מאפשרת הערכה של ההשפעה &quot;תרכובות בדיקה בשלב מסוים זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant המכיל סמים ולהסיר הלא הפניםוירוסים תאיים או על ידי שטיפה עם 200 μl של חיץ ציטרט (נתרן ציטרט 50 מ&quot;מ, 4 מ&quot;מ אשלגן כלורי, pH 3.0) או PBS. החל ממדיום הבסיס 100 μl לפני דוגרים על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הזיהום וכתוצאה מכך על ידי מנסה לאמוד את supernatant לפעילות בלוציפראז כמתואר ב&#39;2. קריאת נתונים של זיהום ויראלי &#39;. </li></ol>

<ol><li>Munier, C. M., Andersen, C. R., Kelleher, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+vaccines%3A+progress+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">HIV vaccines: progress to date.</a> Drugs. 71, 387-414 (2011).</li>
<li>Rothman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+to+dengue+virus%3A+a+tale+of+original+antigenic+sin+and+tropical+cytokine+storms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms.</a> Nat Rev Immunol. 11, 532-543 (2011).</li>
<li>Sung, H., Schleiss, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+current+status+of+cytomegalovirus+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Update on the current status of cytomegalovirus vaccines.</a> Expert Rev Vaccines. 9, 1303-1314 (2010).</li>
<li>Torresi, J., Johnson, D., Wedemeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+development+of+preventive+and+therapeutic+vaccines+for+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Progress in the development of preventive and therapeutic vaccines for hepatitis C virus.</a> J Hepatol. 54, 1273-1285 (2011).</li>
<li>Wright, M., Piedimonte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+prevention+and+therapy%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus prevention and therapy: past, present, and future.</a> Pediatr Pulmonol. 46, 324-347 (2011).</li>
<li>Christou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+bacterial+and+viral+zoonotic+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">The global burden of bacterial and viral zoonotic infections.</a> Clin Microbiol Infect. 17, 326-330 (2011).</li>
<li>Cascio, A., Bosilkovski, M., Rodriguez-Morales, A. J., Pappas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+socio-ecology+of+zoonotic+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">The socio-ecology of zoonotic infections.</a> Clin Microbiol Infect. 17, 336-342 (2011).</li>
<li>Grais, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measles+vaccination+in+humanitarian+emergencies%3A+a+review+of+recent+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Confl+Health%22%5BJournal%5D)">Measles vaccination in humanitarian emergencies: a review of recent practice.</a> Confl Health. 5, 21(2011).</li>
<li>Gautret, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+viral+respiratory+tract+infections-environmental+risk+factors+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Emerging viral respiratory tract infections-environmental risk factors and transmission.</a> Lancet Infect Dis. 14, 1113-1122 (2014).</li>
<li>Sampathkumar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle+East+respiratory+syndrome%3A+what+clinicians+need+to+know%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Middle East respiratory syndrome: what clinicians need to know.</a> Mayo Clin Proc. 89, 1153-1158 (2014).</li>
<li>Burd, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+Virus%3A+a+Clear+and+Present+Danger%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ebola Virus: a Clear and Present Danger.</a> J Clin Microbiol. 53, 4-8 (2015).</li>
<li>Bishop, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+and+Emerging+Treatment+Options+for+Ebola+Virus+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Potential and Emerging Treatment Options for Ebola Virus Disease.</a> Ann Pharmacother. , (2014).</li>
<li>Arduino, P. G., Porter, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+and+perioral+herpes+simplex+virus+type+1+%28HSV-1%29+infection%3A+review+of+its+management%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Oral and perioral herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection: review of its management.</a> Oral Dis. 12, 254-270 (2006).</li>
<li>Mitrasinovic, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+structure-based+design+of+the+influenza+A+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Advances in the structure-based design of the influenza A neuraminidase inhibitors.</a> Curr Drug Targets. 11, 315-326 (2010).</li>
<li>Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+acting+antivirals+against+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Directly acting antivirals against hepatitis C virus.</a> J Antimicrob Chemother. 66, 1673-1686 (2011).</li>
<li>Haqqani, A. A., Tilton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+inhibitors+and+their+use+in+the+treatment+of+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection.</a> Antiviral Res. 98, 158-170 (2013).</li>
<li>Melby, T., Westby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Exp+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of viral entry.</a> Handb Exp Pharmacol. , 177-202 (2009).</li>
<li>Vanderlinden, E., Naesens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+antiviral+strategies+to+interfere+with+influenza+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Emerging antiviral strategies to interfere with influenza virus entry.</a> Med Res Rev. 34, 301-339 (2014).</li>
<li>Antoine, T. E., Park, P. J., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+targeted+therapeutics%3A+a+new+era+of+anti-herpes+simplex+virus-1+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein targeted therapeutics: a new era of anti-herpes simplex virus-1 therapeutics.</a> Rev Med Virol. 23, 194-208 (2013).</li>
<li>Pawlotsky, J. M., Chevaliez, S., McHutchison, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hepatitis+C+virus+life+cycle+as+a+target+for+new+antiviral+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The hepatitis C virus life cycle as a target for new antiviral therapies.</a> Gastroenterology. 132, 1979-1998 (2007).</li>
<li>Beyleveld, G., White, K. M., Ayllon, J., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New-generation+screening+assays+for+the+detection+of+anti-influenza+compounds+targeting+viral+and+host+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">New-generation screening assays for the detection of anti-influenza compounds targeting viral and host functions.</a> Antiviral Res. 100, 120-132 (2013).</li>
<li>Kilianski, A., Baker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+antiviral+screening+against+coronaviruses%3A+developing+virus-specific+and+broad-spectrum+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Cell-based antiviral screening against coronaviruses: developing virus-specific and broad-spectrum inhibitors.</a> Antiviral Res. 101, 105-112 (2014).</li>
<li>Caillet-Saguy, C., Lim, S. P., Shi, P. Y., Lescar, J., Bressanelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerases+of+hepatitis+C+viruses+and+flaviviruses%3A+structural+and+mechanistic+insights+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Polymerases of hepatitis C viruses and flaviviruses: structural and mechanistic insights and drug development.</a> Antiviral Res. 105, 8-16 (2014).</li>
<li>Frey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+cell-cell+fusion+induced+by+the+envelope+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of cell-cell fusion induced by the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 69, 1462-1472 (1995).</li>
<li>Tscherne, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-+and+temperature-dependent+activation+of+hepatitis+C+virus+for+low-pH-triggered+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry.</a> J Virol. 80, 1734-1741 (2006).</li>
<li>Madan, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+umbrellas%3A+a+novel+class+of+candidate+topical+microbicides+to+prevent+human+immunodeficiency+virus+and+herpes+simplex+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Molecular umbrellas: a novel class of candidate topical microbicides to prevent human immunodeficiency virus and herpes simplex virus infections.</a> J Virol. 81, 7636-7646 (2007).</li>
<li>Haywood, A. M., Boyer, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+and+temperature+dependence+of+influenza+virus+membrane+fusion+at+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Time and temperature dependence of influenza virus membrane fusion at neutral pH.</a> J Gen Virol. 67 (Pt 12), 2813-2817 (1986).</li>
<li>Haywood, A. M., Boyer, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sendai+virus+membrane+fusion%3A+time+course+and+effect+of+temperature%2C+pH%2C+calcium%2C+and+receptor+concentration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sendai virus membrane fusion: time course and effect of temperature, pH, calcium, and receptor concentration).</a> Biochemistry. 21, 6041-6046 (1982).</li>
<li>Wang, G., Hernandez, R., Weninger, K., Brown, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+cells+by+Sindbis+virus+at+low+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Infection of cells by Sindbis virus at low temperature.</a> Virology. 362, 461-467 (2007).</li>
<li>Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolyzable+tannins+%28chebulagic+acid+and+punicalagin%29+target+viral+glycoprotein-glycosaminoglycan+interactions+to+inhibit+herpes+simplex+virus+1+entry+and+cell-to-cell+spread%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread.</a> J Virol. 85, 4386-4398 (2011).</li>
<li>Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antiviral+activity+of+chebulagic+acid+and+punicalagin+against+viruses+that+use+glycosaminoglycans+for+entry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry.</a> BMC Microbiol. 13, 187(2013).</li>
<li>Marukian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture-produced+hepatitis+C+virus+does+not+infect+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Cell culture-produced hepatitis C virus does not infect peripheral blood mononuclear cells.</a> Hepatology. 48, 1843-1850 (2008).</li>
<li>Baba, M., Snoeck, R., Pauwels, R., de Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfated+polysaccharides+are+potent+and+selective+inhibitors+of+various+enveloped+viruses%2C+including+herpes+simplex+virus%2C+cytomegalovirus%2C+vesicular+stomatitis+virus%2C+and+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+ChemotheR%22%5BJournal%5D)">Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus.</a> Antimicrob Agents ChemotheR. 32, 1742-1745 (1988).</li>
<li>Barth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+binding+of+hepatitis+C+virus+envelope+glycoprotein+E2+requires+cell+surface+heparan+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+CheM%22%5BJournal%5D)">Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate.</a> J Biol CheM. 278, 41003-41012 (2003).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+Virology%22">Principles of Virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Brown, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+caspase-dependent+apoptosis+in+antibody-enhanced+dengue+virus+infection+of+human+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Dramatic caspase-dependent apoptosis in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells.</a> J Leukoc Biol. 85, 71-80 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Cyr, S. L., Burt, D. S., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+host+responses+to+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29+following+intranasal+administration+of+a+Protollin-adjuvanted%2C+epitope-enhanced+recombinant+G+protein+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine host responses to respiratory syncytial virus (RSV) following intranasal administration of a Protollin-adjuvanted, epitope-enhanced recombinant G protein vaccine.</a> J Clin Virol. 44, 287-291 (2009).</li>
<li>Isaacson, M. K., Compton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegalovirus+glycoprotein+B+is+required+for+virus+entry+and+cell-to-cell+spread+but+not+for+virion+attachment%2C+assembly%2C+or+egress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress.</a> J Virol. 83, 3891-3903 (2009).</li>
<li>Leonard, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measles+virus+blind+to+its+epithelial+cell+receptor+remains+virulent+in+rhesus+monkeys+but+cannot+cross+the+airway+epithelium+and+is+not+shed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Measles virus blind to its epithelial cell receptor remains virulent in rhesus monkeys but cannot cross the airway epithelium and is not shed.</a> J Clin Invest. 118, 2448-2458 (2009).</li>
<li>Ciesek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+tea+polyphenol%2C+epigallocatechin-3-gallate%2C+inhibits+hepatitis+C+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate, inhibits hepatitis C virus entry.</a> Hepatology. 54, 1947-1955 (2011).</li>
<li>Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saikosaponin+b2+is+a+naturally+occurring+terpenoid+that+efficiently+inhibits+hepatitis+C+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Saikosaponin b2 is a naturally occurring terpenoid that efficiently inhibits hepatitis C virus entry.</a> J Hepatol. 62, 541-548 (2015).</li>
<li>Atkins, C., Evans, C. W., White, E. L., Noah, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+methods+for+influenza+antiviral+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Screening methods for influenza antiviral drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7, 429-438 (2012).</li>
<li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+virus+inhibitors+by+influenza+A+virus+specific+reporter+cell+based+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell based screening.</a> Antiviral Res. 93, 48-54 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

בדוח זה תוארו השיטות לזיהוי והערכה של תרכובות אנטי-ויראליות המבוססות על גישה מכניסטית של ניתוח אירועי הכניסה הנגיפית המוקדמת. באופן ספציפי, הבדיקות אפשרו לנו לבחון את ההשפעה של תרכובות בדיקה על חלקיקי וירוס חופשיים, התקשרות ויראלית וכניסה/היתוך ויראלי. צעדים קריטיים יושמו כדי להעריך באופן ברור את השפעת התרופה על השלב הספציפי של כניסה מוקדמת של הנגיף. לדוגמה, ב'בדיקת השבתה ויראלית', דילול תערובת הנגיף-תרופה לריכוז תת-טיפולי מונע אינטראקציה משמעותית בין תרכובת הבדיקה למשטח התא המארח על ידי 'טיטרציה' של התרופה. זה מבטיח שההשפעה המעכבת שנצפתה על הזיהום הבא של התא המארח נובעת מאינטראקציה ישירה בין תרכובת הבדיקה לוויריונים נטולי התאים, ולא מהשפעה של תרכובת הבדיקה על קרום התא המארח או מולקולות הקשורות לממברנה, כולל קולטנים נגיפיים30. באופן דומה, השינוי בטמפרטורה בין 4 מעלות צלזיוס (המאפשר קשירת וירוס אך לא כניסה) ל-37 מעלות צלזיוס (המאפשר כניסה/היתוך של הנגיף) ב'בדיקת התקשרות ויראלית' ו'בדיקת כניסה/היתוך ויראלי' הם חיוניים לקביעת השפעת תרכובת הבדיקה על כל אחד מהאירועים הספציפיים הללו. זה אפשרי בשל רגישות הטמפרטורה של נגיפים עטופים במהלך שלבים אלה בזיהום24-29. לכן חשוב שהבדיקות יבוצעו בטמפרטורה המצוינת כדי להבטיח את דיוק התוצאות; לדוגמה, על ידי ביצוע הניסוי על קרח כדי לשמור על 4 מעלות צלזיוס ועל ידי הנחת הדגימה ישירות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס לשינוי הטמפרטורה. בנוסף, השימוש בבקרות שליליות (למשל ממס DMSO להכנת תרופות) וחיוביות (למשל טיפול בהפרין) מסייע גם הוא לבסס עוד יותר את דיוק הבדיקות. התועלת והישימות של שיטות כאלה הוכחו במחקרים אנטי-ויראליים רבים26,30,31,40,41. שימו לב שבעוד שהפרין נכלל כבקרה עבור כל שלושת הבדיקות בהקשר של התוצאות המייצגות, הוא בדרך כלל חוסם את קשירת הנגיף הראשונית ולא את שלב ההיתוך/כניסה שלאחר מכן (כפי שמשתקף מהנתונים באיור 2). ניתן להשתמש גם בבקרות נוספות, כגון נטרול נוגדנים המכוונים נגד הנגיף (לבדיקת השבתה ויראלית), נוגדנים המסווים את קולטני פני התא לנגיף (לבדיקת התקשרות ויראלית), ומעכבי היתוך ממברנה (לבדיקת היתוך / כניסה ויראלית). 
הבדיקות המתוארות בדוח זה, הספציפיות לשלבים המוקדמים של הזיהום הנגיפי, שימושיות מבחינת יישום כבדיקות משניות לאפיון מנגנון הפעולה של תרופות מועמדות ממסכים ראשוניים המכוונים בדרך כלל לזיהום הנגיפי באופן רחב יותר. לחלופין, ניתן לשלב אותם גם במסכים ראשוניים אם מחפשים באופן ספציפי מעכבים של כניסה ויראלית מוקדמת, כולל חומרים משביתים של וירוסים, אנטגוניסטים להתקשרות ויראלית ומעכבים לכניסה/היתוך נגיפי. במקרה זה, השימוש בהם מאפשר ניתוח מסך ממוקד ומדויק יותר לזיהוי מועמדים אנטי-ויראליים ספציפיים למנגנון, אשר, בתורם, יאיצו את פיתוח התרופות בהמשך הזרם. 
השימוש במבחנים מבוססי תאים בזיהוי חומרים אנטי-ויראליים מספק מספר יתרונות חשובים בהשוואה למבחנים ביוכימיים, כולל חשיפת השפעות פוטנציאליות מחוץ למטרה (כגון ציטוטוקסיות) והוספת רלוונטיות פיזיולוגית לפעילות הביולוגית של חומרי הבדיקה42. סוגיות אלה הן שיקולים חשובים להחלטה אם חומר מועמד הוא בעל ערך להמשך בשלבים הבאים של פיתוח התרופה. באופן דומה, הבדיקות המוקדמות הספציפיות לכניסה ויראלית המתוארות בדוח זה מאפשרות לבחון את השפעת התרופה על שלב הכניסה הנגיפית המובהק ברמה התאית, וליתר דיוק בהקשר של זיהום ויראלי אותנטי במבחנה. התוצאות המתקבלות ממבחנים כאלה יעזרו אפוא לחזות טוב יותר את היעילות האנטי-ויראלית של תרכובות הבדיקה וגם לזהות השפעות לא רצויות מחוץ למטרה נגד התא המארח. עם זאת, מגבלה פוטנציאלית אחת היא שבדיקה מבוססת תאים במבחנה עשויה שלא לשקף לחלוטין את שלב הכניסה בפועל in vivo בהקשר של זיהום ויראלי טבעי. עם זאת, הבדיקות המוצגות בפרוטוקול זה משמשות כפלטפורמה אנליטית לזיהוי והערכה מבוססי מנגנון של חומרים אנטי-ויראליים חדשים.
הפיתוח של וירוסים מדווחים או מערכות תאים מדווחים לכימות כמות הזיהום הנגיפי הקל מאוד על סינון והערכה מבוססי תאים של תרכובות אנטי-ויראליות. דוגמאות כוללות שימוש בנגיפים רקומביננטיים הנושאים גן מדווח או באמצעות קווי תאים אנושיים רקומביננטיים המכילים גן מדווח המונע על ידי מקדם הנגיףהספציפי 31,43. בדוח זה, ניתן לנטר בקלות את ההדבקה מ-HCV מתויג לוציפראז על ידי כימות אות המדווח, ובכך להקל על ניתוח הנתונים. על ידי שילוב כלים שימושיים מבוססי מדווח אלה, ניתן להתאים את מבחני הכניסה הוויראלית המוקדמים המתוארים כאן לפורמט תפוקה גבוהה לסינון מבוסס מנגנון של ספריות מולקולות קטנות.
לסיכום, תואר פרוטוקול לבדיקות המנתחות את הכניסה הנגיפית המוקדמת כאמצעי לזיהוי והערכה של תרכובות אנטי-ויראליות ספציפיות למנגנון. בדיקות כאלה יהיו שימושיות לגילוי אנטגוניסטים/מעכבים חדשים לכניסה לנגיף ויסייעו בהרחבת היקף התרופות האנטי-ויראליות לפיתוח כטיפולים מונעים ו/או טיפוליים.

זיהומים נגיפיים מהווים איום מתמיד על בריאות הציבור וגורם משמעותי למחלות מגיפות, תחלואה ומקרי מוות ברחבי העולם. דרכי בקרה ספציפיות נגד זיהומים נגיפיים כוללות פיתוח חיסונים וטיפולים אנטי-ויראליים. בעוד שמאמצי החיסון הוכיחו את עצמם כמוצלחים בחיסון נגד מספר נגיפים, פתוגנים נגיפיים רבים נותרו ללא חיסון מגן כולל נגיף דנגי (DENV), ציטומגלווירוס אנושי (HCMV), נגיף הפטיטיס C (HCV), נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) ווירוס סינציאלי נשימתי (RSV)1-5. תרופות אנטי-ויראליות, לעומת זאת, ממלאות תפקיד חשוב בניהול זיהומים נגיפיים אלה כאשר חיסונים מונעים אינם זמינים. עם זאת, נכון להיום, רק מעט תרופות אנטי-ויראליות מורשות וחסכוניות זמינות בהשוואה למספר הפתוגנים הנגיפיים המאיימים על בריאות הציבור. חשוב מכך, בשל עלייה בנסיעות העולמיות ועיור מהיר, המצב מחמיר על ידי סיכונים להתפרצויות מגיפה מזיהומים נגיפיים מתעוררים/מתעוררים מחדש המוחדרים לאזורים שאינם ילידים6. התפרצויות שנגרמו לאחרונה על ידי נגיף SARS, נגיפי שפעת (H1N1, H5N1, H3N2 ו-H7N9), DENV, נגיף הנילוס המערבי (WNV), נגיף החצבת (MV), נגיף התסמונת הנשימתית המזרח תיכונית (MERS) ונגיף האבולה6-12 הן בין הדוגמאות המשקפות את הצורך בפיתוח תרופות אנטי-ויראליות כאשר חיסונים ו/או טיפולים אינם זמינים. בנוסף, תמיד קיים סיכון פוטנציאלי ליצירת זיהומים עמידים לתרופות עם תרופות אנטי-ויראליות הנמצאות בשימוש כיום. לפיכך, פיתוח והרחבה מתמשכים של היקף התרופות האנטי-ויראליות לזיהומים נגיפיים מתעוררים/מתעוררים מחדש נחוצים כדי לספק אסטרטגיות ניהול טובות יותר ולשמור על בריאות הציבור.
רוב הטיפולים האנטי-ויראליים מורכבים מתרופות אנטי-ויראליות בפעולה ישירה (DAAs) המכוונות לחלבון או קופקטור ויראלי ספציפי המתווך שלבים חשובים במחזור החיים הנגיפי. לדוגמה, אנלוגי הנוקלאוזידים אציקלוביר מעכב DNA פולימראז של נגיף ההרפס, מעכבי פרוטאז Boceprevir ו-Telaprevir מנוגדים ל-HCV NS3, ואוסלטמיביר וזנמיביר הם מעכבי נויראמינידאז החוסמים את שחרור חלקיקי נגיף השפעת מתאים נגועים13-15. עם זאת, ישנם מעט מאוד מעכבי כניסה ויראלים מורשים, כולל Enfuvirtide, המכוון ל-HIV gp41 כדי למנוע איחוי, ו-Maraviroc, החוסם את הקולטן המשותף ל-HIV CCR5, ובכך מונע כניסה לנגיף16. חקירת אנטגוניסטים/מעכבים חדשים לכניסה לנגיף יכולה לסייע במתן טיפולים נוספים לשימוש מונע או טיפולי, כגון בשילוב עם תרופות אנטי-ויראליות אחרות עם מנגנון פעולה שונה לניהול טוב יותר של זיהומים נגיפיים17-19. 
זיהוי תרופות אנטי-ויראליות יכול לכלול תכנון תרופות מונחה מבנה ואסטרטגיה מבוססת סינון תרופות מועמדים. שיטות להערכת פעילות אנטי-ויראלית של סוכני בדיקה כוללות בדיקות ביוכימיות של פעילות אנזימטית והערכה על ידי מערכות מבוססות תאים20-23. במערכות מבוססות תאים, ניתן לנתח את מחזור החיים הנגיפי לשלבי זיהום מובחנים, כגון אירועי כניסה (התקשרות, היתוך, הסרת ציפוי), שלב השכפול (שכפול גנום ויראלי ותרגום חלבון) ויציאת ויריון (הרכבה, התבגרות ושחרור). מכיוון שניתן להתאים את הבדיקות לחקירת כל שלב ספציפי באמצעות כלים ושיטות שונות, גישה זו מאפשרת זיהוי/בחינה של תרופות אנטי-ויראליות מועמדות פוטנציאליות עם מנגנון פעולה ספציפי המכוון לשלב הייחודי המנותח. לדוגמה, כדי לנתח את השפעת התרופה באופן ספציפי על חלקיקי הנגיף החופשי לפני הקישור לתא המארח, ניתן לבצע 'בדיקת השבתה ויראלית'. בבדיקה זו, הנגיף מורשה לדגור עם תרופת הניסוי ולאחר מכן מדולל כדי להוציא את התרופה לפני הדבקת תא חד-שכבתי. ניתן לנתח שלבים נוספים כגון חיבור ויראלי ושלבי כניסה/היתוך בנפרד, על ידי שינוי הטמפרטורה במהלך ההדבקה. עבור נגיפים עטופים רבים, כניסה/היתוך ויראלי בקרום התא המארח מקל מאוד ב-37 מעלות צלזיוס, אך בדרך כלל נמנע ב-4 מעלות צלזיוס, מה שאינו משפיע על קשירת הנגיף24-29. לבסוף, השימוש בנגיפי דיווח או במערכות תאים יכול להקל על מחקרים אלה ולאפשר ניתוח תפוקה גבוהה.
בעבר השתמשנו בגישה מבוססת תאים וניתחנו את הכניסה המוקדמת של נגיפים עטופים שונים לבחינת תרכובות אנטי-ויראליות שעלולות לעורר אנטגוניזם30,31. כאן מתוארות השיטות השונות בהן נעשה שימוש, כולל השבתה ויראלית, התקשרות ויראלית ומבחני כניסה/היתוך ויראליים.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>אמפוטריצין B</td><td>GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת טוקסיקולוגיה במבחנה,</td><td>Sigma</td><td>TOX2</td><td></td></tr> <tr><td>מבוסס XTTPBS pH 7.4&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרופלייט</td><td>Thermo Scientific</td><td>89087-320</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>75002420</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת BioLux Gaussia luciferase</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>E3300L&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>לומינומטר</td><td>Promega</td><td>GloMax-20/20</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט, דיהידראט</td><td>Sigma</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr></tbody></table>

מבחני ויראלי המוקדם כניסה לזיהוי והערכה של אנטי תרכובות

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

מערכות מבוססות תאים שימושיות לגילוי חומרים אנטי-ויראליים. ניתוח מחזור החיים של הנגיף, במיוחד שלבי הכניסה המוקדמים, מאפשר גישה מכניסטית לזיהוי והערכה של חומרים אנטי-ויראליים המכוונים לשלבים ספציפיים של כניסת הנגיף. בדוח זה מתוארות השיטות לבחינת השבתה ויראלית, התקשרות ויראלית וכניסה/היתוך ויראלי כבדיקות אנטי-ויראליות למטרות כאלה, תוך שימוש בנגיף הפטיטיס C כמודל. בדיקות אלה אמורות להיות שימושיות לגילוי אנטגוניסטים/מעכבים חדשים לכניסה מוקדמת של הנגיף ולעזור להרחיב את היקף התרופות האנטי-ויראליות המועמדות להמשך פיתוח תרופות.

באיור 1, &#39;assay איון ויראלי&#39; בוצע לבחון האם שתי CHLA הספציפי טבעי התרכובות וPUG יכולים להשבית הווירוסים עטפו השונים במדינה ללא תא ולמנוע זיהום שלאחר מכן. תגובת המינון הרעילה ואנטי של תרכובות אלה נקבעה קודם לביצוע מחקר מכניסטית 31. היו מראש שטופלו הווירוסים עם תרכובות בדיקה ולאחר מכן תערובות הסמים וירוס היו בדילול לריכוזים תת-טיפוליים לפני החיסון על monolayer התא המתאים לכל מערכת וירוס. כפי שניתן לראות באיור 1, שני CHLA וPUG הופיעו לאינטראקציה עם virions ללא הסלולרי, וכתוצאה מכך השפעות בלתי הפיכות שהגנה על monolayer התא מהזיהום שלאחר מכן. שתי תרכובות המבחן השיגו עיכוב 100% ליד נגד HCMV, HCV, וDENV-2, ואילו 60 - בלוק 80% נצפה נגד MV וRSV. סג תוצאות אלוest שיש לי CHLA וPUG השפעה ישירה על חלקיקי הנגיף הללו בחינם על ידי inactivating ונטרול infectivity. באיור 2, את הקובץ המצורף וכניסה / מבחני היתוך בוצעו כדי לחקור את ההשפעה של CHLA וPUG נגד אירועים אלה מוקדם נגיפיים הקשורות לכניסה מHCMV, HCV, DENV-2, MV, וRSV. CHLA וPUG שני מנעו מחייב של הווירוסים נחקרו על התא מארח בהתאמה, כפי שמוצגים על ידי עיכוב בזיהום נגיפי וכתוצאה מכך (איור 2, &#39;קובץ מצורף&#39;: פסים אפורים בהירים). ההשפעה המעכבת על קובץ מצורף וירוס על ידי שני התרכובות דומה נגד HCMV (איור 2), HCV (איור 2 ג), DENV-2 (איור 2 ד), וRSV (איור 2F), הנע 90-100%. מצד השני, PUG הופיע להיות יעיל יותר מאשר CHLA נגד MV המחייב (איור 2E), עם שיעור העיכוב מTWתרכובות o משתנות בין 50 - 80%. הפרין טיפול שליטה, אשר ידוע לחסום כניסה של וירוסים רבים, גם קובץ מצורף עכבות של HCMV, DENV-2, RSV, מודעת MV, אבל היה פחות יעיל נגד HCV. &quot;Assay כניסה / היתוך ויראלי &#39;שלאחר מכן בדק האם CHLA וPUG שמרו את פעילותם במהלך שלב כניסת וירוס / היתוך (איור 2,&#39; כניסה / היתוך &#39;: פסים אפורים כהים). שוב, שתי CHLA וPUG נצפו לפגוע ביעילות צעד כניסה / היתוך הנגיפי של הווירוסים שנבדקו (איור 2 ב - F), מניב 50 - 90% השפעה מגנה על monolayer התא המתאים. הפרין גם כניסה / היתוך בעצמת עכבות בDENV-2 וזיהומי RSV, אך היה פחות יעיל נגד HCMV, HCV, וMV (&lt;עיכוב של 40% בממוצע). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> וירוס </td><td> סוג התא </td></tr><tr><td> HCMV </td> &lt;td&gt; HEL </td></tr><tr><td> HCV </td><td> הא-7.5 </td></tr><tr><td> DENV-2 </td><td> Vero </td></tr><tr><td> MV </td><td> CHO-SLAM </td></tr><tr><td> RSV </td><td> הפ-2 </td></tr></tbody></table> טבלה 1:. סוג התא מארח לזיהום ויראלי סוג התא המשמש לכל מערכת זיהום ויראלי שתוארה בתוצאות הנציג מצויינים. ניתן למצוא פרטים נוספים על התאים בהתייחסות 31. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig1.jpg" /> איון איור 1. של זיהומים נגיפיים על ידי CHLA תרכובות בדיקה וPUG טופלו וירוסים שונים עם תרכובות הבדיקה לתקופה ארוכה. (טופחה במשך 1.5-3 שעות לפני טיטרציה; ברים אפורים בהירים) או תקופה קצרה (בדילול מייד; אפור כהה ברים) על 37 מעלות צלזיוס לפני דילול לConcentra תת-טיפוליtion וניתוח שלאחר מכן של זיהום בתאי המארח המתאים. (א) שרטוטים של הניסוי (מוצג משמאל) עם ריכוז הווירוס הסופי (PFU / טוב או משרד הפנים), לטווח ארוך תקופת דגירה סמים וירוס (i), וזמן דגירה לאחר מכן (ii) מצויינים עבור כל וירוס בטבלה בצד הימין. הניתוח לHCV HCMV (ב), (ג), (ד) DENV-2, (E) MV, וRSV (F) מצוין בכל לוח נוסף. תוצאות הם זממו נגד טיפול DMSO השלילי שליטה לזיהום בנגיף והנתונים המוצגים הם אמצעי ± שגיאות תקן של הממוצע (SEM) משלושה ניסויים בלתי תלויים. נתון זה שונה מהתייחסות 31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig2.jpg" /> איור 2. הערכה של פעילות אנטי של CHLA תרכובות בדיקה וPUG נגד מצורף וירוס וכניסה / היתוך. (א) ההליך ניסיוני, ריכוז וירוס (PFU / טוב או משרד הפנים), והזמן של חיבור וטיפול בתרכובות הבדיקה (I, II, III) מוצגים לכל וירוס בשרטוטים והשולחנות הקשורים. בניתוח קובץ מצורף וירוס (פסים אפורים בהירים), monolayers של סוגי תאים שונים היו מראש מקורר-על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, ולאחר מכן טופל בשיתוף עם וירוסי בהתאמה ותרכובות מבחן על 4 מעלות צלזיוס (1.5-3 שעות; i) לפני הכביסה את מחסן ותרכובות מבחן לדגירה לאחר מכן (37 ° C; ii) ובדיקה של זיהום בנגיף. בכניסת וירוס / ניתוח איחוי (פסים אפורים כהים), monolayers תא זרע היו טרום צונן על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ולאחר מכן קרא תיגר עם וירוסי בהתאמה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1.5-3 שעות (i). תאים היו אזשטף וטופל בתרכובות המבחן לתקופת דגירה נוספת (ii) שבמהלכה הטמפרטורה הועברה 37 ° C כדי להקל על אירוע כניסה / היתוך ויראלי. בסוף הדגירה, וירוסים תאיים הוסרו על ידי שני חיץ ציטרט (pH 3.0) או שוטף PBS והתאים הודגרו נוספים (iii) לניתוח של זיהום בנגיף. תוצאות עבור HCV HCMV (ב), (ג), (ד) DENV-2, (E) MV, וRSV (F) מצוינות בכל לוח נוסף. הנתונים הם זממו נגד טיפול ביקורת השלילי DMSO של זיהום בנגיף ומוצגים כאמצעי ± SEM משלושה ניסויים בלתי תלויים. נתון זה שונה מהתייחסות 31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הבוחן שלבים ספציפיים של הכניסה הנגיפית כדי לזהות ולהעריך חומרים אנטי-ויראליים חדשים.

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקבוע את ההשפעה האנטיוויראלית של תרכובות בדיקה כנגד שלבים ספציפיים של חדירה ויראלית מוקדמת. הדבר מבוצע תחילה על ידי זריעה של תאי המארח להדבקה ויראלית. השלב השני הוא ביצוע ההדבקה הוויראלית והטיפולים בתרכובות הבדיקה בזמנים ובטמפרטורות שונות.בשלב הבא, שוטפים את האינוקולומים שטופלו בתרופה ומכסים את התאים במצע בסיסי. השלב הסופי הוא דגירה של התאים. לבסוף, מנתחים את הזיהומיות הוויראלית כדי לקבוע את השפעת התרכובות הנבדקות על שלבי הכניסה הוויראליים המוקדמים של הזיהום הוויראלי.לדוגמה, מכשיר לומנומטר משמש להערכת פעילות הלוציפראז בתאים שנדגמו לאחר הדבקה על ידי נגיף דגלי (reporter virus). היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת גישה מבוססת מנגנונים יותר בזיהוי חומרים אנטי-ויראליים, ובמיוחד אלו המטרים את הכניסה של הנגיף לתא. כדי להתחיל, הכינו תחילה תמיסות מלאי של התרכובות לבדיקה, trilogy acid או CHLA ו-PUNIC collagen או PUG ב-DMSO; המיסו heparin לשליטה חיובית במים מזוקקים פעמיים סטריליים להכנת תאי המאכסן עבור תרבית הבדיקה.תאי סרטן כבד אנושי, HUH 7.5, למשך לילה ב-DMAM טרי מועשר ב-FBS ואנטיביוטיקה. זכרו לפעול לפי נהלי בטיחות ביולוגית רמה 2 (biosafety level two) לאורך כל הניסוי לבדיקת הציטוטוקסיות של תרכובות הבדיקה. טפלו בתאים בריכוזים עולים של CHLA או PUG מאפס עד 500 micromolar המדוללים בתווך בסיסי, או ב-1% DMSO כביקורת שלילית, ולאחר מכן הדגירו את התאים למשך 72 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באינקובטור לתרבית תאים.הסיר את המצע ושטוף את התאים פעמיים עם 200 µL של PBS. לאחר מכן, הוסף 100 µL של XT T assay reagent, והדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש שעות. לאחר מכן, השתמש בקורא מיקרו-פלייטים כדי לקבוע את הבליעה ב-492 nm עם אורך גל ייחוס של 690 nm.חשבו את אחוז החיוניות באמצעות הנוסחה הנתונה מהערכים הללו. קבעו את ריכוזי הציטוטוקסיות התאית של 50% עבור כל תרכובת. התחילו את בדיקת השהיית הווירוס.בפלטה הראשונה, זריעה של 10⁴ תאים לבאר. בפלטה של 96 בארות, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך לילה כדי להבטיח היצמדות לצורך הדבקה. הכינו חלקיקי נגיף הפטיטיס C או HCV המסומנים בדוח של Gaia luciferase כפי שמופיע בפרוטוקול הטקסט.במבחנה סטרילית ערבב 100 µL של 100 µM CHLA או PUG עם 100 µL של 10⁴ FFU של HCV עבור תערובת בקרה חיובית. ערבב HCV עם heparin בריכוז סופי של 1000 µg/mL.דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש שעות. לאחר שלוש שעות, דללו את תערובת תרכיב הנגיף פי 50 באמצעות 9.8 milliliters של מצע בסיסי בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו תערובת תרכיב נגיף חדשה, ודללו תערובת זו באופן מיידי במצע בסיסי עבור דגימת הדגירה של שעת האפס.לאחר הסרת מצע הדגירה מהתאים, הוסיפו 100 µL של תמיסת התרופה הנגפית המדוללת לכל באר, בשלוש חזרות. התמיסה מכילה כעת 10² FFU לבער. הדגירו בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך שלוש שעות כדי לאפשר הדבקה נגיפית של התאים. לאחר ההדגירה, הסירו את ת сусפנזיית הנגיפים מהבארים ושטפו בעדינות את התאים עם 200 µL של PBS, פעמיים.דגרו את התאים ב-100 µL של מצע בסיסי למשך 72 שעות לשם רפליקציה ויראלית ושחרור של הדיווח (reporter) לוסיפראז אל העל-נוזל. לאחר מכן, אספו את העל-נוזל מהתרביות וממבחנות המיקרו וסובבו בצנטריפוגה ב-17,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. כדי להסיר שיירי תאים, ערבבו 20 µL מכל על-נוזל עם 50 µL של ריאגנט לבדיקת לוסיפראז גאוסי, ומדדו את הלומיננסציה הנובעת מפעילות הדיווח לוסיפראז בלומנומטר.בהתאם להוראות היצרן עבור פלטת בדיקת ההיצמדות הוויראלית, יש להוסיף 1x10⁴ תאים לבאב בכל באר בפלטת 96 בארות ולהדגיר למשך לילה כדי לאפשר היצמדות תאים. למחרת בבוקר, ראשית יש לצנן את פלטת 96 הבארים המכילה את השכבה החד-שכבתיות של התאים בטמפרטורה של 4°C למשך שעה אחת.הכינו את תרכובות הבדיקה ואת תערובת הווירוס על קרח. לדוגמה, תמיסות H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1%DMSO או ביקורת חיובית של HCV Heparin עם 10² FFU של וירוס. עבור כל טיפול, שאבו בעדינות את המדיום מבארות תרבית התאים.לאחר מכן, הוסיפו מיד 100 µL של תערובת תרכובות לבדיקת וירוס לשלוש בארות (triplicate wells), תוך הקפדה שלא להעלות את הטמפרטורה. דגרו את הפלטה במקרר המתוחזק בטמפרטורה של 4 °C למשך שלוש שעות. חלקיקי הוירוס ייצמדו לפני השטח של התאים ב-4 °C, אך לא יופנמו לתאים.בשלב הבא, שאבו את העל-נוזל (supernatants). שטפו בעדינות את התאים פעמיים עם 200 µL של PBS קר בקרח. הוסיפו 100 µL של מצע בסיסי (basal medium) לכל באר, ולאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 72 שעות.לבסוף, לצורך כימות שחרור הדו"ח (reporter) של הלוסיפראז מהתאים המודבקים. אספו את העל-נוזל (supernatant) מכל באר של דגימה ובצעו את בדיקת ה-Gaussian Luciferase להערכת היתוך וכניסת נגיפים. קררו מראש את צלחת תרבית התאים בטמפרטורה של 4°C למשך שעה אחת.לאחר דגירה של לילה להצמדת התאים, הסר את המצע הקיים מהבארים והדבק את התאים ב-10² F-F-U-H-C-V על קרח. דגרי את הפלטה בטמפרטורה של 4 °C למשך שלוש שעות. שטפי בעדינות את התאים פעמיים עם 200 µL של PBS קר מאוד כדי להסיר את הווירוס שלא נצמד.לאחר מכן, על קרח, טפל את התאים בתרכובות הבדיקה המומסות במצע בסיסי, או במצע בסיסי עם 1% DMSO כביקורת, והדגר את הפלטה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. שלב זה מאפשר להעריך את השפעת תרכובות הבדיקה על כניסת הווירוס, המתרחשת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שאב את המצע ושטוף פעמיים את הווירוסים שלא הוטמעו ב-200 מיקרוליטר של בופר ציטראט או PBS.הוסיפו 100 µL של מצע בסיס לכל באר והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 72 שעות נוספות. אספו את העל-נוזל (supernatant) ובצעו את בדיקת ה-Gaussian Luciferase כפי שהודגם בעבר לזיהוי ה-luciferase reporter ששוחרר. להלן השפעות של תרכובות הבדיקה על HCV. בבדיקת ההפעלה, הנגיף הודגר עם תרכובות הבדיקה למשך אפס או שלוש שעות לפני ההדבקה.אחוז העכבה של הזיהום הוויראלי מוצג עבור כל טיפול. ביקורת שלילית של DMSO אינה מראה עכבה. CHLA מראה עכבה גבוהה עם המגע, לאחר דגירה של שעת אפס, וכן לאחר דגירה ממושכת יותר של שלוש שעות.תוצאות נוספות עם בדיקה אחרת. עבור תרכובת PUG מוצגות התוצאות כאן; תוך התאמה של תכנון ניסויי כללי זה, CHLA ו-PUG הראו עיכוב נוסף של זיהומיות של cytomegalovirus אנושי או HCMV בפיברובלסטים של ריאה עוברית. השפעתם של CHLA ו-PUG על היצמדות של HCV מוצגת כאן.כזכור, התאים הודגרו עם הנגיף בנוכחות או בהיעדר תרכובות הבדיקה בטמפרטורה של 4°C, ולאחר הסרת הנגיף שאינו קשור, הודגרו התאים בטמפרטורה של 37°C להדבקה על ידי הנגיף. העמודות המוצללות מדגימות את ההשפעה של C-H-L-A-P-U-G או heparin על כניסת HCV לתאים. שימו לב שבמקרה זה, היצמדות הנגיף בוצעה תחילה בטמפרטורה של 4°C.לאחר הסרת הווירוסים שלא נקשרו, התאים דגרו עם תרכובות הבדיקה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius לצורך כניסת הווירוס. באופן דומה, במקרה של HCMV, הדגרה של פיברובלסטים של ריאה עוברית בטיפול עם CHLA או PUG מראה עיכוב חזק של היצמדות ויראלית וכניסה ויראלית. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע את השלבים בטמפרטורה המצוינת, שכן היא תשפיע על דיוק התוצאות.

early-viral-entry-assays-for-identification-evaluation-antiviral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את בדיקת ההשבתה הנגיפית, ומציג את הערכת ההשפעה של חומרים אנטי-ויראליים על חלקיקים נגיפיים.

הערכת היעילות של תרכובת בדיקה אנטי-ויראלית באמצעות בדיקת אינאקטיבציה ויראלית

סרטון זה מדגים בדיקת התקשרות ויראלית לבדיקת תרכובות אנטי-ויראליות. באמצעות וירוס הפטיטיס C ולוציפראז מהונדסים גנטית, הוא מעריך השפעות מעכבות על התקשרות ויראלית, כפי שמצוין על ידי עוצמת אור נמוכה יותר בבארות שטופלו בשיתוף בהשוואה לבארות שטופלו בנגיף בלבד.

בדיקת התקשרות ויראלית לבדיקת תרכובות אנטי-ויראליות

סרטון זה מדגים בדיקה להערכת חומרים אנטי-ויראליים המכוונים לשלבים ספציפיים של כניסת הנגיפים לתאי המאכסן ואיחוי עם האנדוזום. התאים מודגרים בטמפרטורה נמוכה ואז נגועים ב- HCV. הטמפרטורה הנמוכה מאפשרת קשירה נגיפית לתאים מארחים אך מעכבת הפנמה באמצעות אנדוציטוזה. התרכובת האנטי-ויראלית של הבדיקה מתווספת, והתאים מודגרים בטמפרטורה פיזיולוגית. מעבר זה לטמפרטורה גבוהה יותר מאפשר כניסה נגיפית ומאפשר להעריך את השפעת תרכובת הבדיקה על איחוי מעטפת נגיפית עם אנדוזומים.

בדיקה להערכת ההשפעה של תרכובות בדיקה על כניסה נגיפית ואיחוי בתאים מארחים

סרטון זה מדגים את השיטה לביצוע בדיקת פלאק באמצעות וירוס המתקבל מקרנית חזיר נגועה. קרנית החזיר משמשת לבדיקת היעילות האנטי-ויראלית של תרופות ניסיוניות.

קביעת יעילות אנטי-ויראלית של תרופות ניסיוניות באמצעות בדיקת פלאק

שלושה מבחני, כולל השפעת cytopathic (CPE) מבוססת assay, assay מנת התגובה וassay בזמן של תוספת (TOA) פותחו, אופטימיזציה, תוקף ומנוצל כדי לזהות antivirals רומן נגד וירוס Bluetongue (BTV), כמו גם כדי לקבוע את הפעולה מנגנון-of-האפשרית (משרד חקלאות) לantivirals זיהה לאחרונה.

מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס Bluetongue

במבחני חוץ גופית כדי למדוד שכפול נגיף כבר השתפר מאוד על ידי הפיתוח של וירוסי RNA רקומביננטי להביע לוציפראז או אנזימים אחרים מסוגלים פליטת אור. כאן אנו פירוט צינור הקרנת תפוקה גבוהה המשלב זני רקומביננטי כגון חצבת והווירוסים chikungunya לבודד antivirals ספקטרום רחב מספריות כימיות.

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

כאן אנו מתארים cytotoxicity הסלולרי ומבחני infectivity סיבוב בודדים המאפשרים סינון המהיר ומדויק של תרכובות כדי לקבוע cytotoxicity הסלולרי (CC 50) וIC 50 ערכים נגד WT וסמים עמידים HIV-1.

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

השלב הראשון במחזור החיים של וירוס הזירה הוא הצמדה של חלקיקים נגיפיים לתאים מארחים. אנו מדווחים על בדיקה כמותית מבוססת RT-PCR לזיהוי וכימות רגישים במיוחד של אירועי התקשרות ל-arenavirus.

Assay הרגיש ביותר למדידה של Attachment Arenavirus התאים

מטרת הפרוטוקול היא להמחיש את הנושא השונה המתייחס לערך ויראלי שניתן להשתמש בו כדי לזהות מעכבי כניסה ויראלית של מועמד.

שימוש בעלי כניסה ויראלי וניתוח עגינה מולקולרית לזיהוי מועמדים אנטי-ויראליים A16

בעבודה זו, אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים בבדיקות מבוססות אנזים מבוססות replicon ויראלי כדי לסנן מעכבים של שכפול וירוס זיקה בפורמט הקרנה תפוקה גבוהה.

בדיקות אנטי-ויראליות בעלות תפוקה גבוהה למסך עבור מעכבי שכפול וירוס זיקה

מאמר זה מתאר את המתודולוגיה ליצירת חלקיקים מדומים מסוג SARS-CoV-2 באמצעות מערכת מדווח לוסיפראז ואת השימוש בה לזיהוי מעכבי כניסה. פרוטוקולים אלו מודגים באמצעות שני מעכבי כניסה שונים: חלבון מיזוג ACE2-Fc האנושי רקומביננטי והתרכובת המולקולית הקטנה ארבידול.

נהלים לזיהוי מעכבי כניסה ל-SARS-CoV-2 כאנטי-ויראליים פוטנציאליים באמצעות פסאודו-וירוסים מבוססי MLV

למדו פרוטוקול להערכת אפקטים אנטי-ויראליים של תרכובות בניסויי כניסה ויראלית מוקדמת. השיטה משתמשת בתאי HUH 7.5 ובמדידות לוציפראז לזיהוי סוכנים אנטי-ויראליים חדשים.

מבחני ויראלי המוקדם כניסה לזיהוי והערכה של אנטי תרכובות

גלה סרטונים נוספים