מבחני ויראלי המוקדם כניסה לזיהוי והערכה של אנטי תרכובות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את ההשפעה האנטי-ויראלית של תרכובות בדיקה כנגד שלבים ספציפיים של כניסה מוקדמת של הנגיף. זה מושג על ידי זריעה ראשונה של תאי המארח לזיהום הנגיפי. השלב השני הוא ביצוע הזיהום הנגיפי וטיפולי תרכובת הבדיקה בזמנים ובטמפרטורות שונות.

לאחר מכן, החיסונים המטופלים בתרופות נשטפים והתאים מכוסים במדיום בסיסי. השלב האחרון הוא דגירה על התאים. בסופו של דבר, זיהום ויראלי מנותח כדי לקבוע את השפעת תרכובות הבדיקה על שלבי הכניסה הנגיפית המוקדמים של הזיהום הנגיפי.

לדוגמה, לומינומטר משמש להערכת פעילות הלוציפראז בתא שנחטף מזיהום על ידי וירוס מדווח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לאפשר גישה מבוססת יותר על מנגנונים בזיהוי חומרים אנטי-ויראליים, במיוחד אלה המכוונים לחדירה ויראלית. כדי להתחיל, ראשית, הכינו תמיסות מלאי של תרכובות הבדיקה, חומצת טרילוגיה או CHLA וקולגן PUNIC או PUG ב-DMSO ממיסים הפרין לבקרה חיובית במים מזוקקים כפולים סטריליים כדי להכין תאי מארח לתרבית הבדיקה.

קרצינומה של כבד אנושי, HUH 7.5 תאי לילה ב-DMAM טרי בתוספת FBS ואנטיביוטיקה. זכור לעקוב אחר נהלי רמת הבטיחות הביולוגית השנייה לאורך הניסוי כדי לבדוק את הציטוטוקסיות של תרכובות הבדיקה. טפל בתאים בריכוזים הולכים וגדלים של CHLA או PUG מאפס ל-500 מיקרו-מולרי מדולל במדיום בסיסי, או 1% DMSO כביקורת שלילית, ולאחר מכן דגר על התאים למשך 72 שעות ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית תאים.

הסר את המדיום ושטוף את התאים עם 200 מיקרוליטר PBS פעמיים. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מגיב בדיקת XT T, ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר מכן השתמש בקורא מיקרו-פלטות כדי לקבוע את הספיגה ב-492 ננומטר עם אורך גל ייחוס ב-690 ננומטר.

חשב את אחוז הכדאיות באמצעות נוסחה נתונה מערכים אלה. קבע את ריכוזי הציטוטוקסיות התאית של 50% עבור כל תרכובת. כדי להתחיל בבדיקת ההשבתה הוויראלית.

צלחת ראשונה, אחת כפול 10 עד תאים רביעיים לבאר. בצלחת של 96 בארות דגרו על התאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך הלילה לחיבור לזיהום. הכן מדווח Gaia luciferase מתויג נגיף הפטיטיס C או חלקיקי HCV כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט.

בצינור סטרילי מערבבים 100 מיקרוליטר של 100 מיקרו-מולארי CHLA או PUG עם 100 מיקרוליטר של 10 עד הרביעי. יחידות יוצרות מיקוד או FFU של HCV לתערובת בקרה חיובית. HCV עם הפרין בריכוז סופי של 1000 מיקרוגרם למיליליטר.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר שלוש שעות, יש לדלל את תערובת תרכובת הנגיף פי 50 עם 9.8 מיליליטר מדיום בסיסי בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הכינו תערובת תרכובת וירוסים חדשה, ודללו מיד את התערובת הזו במדיום בסיסי לדגימת הדגירה של שעת האפס.

לאחר הוצאת מדיום הדגירה מהתאים, הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת תרופת הנגיף המדולל לכל באר בשלוש עותקים. התמיסה מכילה כעת 10 עד ה-FFU השני לכל באר דגירה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שלוש שעות כדי לאפשר זיהום ויראלי של התאים. לאחר הדגירה, הסר את התרחיף הנגיפי מהבארות ושטוף בעדינות את התאים עם 200 מיקרוליטר PBS. פעמיים.

דגרו את התאים ב-100 מיקרוליטר של מדיום בסיסי למשך 72 שעות לשכפול הנגיף ושחרור מדווח לוציפראז לתוך הסופרנטנט. לאחר מכן אוספים את הסופרנט מהתרביות ומצינורות המיקרו והצנטריפוגה ב-17,000 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי להסיר פסולת תאית, ערבבו 20 מיקרוליטר מכל סופרנט עם 50 מיקרוליטר של מגיב בדיקת גאוסי לוציפראז, ומדדו את הזוהר מפעילות מדווח הלוציפראז בלומינומטר.

על פי הוראות היצרן ללוחית בדיקת החיבור הנגיפי, אחת כפול 10 לתאים הרביעיים לכל באר. בצלחת 96 בארות ודגירה למשך הלילה לחיבור תאים למחרת בבוקר. ראשית, צלחת 96 הבארות המכילה את שכבת התא בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה.

הכינו את תרכובות הבדיקה ותערובת הנגיפים על קרח. לדוגמה, H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1% DMSO או תמיסות HCV Heparin בקרה חיובית עם 10 לנגיף FFU השני. לכל טיפול יש לשאוב היטב את המדיום מבארות תרבית התאים בעדינות.

לאחר מכן מוסיפים מיד 100 מיקרוליטר של תערובת תרכובות בדיקת וירוסים בבארות משולשות, תוך הקפדה לא להעלות את הטמפרטורה. דגרו את הצלחת במקרר שנשמר בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. חלקיקי הנגיף יתחברו לשירות התא בארבע מעלות צלזיוס, אך לא יופנמו.

לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנטים. שוטפים בעדינות את התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר קר כקרח. PBS מוסיפים 100 מיקרוליטר של מדיום בסיסי לכל באר, ולאחר מכן דוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.

לבסוף, לכימות מדווח הלוציפראז השחרור מהתאים הנגועים. אספו היטב את הסופרנט מכל דגימה ובצעו את בדיקת לוציפראז גאוס לבדיקת איחוי וכניסה ויראליים. מצננים מראש את צלחת תרבית התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר הדגירה של הלילה לחיבור תאים, הסר את המדיום הקיים מהבארות והדביק את התאים ב-10 עד ה-F-F-U-H-C-V השני על קרח. דגרו את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. שטפו בעדינות את התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר PBS קר כקרח כדי להסיר את הנגיף שאינו נדבק למודעה.

לאחר מכן, על קרח, טפל בתאים עם תרכובות הבדיקה המומסות במדיום בסיסי או במדיום בסיסי עם 1% DMSO כבקרה ודגר את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. זה מאפשר הערכה של תרכובות הבדיקה בכניסה לנגיף, המתרחשת ב-37 מעלות צלזיוס. שאפו את המדיום ושטפו את הנגיפים הלא מופנמים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מאגר ציטראט או PBS.

מוסיפים 100 מיקרוליטר של מדיום בסיסי לבאר ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות נוספות. אסוף את הסופרנט ובצע את בדיקת לוציפראז גאוס כפי שהודגם קודם לכן לאיתור מדווח הלוציפראז המשוחרר המוצג להלן ההשפעות של תרכובות הבדיקה על HCV. בהפעלה, הנגיף הודגר עם תרכובות הבדיקה במשך אפס או שלוש שעות לפני ההדבקה.

אחוז העיכוב של זיהום ויראלי משורטט עבור כל טיפול. DMSO שלילי מבוקר אינו מראה עכבה. CHLA מפגין עיכוב גבוה במגע, לאחר הדגירה של שעת האפס, כמו גם לאחר הדגירה הארוכה יותר של שלוש שעות.

תוצאות נוספות בבדיקה נוספת. תרכובת PUG מוצגת כאן, תוך התאמה לתכנון ניסיוני כללי זה, CHLA ו-PUG הוכחו כמעכבים בנוסף את ההדבקה של ציטומגלווירוס אנושי או HCMV בפיברובלסטים ריאתיים עובריים. ההשפעה של CHLA ו-PUG על התקשרות HCV מוצגת כאן.

נזכיר כי התאים הודגרו עם הנגיף בנוכחות או בהיעדר תרכובות הבדיקה בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הסרת תאי הנגיף הלא קשורים הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס לצורך זיהום בנגיף. הפסים המוצללים מדגימים את ההשפעה של C-H-L-A-P-U-G או הפרין על כניסת HCV לתאים. שימו לב שבמקרה זה, ההתקשרות הנגיפית בוצעה לראשונה בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, לאחר הסרת הנגיף הלא קשור, התאים הודגרו בתרכובות בדיקה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לכניסה ויראלית. באופן דומה, במקרה של HCMV, זיהום בטיפול בפיברובלסטים ריאתיים עובריים ב-CHLA או PUG מראה עיכוב חזק של התקשרות ויראלית וכניסה ויראלית. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע את השלבים בטמפרטורה המצוינת, מה שישפיע על דיוק התוצאות.