פענוח ופתוגנזה הדמיה והשתרגות Abscessus Mycobacterium בעוברי דג הזברה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור ולהשוות את האלימות של זני Mycobacterium abscessus ולתאר את האינטראקציות בין חיידקים אלה למערכת החיסון המולדת של המארח in vivo באמצעות עוברי דג זברה שקופים. זה מושג על ידי הכנת חיסון חיידקי הומוגני תחילה. לאחר מכן, העוברים מוזרקים לווריד עם תרחיפי החיידקים 30 שעות לאחר ההפריה.

בנוסף, כדי לחקור בצורה מדויקת יותר את תפקידם של מקרופאגים בבקרת זיהום, נעשה שימוש בהליך הזרקה מבוסס ליפו צ'ואט ליצירת עוברים מדוללי מקרופאגים. לבסוף, העוברים הנגועים מוכנים ומצולמים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וקונפוקלית כדי לעקוב אחר התקדמות הזיהום. בסופו של דבר, התוצאות שניתן להשיג מראות את האינטראקציות הספציפיות בין התאים הפגוציטים הפלואורסצנטיים לבין מורסה M, כבסיסי בודד או כמיתרי סרפנטין בתוך עובר שקוף.

היתרון העיקרי של שימוש בדגי זברה על פני מודלים אחרים של חיות כמו עכברים הוא שהוא מאפשר לחקור באופן ספציפי את תהליך ההדבקה בזמן אמת ולחקור תמונה של האינטראקציות הספציפיות בין מורסות מיקרובקטריום למיקרופאג'ים או נויטרופילים. שלב זה הוא נושא קריטי ללחץ ההזרקה הבא בדג הזברה. בשל הנטייה הגבוהה של מיקובקטריום מורסה מחוספסת ליצור אגרגטים גדולים ולייצר קודים, לכן יש צורך בטיפול ספציפי להכנת מענית הומוגנית ומבוקרת כמותית לפני מיקרו-הזרקה.

להכנת מורסה, קציר מעיני גידול אקספוננציאלי של תרביות תרבית רקמות בגודל 150 סנטימטר רבוע לצינורות פלסטיק סטריליים של 50 מיליליטר וצנטריפוגה בטמפרטורה של 4, 000 פעמים G וטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. השתמש במיליליטר אחד של מידלברוק שבע H תשע, בתוספת העשרת OADC, בתוספת tween 80 המכונה להלן שבע H 9 בינוני כדי להשעות מחדש את הגלולה ו-Eloqua. 200 מיקרוליטר של תרחיפי החיידקים לצינורות של 1.5 מיליליטר עם מחט בגודל 26 הופכים כל רביעיית ALI של תרחיף חיידקים להומוגניזציה 15 פעמים.

לאחר מכן השתמש באמבט מים סוניקט סוניקט שלוש פעמים למשך 10 שניות כל אחת עם הפסקות של עשר שניות. בין לבין, הוסף מיליליטר אחד של שבעה H 9, מערבולת בינונית וקצרה, ואז צנטריפוגה ב-100 פעמים G למשך שלוש דקות. אסוף בזהירות את המיקובקטריות המכילות סופרנטנטים כדי למנוע גושים ומשוך את התרחיפים ההומוגניים בצינור פלסטיק סטרילי של 50 מיליליטר.

צנטריפוגה את התרחיף ב-4,000 פעמים G למשך חמש דקות והשתמש ב-200 מיקרוליטר של שבעה H תשע בינוני כדי להשעות מחדש את הגלולה להעריך את החיסון החיידקי הסופי. על פי פרוטוקול הטקסט, ההדגמה החזותית של שיטה זו, היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את השלבים מכיוון שהמניפולציה העדינה המדויקת של ההזרקה בעוברי דג הזברה תחת המיקרוסקופ כמו גם רכישת טכניקת המיקרו-הזרקה דרשו זמן לביצוע מיקרו-הזרקה של מורסה M לאחר כ-24 שעות. לאחר ההפריה או HPF, השתמש בפינצטה כדי לצפות עוברים בצלחת פטרי של 100 מילימטר ולשמור אותם בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס.

העבירו 30 48 עוברי HPF לתא מיקום בצורת V מלא ב-25 מיליליטר מי דגים המכילים 270 מיליגרם לליטר טריקה עם קצה מיקרו מעמיס קצוץ. הניחו את העוברים כראוי בתעלות למניפולציה קלה יותר. השתמש ב-PBST עם 0.05% בין 80 כדי לדלל את החיסון המיקרובקטריאלי ל-CFU הרצוי שיימסר ולכלול 10% פנול אדום כדי לבדוק הזרקה נכונה עם קצה מיקרו-מעמיס.

טען מחט מיקרו-הזרקה עם חמישה עד 10 מיקרוליטר של החיסון החיידקי. חבר את מחט המיקרו-הזרקה למחזיק של מניפולטור מיקרו המחובר למזרק, והשתמש בפינצטה עדינה כדי לנתק את החלק העליון של המחט. כדי להשיג קוטר פתיחה של חמישה עד 10 מיקרומטר.

כייל את נפח ההזרקה על ידי התאמת לחץ וזמן המיקרו-הזרקה. לאחר מכן כדי להשיג את נפח ההזרקה הנדרש, מדוד את קוטר הטיפה שנפלטת לחלמון של עובר אחד כדי להזריק מיקרו לווריד הקיפוד. מקם את העובר כשהצד הגחוני פונה למחט והנח את קצה המחט קרוב לפתח האורוגניטל.

ודחפו בעדינות את קצה המחט לתוך העובר עד שהוא פשוט חודר את אזור וריד הקיפוד. לאחר מכן ספק את הנפח הרצוי של תרחיף חיידקים, בדרך כלל אחד עד שלושה ננוליטר המכילים כ-100 CFUs לננו-ליטר. דגירה ומעקב אחר העוברים על פי פרוטוקול הטקסט לביצוע שומן Choate, דלדול מקרופאגים ועוברים ב-24 HP. הגורל, העוברים, ומעבירים אותם לצלחת הזרקה מלאה במי דגים עם טריקה.

לאחר מכן כוון אותם לצד הגב כלפי מטה. לאחר מערבולת תמיסת הקלודרונאט העטופה בליפוזום, טען את המחט המיקרו נימית וכייל את נפח ההזרקה. חודרים את אזור הוורידים כפי שהודגם קודם לכן, ומזריקים שניים עד שלושה ליטרים של תמיסה.

חזור על ההזרקה שלוש פעמים. דגרו על העוברים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס והשתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לשלוט בדלדול התקין של מקרופאגים לפני ההדבקה. כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה כדי לספור יחידות יוצרות מושבה או CFUs בנקודת הזמן הרצויה.

אסוף חמישה עוברים לכל מצב זיהום והעביר כל עובר לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. קריו מרדים את העוברים על ידי דגירה על קרח למשך 10 דקות לאחר המתת חסד של העוברים עם 300 עד 500 מיליגרם לליטר. טריקה. השתמש במים סטריליים כדי לשטוף את העוברים פעמיים בצינור חדש.

לאחר מכן, לאחר הסרת מים ב-2% טריטון X 100 ב-XPBS אחד לכל עובר, והשתמש במחט בגודל 26 כדי להומוגניזציה של הרקמה לליזה מלאה. לאחר צנטריפוגה של המתלים, השתמש ב-X-P-B-S-T אחד כדי להשעות מחדש את הגלולה. ואז דילול סדרתי של הצלחת של ההומוגני במידלברוק שבע H 10 OADC.

בתוספת B-B-L-M-G-I-T פנטה דגרה על הצלחות ב-30 מעלות צלזיוס במשך ארבעה ימים לפני ספירת המושבות להדמיה חיה של זיהום מורסה M, הר טריקה עוברים מורדמים בנקודת התכה נמוכה של 1% בצלחת פטרי תחתית זכוכית 35 מילימטר למיקרוסקופ הפוך או שקופית שקע חלל בודדת למיקרוסקופיה קונפוקלית זקופה. כוון את העובר למיקום הרצוי וכסה את הארוס המוצק במי דגים המכילים טריקה להדמיה קבועה של זיהום מורסה M. לאחר המתת חסד של העוברים, העבירו אותם לצינורות מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, וקבעו את העוברים באלדהיד 4% Paraform ב-X-P-B-S-T אחד למשך שעתיים.

בטמפרטורת החדר, הסר את האלדהיד הפרפורם על ידי שטיפת העוברים פעמיים עם X-P-B-S-T אחד למשך 10 דקות כדי לשמור על שלמות הרקמות והפלואורסצנטיות ברציפות. דגרו על העוברים בריכוזים הולכים וגדלים של תמיסת גליצרול למשך 10 דקות לכל מצב. הנח את העובר המוטבע ב-50% גליצרול בתא צפייה.

לבסוף, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מטרה של פי 10 או במיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי עם מטרות של 40 x או 63 x לרכישת פלואורסצנטיות רציפה והדמיית שידור של העובר. כדי לחקור ולהשוות את האלימות של גרסאות מורסה M מחוספסות וחלקות, חיידקים פלואורסצנטיים הוזרקו תוך ורידי ב-30 עוברים מיומנים ב-HPFC. בניגוד לווריאנט החלק, המחוספס גורם לזיהום חזק וקטלני יותר עם התפתחות מורסות במערכת העצבים המרכזית.

ההבדלים באלימות כומתו על ידי ספירת ה-CFU, או על ידי קביעת ספירת הפיקסלים הפלואורסצנטיים המתואמים. זה מצביע על עומסי חיידקים גבוהים יותר עבור הגרסה הגסה כפי שניתן לראות באיור זה, ניתן לנטר ולדמות את הקינטיקה של היווצרות חוט הכבל על ידי מיקרוסקופ וידאו בצורה לא פולשנית, מה שמדגים את הנטייה של הגרסה הגסה להשתכפל מחוץ לתאי כפי שמוצג כאן. הדבקה של עוברים מדוללי מקרופאגים עם מורסת M מחוספסת מובילה לעלייה מסיבית בעומסי החיידקים ובייצור חבל הטבור ולמוות מהיר של הזחלים.

זה מצביע בבירור על כך שמקרופאגים נדרשים לשלוט בזיהום מורסה M כדי לצפות בזמן אמת באינטראקציות בין מקרופאגים למורסה M. ניתן להשתמש בקו הטרנסגני של דובדבן EG one M המייצר מקרופאגים פלואורסצנטיים אדומים. זיהומים גורמים לגיוס ניכר של מקרופאגים עם פגוציטוזיס יעיל של חיידקים בודדים, בעוד שמיתרי מיקובקטריאליים מייצגים אסטרטגיה שפותחה על ידי מורסות כדי להימנע מפגוציטוזציה לאחר התפתחותה.

טכניקה זו סללה את הדרך לחקור את התפקיד החשוב של קידוד כמנגנון חדש של התחמקות חיסונית. הודות לשומה הזיהום של דג הזברה, ניתן כעת להתבונן ולתאר את התרומה in vivo של קודים בפתוגנזה של מורסות מיקובקטריום.