Name: הכנת הברים מועשר מיטוכונדריאלי לניתוח חילוף חומרים ב דרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: למדו שיטה לבידוד מיטוכונדריות מועשרות מ-Drosophila melanogaster באמצעות הומוגניזציה וסחיפה דיפרנציאלית. שיטה זו מאפשרת זיהוי רגיש יותר של שינויים מטבוליים מיטוכונדריאליים לעומת ניתוח של כל הזבוב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק פיתוח הפקולטה של אוניברסיטת אדלפי ומענק R15GM113156 מ-NIGMS שהוענקו ל-EVC, R01GM067862 מענק מ-NIGMS ומענק R01AG027849 מ-NIA שהוענקו ל-DMR.

1. ריאגנטים ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מזון זבוב ותקשורת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכיבים לטוס חום סוכר 11%, 2% שמרי autolyzed, קמח תירס 5.2%, אגר 0.79% w / v במים בפלטה חשמלית נקבעה על 90 מעלות צלזיוס. מערבבים באופן קבוע עד לקבלת תערובת הומוגנית מעט צפופה מתקבלת. הכן נפח סופי של 550 מיליליטר של אוכל לטוס לסך של 5 עם 100 בקבוקוני מ&quot;ל לטוס מזון בכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים ממקור החימום, מערבבים מדי פעם עד שהאוכל מתקרר עד 80 מעלות צלזיוס ומוסיף 0.2% tegosept-מתיל 4 hydroxybenzoate-מומס באתנול 95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפצל את האוכל בשני כרכים שווים. להוסיף 1.1 מיליליטר של 50 מ&quot;מ Rapamycin מומס באתנול לכרך אחד ו1.1 מיליליטר של אתנול להיקף האחר. מערבבים את rapamycin ופתרוני אתנול למזון. הקפד שהטמפרטורה יורדת ל -50 מעלות צלזיוס לפני הוספת תרופות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד מאגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 מיליליטר של בידוד הצפת [225 מ&quot;מ מניטול, 75 מ&quot;מ סוכרוז, 10 מ&quot;מ 3 (N &lt;/ Em&gt; -morpholino) חומצת propanesulfonic (מגבים) וחומצת 1 מ&quot;מ ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 2.5 מ&quot;ג / מיליליטר אלבומין בסרום שור (BSA)] במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH 7.2 באמצעות נתרן הידרוקסידי. PH הראשוני יהיה חומצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בבקבוקי אחסון סינון סטרילי עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר לעקר פתרון ולאחסן אותו על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצפת לשטוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 מיליליטר של חיץ לשטוף [225 מ&quot;מ מניטול, 75 מ&quot;מ סוכרוז, 10 מ&quot;מ KCl, 10 מ&quot;מ טריס HCl ו -5 מ&quot;מ KH PO 2 4] במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH 7.2 באמצעות נתרן הידרוקסידי. PH הראשוני יהיה חומצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בבקבוקי אחסון סינון סטרילי עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר לעקר פתרון ולאחסן אותו על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2. גידול של זני דרוזופילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשלוט בצפיפות זחל במהלך פיתוח, מקום 25 זוגות של הורים לבקבוק תרבות ולאפשר להם להטיל ביצים במשך 48 שעות. </li> &lt;li&gt; הסרת הורים לאחר 48 שעות להסדיר צפיפות ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.1 ו -2.2 שימוש בצאצאי F1 מתעוררים, כך שני דורות של שליטה בצפיפות זו מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף מבוגרים, להרדים את הזבובים באמצעות פחמן דו חמצני (CO 2) ונפרדים לפי מין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ברגולטור שלב אחד לCO הטהור נמסר 2 מטנק גבוה בלחץ בזרימה רציפה של 5 psi. כדי למנוע חשמל סטטי, להשתמש צינורות פלסטיק לזרז CO 2 לסינון בקבוק 500 מיליליטר עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפקק גומי עם חור אחד לאטום את הבקבוק. השתמש בצינורות פלסטיק כדי לחבר את הצמצם לרוחב של הבקבוק לכרית CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הזבובים בפנקס ללא יותר מ 10-15 דקות. לאפשר להתאושש מהרדמה למשך 24 שעות לפני הצבתם בתנאי ניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור מספיק מטבוליטים לשברים מועשר במיטוכונדריה, להשתמש 300 זבובים לדגימה. הנה, להשתמש נקבות, אבל עדיןr עשוי להיות שונה בניסויים אחרים. העבר את 150 זבובים לכלוב דמוגרפיה 1 ליטר תוצרת בית. לאפשר גישה ל5 מיליליטר של אוכל לטוס בבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 150 הזבובים שנותר לעוד כלוב 1 ליטר. אל overpopulate כלובים עם יותר מ -150 זבובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשש דגימות לשכפל לתנאי ניסוי. מאז תמציות בעלי חיים שלמות להניב יותר מטבוליטים, כדי ליצור מדגם 1 של כל בעלי החיים מבודד, להעביר 50 נקבה עפה לכלוב אחד. באשר למבודד במיטוכונדריה, להשתמש שש דגימות לשכפל לתנאי ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלובי מקום במהירות של 25 מעלות צלזיוס עם מחזור של 12 שעות אור וחושך 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק מזון טרי כל 2 או 3 ימים בבקבוקון עם 5 מיליליטר של מזון כדי לשמור על איכות מזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על זבובים על מזון במשך 10 ימים. צעד זה נחוץ לטיפול rapamycin 7. טיפולים או מצבים אחרים יהיו שונים. </li></ol> 3. בידוד של שברי מיטוכונדריאלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזבלה עפה מכלוב אחד (150 זבובים) לhomogenizer dounce זכוכית טפלון מלא 1 מיליליטר של חיץ בידוד מצונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize ידי הזזת העלי למעלה ולמטה במשך 15 משיכות. שמור מרגמה על קרח כדי לשמור על שלמות מיטוכונדריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההעברה homogenate לצינור 1.5 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את supernatant ו צנטריפוגות ב6,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להעשיר למיטוכונדריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כsupernatant מכיל חלק cytosolic, לבטל את supernatant או להשתמש בו לניסויים חלופיים. Resuspend גלולה ב300 μl של חיץ לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1-3.5 לכלוב השני. מערבבים את כדורי resuspended של שני הכלובים בצינור microcentrifuge קריוגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 6000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ופלאש להקפיא את גלולה בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את השברים המועשר המיטוכונדריה ב -80 ° C או בטמפרטורה נמוכה יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לבעלי חיים שלפני כלparation, למקם את המבוגרים בצינור microcentrifuge קריוגני. פלאש-להקפיא את הבקבוקון במבוגרים חנקן נוזלים חנות ב -80 ° C או בטמפרטורה נמוכה יותר. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Scheffler, I. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScheffler%2C+IE+%22Mitochondria+%28Scheffler%2C+Mitochondria%29%22">Mitochondria (Scheffler, Mitochondria)</a>. , Wiley-Liss. 484(2007).</li>
<li>Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria--a+nexus+for+aging%2C+calorie+restriction%2C+and+sirtuins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins.</a> Cell. 132 (2), 171-176 (2008).</li>
<li>Raimundo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+pathology%3A+stress+signals+from+the+energy+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory.</a> Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).</li>
<li>Embley, T. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+evolution%2C+changes+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic evolution, changes and challenges.</a> Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).</li>
<li>Lane, N., , <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+N+%22Power%2C+Sex%2C+Suicide%3A+Mitochondria+and+the+Meaning+of+Life%22">Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life</a>. 368, Oxford University Press. USA. (2006).</li>
<li>Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial-nuclear+epistasis+affects+fitness+within+species+but+does+not+contribute+to+fixed+incompatibilities+between+species+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%3B+international+journal+of+organic+evolution%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila.</a> Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).</li>
<li>Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+increases+mitochondrial+efficiency+by+mtDNA-dependent+reprogramming+of+mitochondrial+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila.</a> Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).</li>
<li>Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%C3%97G%C3%97E+for+Lifespan+in+Drosophila%3A+Mitochondrial%2C+Nuclear%2C+and+Dietary+Interactions+that+Modify+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity.</a> PLoS genetics. 10 (5), e1004354(2014).</li>
<li>Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+statistical+models+of+metabolomic+data+reveals+different+metabolite+distribution+patterns+in+isonitrosoacetophenone-elicited+Nicotiana+tabacum+and+Sorghum+bicolor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22SpringerPlus%22%5BJournal%5D)">Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells.</a> SpringerPlus. 3, 254(2014).</li>
<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+Studies+Of+Mammalian+Tissues+I+.+Isolation+Of+Intact+Mitochondria+From+Rat+Liver+Some+Biochemical+Properties+Of+Mitochondria+And+Submicroscopic+Particulate+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material.</a> Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).</li>
<li>Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+isolated+in+nearly+isotonic+KCl+buffer%3A+focus+on+cardiolipin+and+organelle+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology.</a> Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).</li>
<li>Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+mitochondrial+phenotyping+by+high+resolution+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics.</a> PloS one. 7 (3), e33020(2012).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם: 1) גידול מספיק זבובים בחלל בשפע. זה מאוד חשוב שלא לגרום להתפוצצות אוכלוסין כלובי דמוגרפיה עם יותר מ -150 זבובים כל אחד; 2) שינוי המזון של הכלובים לעתים קרובות כדי למנוע תחרות מזון ומתח תזונתי; ו 3) שמירה על כל הדגימות ב 4 ° C כדי להבטיח את השלמות בבידוד של חלק המיטוכונדריה. מומלץ גם לצנן את חיץ הבידוד, לשטוף חיץ, וhomogenizer dounce זכוכית הטפלון לפני השימוש. כדי להפחית את זיהום cytosolic של פלגי המיטוכונדריה המועשר, גלולה המיטוכונדריה מצעד 3...

המטרה של הליך זה היא לפתח שברים המיטוכונדריה מועשרות שיניבו מספיק מטבוליטים המיטוכונדריה ללימודי metabolomics באמצעות melanogaster תסיסנית. מניסיוננו, metabolomics ניתוח תוך שימוש בשיטות מיצוי סלולארי כל אינם מסוגלים לזהות שינויי המטבוליט המיטוכונדריה עדינים בדרוזופילה. עם זאת, fractioning המיטוכונדריה לפני ניתוח metabolomics מגביר את הרגישות לזהות משמרות המטבוליט המיטוכונדריה. המיטוכונדריה הם אברונים תאיים אחראים על מתן 90% מהאנרגיה שתאים צריכים לתפקוד נורמלי 1. בשנים האחרונות זה כבר הכיר בכך שהמיטוכונדריה לשחק הרבה יותר דינמי תפקיד בתפקוד תאי והאורגניזם מאשר רק ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP), וכעת הם מוכרים כרכזות להסדרת 2,3 הומאוסטזיס חילוף חומרים. המיטוכונדריה הוא התוצאה של תהליך שבו endosymbiotic דיסשושלות חיידקי tinct התמזגו ~ לפני 1.5 מיליארדים שנים 4. כמיטוכונדריה התפתחה לאברונים אמיתיים, גנים מאנדוסימביוזה שולבו בגנום הגרעיני המתפתח. בבעלי חיים היום, כ -1,500 חלבוני המיטוכונדריה הם בקידוד גרעיניים תוך 37 גנים להישאר בmtDNA, 13 מהם לקודד חלבוני המיטוכונדריה שהם תת-יחידות של מתחמי האנזים של זרחון חמצוני 5. יש צורך בתיאום בין המיטוכונדריה ותאים גרעיניים כדי לשמור על תפקוד המיטוכונדריה נכון. שימוש בשיטות שתוארו כאן היינו מסוגל לזהות שינויים מטבוליים המיטוכונדריה בתסיסנית הנובעים ממניפולציה של התיאום בין הגנום המיטוכונדריאלי והגרעיני. אנחנו השתמשנו בזן של דרוזופילה בי mtDNA ממיני אחותה ד simulans הונח על ד בודד melanogaster רקע גרעיני 6. mitonuclear &#39;שיבש&#39; זהגנוטיפ הושווה לגנוטיפ mitonuclear &#39;הילידים&#39;, או-התפתח שיתוף של ד melanogaster נושא את אותו הגנום גרעיני עם ד המקורי שלו melanogaster mtDNA. ד melanogaster וד &#39; simulans mtDNAs שונה על ידי ~ 100 חומצות אמינו ו&gt; 500 החלפות נרדפים המשפיעות 7,8 תקשורת mitonuclear. אנחנו שנוצרנו תמציות לטוס כל ותמציות מועשרות המיטוכונדריה ללמוד משמרות המטבוליט בתגובה ללחץ תרופתי. כאן אנו מראים כי בעת שימוש שבברי המיטוכונדריה המועשרת לזהות שינויים בולטים במטבוליטים המיטוכונדריה בין גנוטיפ נשא ד הילידים, התפתח-שיתוף mtDNAs melanogaster וגנוטיפ שיבש נשא ד simulans mtDNA. לעומת זאת, שינויי המטבוליט בין שני גנוטיפים אלה הם עדינים תוך שימוש בשיטות רגילות לנצל תמצית לטוס כולה. לכן, שיטה זו סיפקה דרך להבין כיצד mtDNAs לתווך שינויי המיטוכונדריה בתגובה לתרופות שונות.

<table><tbody><tr><td>0.2% טגוספט מתיל 4-הידרוקסיבנזואט</td><td>VWR</td><td>AAA14289</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>792799</td><td></td></tr><tr><td>מניטול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-מורפולינו) חומצה פרופנסולפונית (MOPS)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M1254&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>38057&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES3098T-B7</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>CO2 רפידות להרדמת זבובים</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>1 ליטר כלוב</td><td>חנות מסעדה אינטרנט</td><td>999RD32</td><td></td></tr><tr><td>1 L מכסה כלוב</td><td>חנות מסעדה אינטרנט</td><td>999LRD</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר זכוכית-טפלון dounce&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC9661231</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>רפמיצין&nbsp;</td><td>מעבדות LC&nbsp;</td><td>R-5000</td><td></td></tr><tr><td>אנטי פורין</td><td>MitoSciences</td><td>MSA03</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אלפא טובולין</td><td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה</td><td>12G10</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA ערכת בדיקת חלבון&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp;</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>CO2 כרית</td><td>Tritech Research, Inc</td> בקבוק מסנן <td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>SB08184M</td><td></td></tr><tr><td>פקק גומי</td><td>S08512M</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת הברים מועשר מיטוכונדריאלי לניתוח חילוף חומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

מכיוון שהמיטוכונדריה ממלאים תפקידים בחילוף החומרים של חומצות אמינו, חילוף החומרים של פחמימות וחמצון חומצות שומן, פגמים בתפקוד המיטוכונדריה מסכנים לעתים קרובות את חייהם של הסובלים ממחלות מורכבות אלה. זיהוי שינויים מטבוליים במיטוכונדריה חיוני להבנת הפרעות מיטוכונדריאליות ותגובות מיטוכונדריאליות לגורמים פרמקולוגיים. למרות שהמטבוליזם המיטוכונדריאלי הוא הליבה של הבקרה המטבולית, זיהוי שינויים עדינים במטבוליזם המיטוכונדריאלי עלול להיות מעוכב על ידי ייצוג יתר של מטבוליטים ציטוזוליים אחרים המתקבלים באמצעות מיצוי אורגניזם שלם או רקמה שלמה. 
כאן אנו מתארים שיטת בידוד שזיהתה שינויים מטבוליים מיטוכונדריאלים בולטים בדרוזופילה שהיו נבדלים בין תכשירים מועשרים בזבוב שלם לתכשירים מועשרים במיטוכונדריה. כדי להמחיש את הרגישות של שיטה זו, השתמשנו בקבוצה של דרוזופילה המכילה DNA מיטוכונדריאלי מגוון גנטי (mtDNA) וחשפנו אותם לתרופה רפמיצין. באמצעות שיטה זו הראינו כי רפמיצין משנה את חילוף החומרים המיטוכונדריאלי באופן תלוי במיטוכונדריה-גנוטיפ. עם זאת, שינויים אלה מובחנים הרבה יותר במחקרי מטבולומיקה כאשר מטבוליטים הופקו משברים מועשרים במיטוכונדריה. לעומת זאת, תמציות רקמות שלמות זיהו רק שינויים מטבוליים בתיווך התרופה רפמיצין ללא תלות ב-mtDNA.

שימוש בפרוטוקול שהוסבר לעיל, ביצענו ניתוח metabolomic על שברים מועשרות המיטוכונדריה ותמציות בעלי חיים שלמות כדי לבדוק את ההשפעה של התרופה על Rapamycin mtDNAs מסתעף 7. אנו נמסרו 200 מיקרומטר של rapamycin ידי המסת התרופה במזון הזבוב. זבובים נחשפו לRapamycin במשך 10 ימים. מטבוליטים מתמציות לטוס כל ומתמציות המיטוכונדריה התקבלו על ידי שימוש בספקטרומטר מסת גז כרומטוגרפיה (GC / MS) וספקטרומטריית כרומטוגרפיה הנוזלית-טנדם מסה (LC / MS / MS) ...

מיטוכונדריה ממלאים תפקידים מרכזיים בוויסות חילוף החומרים וההומאוסטזיס. שינויים עדינים במטבוליזם המיטוכונדריאלי המשפיעים על הפיזיולוגיה של האורגניזם עשויים להיות קשים לאיתור במחקרי מטבולומיקה של אורגניזמים שלמים. כאן אנו מתארים שיטת בידוד המשפרת את הזיהוי של שינויים מטבוליים עדינים בדרוזופילה מלנוגסטר.

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשיג פראקציות מיטוכונדריאליות מועשרות שיספקו מספיק מטבוליטים מיטוכונדריאליים למחקרי מטבוליקה באמצעות drosophila melanogaster. מטרה זו מושגת תחילה על ידי גידול כמות מספקת של זבובים כדי לייצר מספיק מטבוליטים עבור הפראקציות המועשרות במיטוכונדריה. כשלב שני, הזבובים עוברים הומוגניזציה בתוך הומוגנייזר זכוכית-טפלון מסוג Downs, המפרק את הממברנה התאית מבלי לפגוע בשלמות המיטוכונדריה.בשלב הבא, ההומוגנאטים עוברים סרטיפוגציה דיפרנציאלית על מנת להפיק דגימות עשירות במיטוכונדריה. התוצאות מראות כי באמצעות פרוטוקול זה זוהו שינויים מטבוליים מיטוכונדריאליים בולטים, שלא זוהו בניתוח מטבוליקה שהתבסס כולו על פראקציות מועשרות במיטוכונדריה ועל תמציות של בעלי חיים שלמים. היתרון המרכזי של הליך זה לעומת ניתוח מטבוליקה של זבוב שלם הוא שבידוד המיטוכונדריה לפני הניתוח המטבולי מאפשר רגישות מוגברת וזיהוי של שינויים במטבוליטים מיטוכונדריאליים.כדי להתחיל בניסוי, חממו את מרכיבי מזון הזבובים על פלטה חשמלית בטמפרטורה של 90 °C. ערבבו את התערובת באופן קבוע עד שתהיה הומוגנית וסמיכה מעט. הסירו את המזון ממקור החום וערבבו אותו מדי פעם כאשר המזון יתקרר ל-80 °C; הוסיפו 0.2%TE decept methyl four hydroxy benzoate המומס ב-95%Ethanol, ולאחר מכן חלקו את המזון לשני נפחים שווים.יש לוודא שטמפרטורת המזון ירדה ל-50 °C ולהוסיף תוך כדי ערבוב 1.1 ml של rapamycin בריכוז 50 mM המומס באתנול לנפח אחד, ו-1.1 ml של אתנול ללא טיפול לנפח השני. לאיסוף הבוגרים, השתמשו בווסת שלב אחד להזרמת פחמן דו-חמצני טהור ממכל בלחץ גבוה. בזרימה רציפה של 5 PS, אני מונע חשמל סטטי על ידי שימוש בצינור פלסטיק להזרמת הפחמן הדו-חמצני לתוך בקבוק סינון בנפח 500 ml, עם צינורית להזרמת הגז דרך מים.לשם כך, השתמשו בפקק גומי בעל חור אחד כדי לאטום את הבקבוק. חברו צינור פלסטיק מהפתח הצדדי של הבקבוק לכרית פחמן דו-חמצני (carbon dioxide pad) כדי לשלוט בצפיפות הזחלים במהלך ההתפתחות. העבירו 25 זוגות הורים לבקבוק תרבית ואפשרו להם להטיל ביצים במשך 48 שעות.לאחר מכן, הסיר את ההורים כדי לווסת את צפיפות הביצים וחזור על שלבים אלו באמצעות צאצאי ה-F1 הבוקעים, כדי להשיג שני דורות של בקרת צפיפות זו. לאחר שני דורות בתנאים של בקרת צפיפות, הפרד את הזבובים לפי מין, תוך הנחת הזבובים על הפד למשך 10 עד 15 דקות לכל היותר. אפשר לזבובים להתאושש מההרדמה במשך 24 שעות לפני העברתם לתנאי הניסוי.הקצו 300 זבובים לכל דגימה כדי להפיק מספיק מטבוליטים עבור פראקציות מועשרות במיטוכונדריה. העבירו 150 זבובים לכלוב ביתי של ליטר אחד. לאחר מכן, העבירו את 150 הזבובים הנותרים לכלוב נפרד של ליטר אחד; אין להעמיס על הכלובים יותר מ-150 זבובים.השתמשו בשישה דגימות חוזרות לכל תנאי ניסויי והניחו את הכלובים בטמפרטורה של 25 degrees Celsius במחזור של 12 שעות אור וחושך להשלמת גידול ה-drosophila. ספקו לזבובים מזון טרי מדי יומיים או שלושה בתוך מבחנה עם 5 milliliters של מזון כדי לשמור על איכות המזון למשך 10 ימים בסך הכל. התחילו את הבידוד על ידי העברת הזבובים מכלוב אחד אל הומוגנייזר זכוכית עם ציפוי Teflon המלא ב-1 milliliter של בופר בידוד מקורר.בשלב הבא, הניחו מכתש על קרח כדי לשמור על שלמות המיטוכונדריה, והומוגניזו את הזבובים באמצעות 15 תנועות ריסוק. העבירו את ההומוגנאט למבחנה של 1.5 milliliter תוך הקפדה לא לסובב את העלי, וסובבו את המבחנה בנפח של 300 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. העבירו את העלי למבחנה אחרת וסובבו אותה בנפח של 6,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי להעשיר את ריכוז המיטוכונדריה.לאחר הצנטריפוגציה, השליכו את supernatant המכיל את הפראקציה הציטוזולית. השביו את המשקע ב-300 microliters של בופר שטיפה באמצעות פיפוט למעלה ולמטה. חזרו בעדינות על השלבים הקודמים עבור המחזור השני.לאחר מכן, שלבו את המשקעים שהושחאו משני הכלובים במבחנת מיקרו-צנטריפוגה קריוגנית וסובבו את המשקעים המאוחדים במהירות של 6,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. השליכו את הנוזל העליון (supernatant) והקפיאו את המשקע בהקפאה מהירה בחנקן נוזלי. לבסוף, אחסנו את הפראקציות המועשרות במיטוכונדריה בטמפרטורה של 80- °C.תמונת western blot זו מציגה העשרה של חלבון הובלת ממברנת המיטוכונדריה poin, המשמש כאינדיקטור להפרדה יעילה של מיטוכונדריה בפרקציות מיטוכונדריאליות. חלבון Poin אינו ניתן לגילוי בפרקציות ציטוזוליות, בעוד שחלבון tubulin, חלבון מיקרוטובולי ציטוזולי, אינו מזוהה בפרקציה המיטוכונדריאלית, מה שמעיד על זיהום מינימלי של חלבונים ציטוזוליים. ניתוחי רכיבים ראשיים או PCA הופקו באמצעות ערכים שהתקבלו מניתוח mass spec, אשר נורמלו לריכוז חלבון לפי שיטת Bradford, עברו טרנספורמציה לוגריתמית ונcutoff עם הערכים המינימליים שנצפו עבור כל תרכובת.תרשימי PCA הופקו באמצעות פרופילים מלאים של מטבוליטים. ניתן להשוות בין פרופילים של זני זבובים רגילים ופגומים, המבוססים על מטבוליטים של mtDNA שהושגו באמצעות תמצית סטנדרטית של זבוב שלם, לבין תרשים PCA של מטבוליטים מתמציות עשירות במיטוכונדריה. פרופילי המטבוליטים של הזבוב השלם נפרדים בבירור לאורך ציר PC 2 ומשקפים את ההשפעות העיקריות של הטיפול ב-rapamycin. קיימים הבדלים קלים בלבד בין הגנוטיפים החלופיים של mtDNA.בניגוד לכך, פרופילי המטבוליטים מתמציות מועשרות במיטוכונדריה מראים הפרדה בין הגנוטיפ M mt DNA הטבעי בתזונה רגילה לבין שלושת הדגימות האחרות: MTD NA הטבעי בטיפול ב-rapamycin, ו-MTD NA החלופי בתזונה רגילה או ב-rapamycin. מכאן ניתן להסיק כי ההשפעה של MTD NA החלופי משנה את פרופילי המטבוליטים באופן הדומה להשפעות של טיפול ב-rapamycin. בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב ומומלץ לבצע את כל פעולות ההפרדה באותו היום, כדי להפחית את השונות בין החזרות.אני ממליץ להכין תוכנית מראש ולסמן את המבחנות, ולנהל רישום של זמני ההמתנה בין החזרות כדי לשפר את איכות הכנת הדגימות שלנו.

preparation-mitochondrial-enriched-fractions-for-metabolic-analysis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בסרטון הזה, אנו יראה לכם כיצד שרשרת הנשימה במיטוכונדריה קומפלקסים של בתאי גזע עובריים אנושיים יכולים להיות נותחו באמצעות מבחני פעילות ג'ל.

גשוש עבור פעילות קומפלקס מיטוכונדריאלי של בתאי גזע עובריים אנושיים

אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה לטיהור של המיטוכונדריה של...

טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים

הליך זה מדגים כיצד לבודד מהמוח המבוגר עכבר קרומי המיטוכונדריה או MAMs הקשורים ER וmicrodomain המועשרים glycosphingolipid השברים מMAMs ותכשירי המיטוכונדריה.

ממברנות המיטוכונדריה הקשורים ER (MAMs) וMicrodomains Glycosphingolipid המועשר (אובניים חן): בידוד ממוח עכבר

ניתוח הקשר בין מבנה המיטוכונדריה לתפקוד נדרש להבנה מעמיקה של מנגנוני הרגולציה של פונקציונליות המיטוכונדריה. שיטות ספציפיות לחקר המבנה והתפקוד המיטוכונדריאלי בשחלות דרוזופילה חיות וקבועות מתוארות ומודגמות במאמר זה.

לימוד מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי תסיסנית שחלות

ב פרוטוקול זה, נדגים היישום של אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה להבהיר את מבנה מיטוכונדריאלי בשריר טיסה עקיף דרוזופילה .

Ultrastructure מיטוכונדריאלי תלת-ממד של שריר טיסה עקיף דרוזופילה התגלה על ידי אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה

בנייר זה, מתוארת שיטה למדידת צריכת החמצן באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ב- thoraxes permeabilized של דרוזופילה. טכניקה זו דורשת כמות מזערית של רקמות לעומת הטכניקה בידוד מיטוכונדריאלי קלאסי, התוצאות המתקבלות רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

פרוטוקול זה מתאר כיצד להתכונן הרימות דרוזופילה metabolomic GC-MS מבוססי ניתוח.

הכנת דוגמאות זחל דרוזופילה עבור גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS)-מבוסס מטבולומיקס

אנו מציגים פרוטוקול למדידת צריכת החמצן ואת acidification חוץ-תאית במוח זחל ומבוגרים melanogaster דרוזופילה . מנתח חילוף החומרים מנוצל עם פרוטוקול מותאם וממוטב. מיקרו-רקמת ריסון הינם המכריעים של פרוטוקול זה, היו עיצבת ויצרת במיוחד לשימוש שלהם ניתוח זה.

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

למרות ההתקדמות האחרונה, חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים רבים עדיין נשארים עם הפונקציות שלהם לא ידוע לחלוטין. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial של חלבונים, אשר היה בסיסי עבור הפיהור של הפונקציות המולקולריות שלהם.

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת לבידוד המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר ואת הניתוח הבא של נשימה על ידי שיעור צריכת חמצן (OCR) באמצעות בדיקות respirometric מבוססות מיקרופלט. צינור זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות סביבתיות או גנטיות מרובות על חילוף החומרים המיטוכונדריאלי.

בידוד המיטוכונדריה משריר שלד העכבר לבדיקות ספירומטריות

כאן אנו מציגים פרוטוקול רספירומטריה ברזולוציה גבוהה לניתוח ביו-אנרגטיקה בזבובי פירות מוטנטיים מסוג PINK1B9-null. השיטה משתמשת בפרוטוקול Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

ניתוח תפקוד מיטוכונדריאלי במוטנט Drosophila melanogaster PINK1B9-Null באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

למדו שיטה לבידוד מיטוכונדריות מועשרות מ-Drosophila melanogaster באמצעות הומוגניזציה וסחיפה דיפרנציאלית. שיטה זו מאפשרת זיהוי רגיש יותר של שינויים מטבוליים מיטוכונדריאליים לעומת ניתוח של כל הזבוב.

הכנת הברים מועשר מיטוכונדריאלי לניתוח חילוף חומרים ב

גלה סרטונים נוספים