הכנת הברים מועשר מיטוכונדריאלי לניתוח חילוף חומרים ב

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשיג פראקציות מיטוכונדריאליות מועשרות שיספקו מספיק מטבוליטים מיטוכונדריאליים למחקרי מטבוליקה באמצעות drosophila melanogaster. מטרה זו מושגת תחילה על ידי גידול כמות מספקת של זבובים כדי לייצר מספיק מטבוליטים עבור הפראקציות המועשרות במיטוכונדריה. כשלב שני, הזבובים עוברים הומוגניזציה בתוך הומוגנייזר זכוכית-טפלון מסוג Downs, המפרק את הממברנה התאית מבלי לפגוע בשלמות המיטוכונדריה.

בשלב הבא, ההומוגנאטים עוברים סרטיפוגציה דיפרנציאלית על מנת להפיק דגימות עשירות במיטוכונדריה. התוצאות מראות כי באמצעות פרוטוקול זה זוהו שינויים מטבוליים מיטוכונדריאליים בולטים, שלא זוהו בניתוח מטבוליקה שהתבסס כולו על פראקציות מועשרות במיטוכונדריה ועל תמציות של בעלי חיים שלמים. היתרון המרכזי של הליך זה לעומת ניתוח מטבוליקה של זבוב שלם הוא שבידוד המיטוכונדריה לפני הניתוח המטבולי מאפשר רגישות מוגברת וזיהוי של שינויים במטבוליטים מיטוכונדריאליים.

כדי להתחיל בניסוי, חממו את מרכיבי מזון הזבובים על פלטה חשמלית בטמפרטורה של 90 °C. ערבבו את התערובת באופן קבוע עד שתהיה הומוגנית וסמיכה מעט. הסירו את המזון ממקור החום וערבבו אותו מדי פעם כאשר המזון יתקרר ל-80 °C; הוסיפו 0.2%TE decept methyl four hydroxy benzoate המומס ב-95%Ethanol, ולאחר מכן חלקו את המזון לשני נפחים שווים.

יש לוודא שטמפרטורת המזון ירדה ל-50 °C ולהוסיף תוך כדי ערבוב 1.1 ml של rapamycin בריכוז 50 mM המומס באתנול לנפח אחד, ו-1.1 ml של אתנול ללא טיפול לנפח השני. לאיסוף הבוגרים, השתמשו בווסת שלב אחד להזרמת פחמן דו-חמצני טהור ממכל בלחץ גבוה. בזרימה רציפה של 5 PS, אני מונע חשמל סטטי על ידי שימוש בצינור פלסטיק להזרמת הפחמן הדו-חמצני לתוך בקבוק סינון בנפח 500 ml, עם צינורית להזרמת הגז דרך מים.

לשם כך, השתמשו בפקק גומי בעל חור אחד כדי לאטום את הבקבוק. חברו צינור פלסטיק מהפתח הצדדי של הבקבוק לכרית פחמן דו-חמצני (carbon dioxide pad) כדי לשלוט בצפיפות הזחלים במהלך ההתפתחות. העבירו 25 זוגות הורים לבקבוק תרבית ואפשרו להם להטיל ביצים במשך 48 שעות.

לאחר מכן, הסיר את ההורים כדי לווסת את צפיפות הביצים וחזור על שלבים אלו באמצעות צאצאי ה-F1 הבוקעים, כדי להשיג שני דורות של בקרת צפיפות זו. לאחר שני דורות בתנאים של בקרת צפיפות, הפרד את הזבובים לפי מין, תוך הנחת הזבובים על הפד למשך 10 עד 15 דקות לכל היותר. אפשר לזבובים להתאושש מההרדמה במשך 24 שעות לפני העברתם לתנאי הניסוי.

הקצו 300 זבובים לכל דגימה כדי להפיק מספיק מטבוליטים עבור פראקציות מועשרות במיטוכונדריה. העבירו 150 זבובים לכלוב ביתי של ליטר אחד. לאחר מכן, העבירו את 150 הזבובים הנותרים לכלוב נפרד של ליטר אחד; אין להעמיס על הכלובים יותר מ-150 זבובים.

השתמשו בשישה דגימות חוזרות לכל תנאי ניסויי והניחו את הכלובים בטמפרטורה של 25 degrees Celsius במחזור של 12 שעות אור וחושך להשלמת גידול ה-drosophila. ספקו לזבובים מזון טרי מדי יומיים או שלושה בתוך מבחנה עם 5 milliliters של מזון כדי לשמור על איכות המזון למשך 10 ימים בסך הכל. התחילו את הבידוד על ידי העברת הזבובים מכלוב אחד אל הומוגנייזר זכוכית עם ציפוי Teflon המלא ב-1 milliliter של בופר בידוד מקורר.

בשלב הבא, הניחו מכתש על קרח כדי לשמור על שלמות המיטוכונדריה, והומוגניזו את הזבובים באמצעות 15 תנועות ריסוק. העבירו את ההומוגנאט למבחנה של 1.5 milliliter תוך הקפדה לא לסובב את העלי, וסובבו את המבחנה בנפח של 300 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. העבירו את העלי למבחנה אחרת וסובבו אותה בנפח של 6,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי להעשיר את ריכוז המיטוכונדריה.

לאחר הצנטריפוגציה, השליכו את supernatant המכיל את הפראקציה הציטוזולית. השביו את המשקע ב-300 microliters של בופר שטיפה באמצעות פיפוט למעלה ולמטה. חזרו בעדינות על השלבים הקודמים עבור המחזור השני.

לאחר מכן, שלבו את המשקעים שהושחאו משני הכלובים במבחנת מיקרו-צנטריפוגה קריוגנית וסובבו את המשקעים המאוחדים במהירות של 6,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. השליכו את הנוזל העליון (supernatant) והקפיאו את המשקע בהקפאה מהירה בחנקן נוזלי. לבסוף, אחסנו את הפראקציות המועשרות במיטוכונדריה בטמפרטורה של 80- °C.

תמונת western blot זו מציגה העשרה של חלבון הובלת ממברנת המיטוכונדריה poin, המשמש כאינדיקטור להפרדה יעילה של מיטוכונדריה בפרקציות מיטוכונדריאליות. חלבון Poin אינו ניתן לגילוי בפרקציות ציטוזוליות, בעוד שחלבון tubulin, חלבון מיקרוטובולי ציטוזולי, אינו מזוהה בפרקציה המיטוכונדריאלית, מה שמעיד על זיהום מינימלי של חלבונים ציטוזוליים. ניתוחי רכיבים ראשיים או PCA הופקו באמצעות ערכים שהתקבלו מניתוח mass spec, אשר נורמלו לריכוז חלבון לפי שיטת Bradford, עברו טרנספורמציה לוגריתמית ונcutoff עם הערכים המינימליים שנצפו עבור כל תרכובת.

תרשימי PCA הופקו באמצעות פרופילים מלאים של מטבוליטים. ניתן להשוות בין פרופילים של זני זבובים רגילים ופגומים, המבוססים על מטבוליטים של mtDNA שהושגו באמצעות תמצית סטנדרטית של זבוב שלם, לבין תרשים PCA של מטבוליטים מתמציות עשירות במיטוכונדריה. פרופילי המטבוליטים של הזבוב השלם נפרדים בבירור לאורך ציר PC 2 ומשקפים את ההשפעות העיקריות של הטיפול ב-rapamycin. קיימים הבדלים קלים בלבד בין הגנוטיפים החלופיים של mtDNA.

בניגוד לכך, פרופילי המטבוליטים מתמציות מועשרות במיטוכונדריה מראים הפרדה בין הגנוטיפ M mt DNA הטבעי בתזונה רגילה לבין שלושת הדגימות האחרות: MTD NA הטבעי בטיפול ב-rapamycin, ו-MTD NA החלופי בתזונה רגילה או ב-rapamycin. מכאן ניתן להסיק כי ההשפעה של MTD NA החלופי משנה את פרופילי המטבוליטים באופן הדומה להשפעות של טיפול ב-rapamycin. בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב ומומלץ לבצע את כל פעולות ההפרדה באותו היום, כדי להפחית את השונות בין החזרות.

אני ממליץ להכין תוכנית מראש ולסמן את המבחנות, ולנהל רישום של זמני ההמתנה בין החזרות כדי לשפר את איכות הכנת הדגימות שלנו.