Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית עם bimolecular פלואורסצנטי השלמה (BiFC-PALM)

המטרה הכוללת של טכניקת מיקרוסקופיה זו היא לדמיין אינטראקציות חלבון, חלבון בקנה מידה של מולקולה בודדת וננומטר. לכן שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על כמה שאלות מפתח בתחום הביולוגיה, כגון אינטראקציות מולקולריות בתהליכי איתות אונקוגניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא רגישה, ספציפית ומציעה רזולוציות של מולקולה בודדת וננומטר.

שידגים את ההליך יהיה ד"ר טאהן, חוקר בכיר הקשור במעבדה שלי לאחר שיבוט RAs ו-RAF R-B-D-P-A-M שברי דובדבן אחד אריזות לחלקיקים נגיפיים וזיהום תאי U2 OS על פי פרוטוקול הטקסט. להכנת דגימה לצלחת הדמיה בערך 5.5 פעמים 10 לתאי הביטוי היציבים הרביעיים לכל באר של תא תחתון זכוכית של שמונה בארות החלק פנימה 350 מיקרוליטר של DMM ללא פנול אדום. השתמש בפרלדהיד טרי עם גלוטרלדהיד כדי לתקן את התאים ולאחר החלפת הקיבוע ב-PBS או מערבולת חיץ הדמיה 100 ננומטר חלקיקי זהב והוסף 35 מיקרוליטר לבאר למעקב אחר סחיפה בשלב במהלך ההדמיה.

התקרב למיקרוסקופ והפעל את הלייזרים של 405 ו-561 ננומטר תוך שמירה על התריסים סגורים בנקודה זו, ודא שהמראה הדיכרואית של 561 ננומטר ומסנן החריץ נמצאים במקומם. פתחו את התוכנה לרכישת תמונות. הפעל את מצלמת E-M-C-C-D ואפשר לה להתקרר והגדר את זמן החשיפה ל-100 אלפיות השנייה ואת הרווח E-M-C-C-D לערך מתאים.

הוסף שמן טבילה למטרה ואבטח את הדגימה בגיל שלב המיקרוסקופ. לאחר מכן עם שדה בהיר או לייזר 561 ננומטר, הבא את הדגימה למיקוד להדמיית RAs וחלבוני ממברנה אחרים. השתמש במטרת דשא כרומט של 60 x APO עם צמצם מספרי של 1.49 והביא את המיקרוסקופ לתצורת דשא.

כוונן את לייזר העירור כך שיהיה לא מרוכז בעת פגיעה בצמצם האחורי של מטרת הדשא, מה שיגרום ללייזר לסטות עם הגעתו למאגר החלקת הכיסוי לפנים. המשך לכוונן את מיקום אירוע הלייזר עד שתגיע לזווית הקריטית והלייזר יוחזר לאחור. חפש תא לתמונה עם מספר חלקיקי זהב בתצוגה.

לאחר מכן הגדר אזור עניין המקיף את התא או אזור ממנו ואת חלקיקי הזהב למקרה שכבר מתרחשת הפעלה מספקת בגלל רמות ביטוי גבוהות. התחל ברכישה עם לייזר 405 ננומטר כבוי ולייזר 561 מופעל. אחרת, הפעל את הלייזר של 405 ננומטר בהגדרת ההספק הנמוכה ביותר של היצרן והגדל אותו בהדרגה עד שיהיו עשרות מולקולות לכל מסגרת או כך שמולקולות בודדות מופרדות היטב.

ככל שאיסוף הנתונים נמשך, הגדל בהדרגה את עוצמת הלייזר של 405 ננומטר כדי לשמור על צפיפות הנקודה קבועה בערך. המשך ברכישת תמונות עד לגבוה 4 0 5. הכוח אינו יוזם יותר.

אירועי הפעלה מסתיימים בעיבוד תמונות. הורד את תוכנת עיבוד התמונה. פתח את MATLAB וטען את תוכנת הקריאה WFI.

הצג את רצף התמונות הגולמיות וקבע את אזור העניין או החזר ההשקעה בחר את אזור הערימה לעיבוד על ידי לחיצה שמאלית וגרירת תיבה סביב האזור הרצוי. אם אזור העניין לא צומצם במהלך הרכישה, בחר אזור קטן יותר כדי להפחית את זמן החישוב כדי לבטל את הבחירה באזור ולעבד את המסגרת כולה נכון לחץ במקום כלשהו בתמונה ליד כדי להגדיר קבוצה של סמני נאמנות כגון ננו-חלקיקי זהב הנספגים על החלקת הכיסוי שהם מבודדים היטב, אחידים ומעוצבים ונמצאים בשדה הראייה בכל ערימת התמונות. התחל בבחירת חלקיק זהב מועמד על ידי לחיצה שמאלית על התמונה שלו וגרירת קופסה קטנה סביבו.

תחת מעקב אחר חלקיקים, לחץ על לחצן המעקב. יופיע גרף המציג את המיקום של חלקיק הזהב שנבחר על פני ערימת התמונות המתאר את היקף הסחיפה. חזור על תהליך זה כדי לעקוב אחר כמה שיותר חלקיקי זהב ולקבוע את החלקיקים העוקבים יחד. באופן אידיאלי.

הסחיפה הכוללת היא בסדר גודל של 0.1 פיקסל לכל היותר, אחד בכל פעם. בחר את חלקיקי הזהב שעוקבים יחד ותחת מעקב אחר חלקיקים. לחצו על לחצן הוספת הסמן.

יופיע צלב ירוק המציין שהחלקיק נוסף כסמן וישמש לתיקון סחיפה. התאם את טווח ההחלקה של טווח הסיגמא ואת הסף לפי הצורך על-ידי שינוי קל של הערך. לחץ על כפתור חיפוש החלקיקים כדי לבדוק את ההגדרות ולבדוק חזותית חלקיקי תהליך כגון דובדבן PAM מולקולות עגולות ובהירות יחסית ייארזו בארגזים ואלה שלא יישארו בחוץ.

כדי להתחיל לעבד את התמונות, לחץ על כפתור יצירת קובץ כבל ושמור את הקובץ תחת שם רצוי כדי לעבד את התמונות לאחר מכן ולעבד את תמונת כף היד. הפעל את חבילת כף היד ב-MATLAB טען את קובץ ליבת הנקודה שנוצר זה עתה. תמונה מעובדת באופן קורסי תופיע בתיבת התמונה לצד כפתורי הבקרה.

מיין את הקואורדינטות הבודדות באמצעות הערכים האופייניים הבאים. עבור PAM Cherry אחד, שילוב מסגרת שווה שמונה. שילוב מרחק בננומטר שווה ל-100 מינימום RMS שווה ארבע.

מידת ההתאמה המינימלית שווה ל-0.25 ואקסצנטריות מרבית שווה ל-1.4. לחץ על לחצן המיון כדי ליצור ערכה חדשה של קואורדינטות שנאספו מוכנות לעיבוד תמונות ברזולוציה גבוהה. הזינו ערכים לעיבוד נכון של התמונה הסופית, כגון גודל הפיקסלים הגולמיים כפי שנקבע קודם לכן לגודל התכונה הרצוי בתמונה המעובדת, שנקבע בדרך כלל לערך מעט גבוה יותר מהלוקליזציה הממוצעת ומגודל הפיקסלים כגון 10 ננומטר.

לתמונה המעובדת, לחצו על לחצן הרינדור ליצירת תמונת כף היד. לאחר מכן השתמש בסמלי ההגדלה של הפלוס והמינוס בסרגל הכלים של חלון האיור כדי להגדיל ולהקטין את התצוגה כדי לעקוב אחר מולקולות בודדות בתאים חיים. טפל במשטח תרבית הרקמה וצלחת את התאים כפי שתואר קודם לכן בסרטון זה.

ודא שלזכוכית הכיסוי יש את העובי המתאים להגדרת המיקרוסקופיה לאחר מעבר תאים וביצוע כל הטיפולים והדגירה הדרושים לניסוי, הנח את צלחת התרבית על חממה על הבמה. הניחו למנה להתיישב על הבמה למשך מספר דקות עד שהטמפרטורה וריכוז ה-CO2 מתייצבים בשלב זה. חסום את הלייזרים.

אם בקרת CO2 אינה זמינה, החלף למדיום עצמאי CO2 ממש לפני הדמיה כגון L 15 של לייבוביץ כדי לדכא את הקרינה ברקע סוף סוף לרכוש תמונות כפי שהודגם קודם לכן, תוך הגדרת זמן חשיפה מתאים כדי להבטיח יחס אות לרעש טוב מבלי לאבד רזולוציית זמן. כף היד של BFC באיור זה היא המוטציה KRAS G 12 D המקיימת אינטראקציה עם תחום הקישור RAs או RBD של CRAF. כל אחד מארבעת השילובים המוצגים כאן הוכנס לתאי U2 OS באמצעות תאי זיהום לנטי-ויראלי עם שתיים מהתצורות היו אותות BFC חיוביים חזקים כפי שזוהו על ידי העלייה הפתאומית בקרינה כאשר הלייזר של 405 ננומטר הופעל עקב הפעלת הצילום של BFC PAM Cherry משוחזר כפי שמודגם כאן תוך שימוש באותן הגדרות ניסוי כמו עם ה-PAM Cherry האם.

אות BFC חזק נוצר לאחר זיהום ב-RN R ו-RAF RBD RC. כאן, RN ו-RC מציינים את המקטע הסופי n ו-C של PAM Cherry אחד בהתאמה כאשר מתקרבים למולקולות בודדות וניתן לראות בבירור את ההתפלגות המרחבית הננומטרית שלהן בניסוי זה שבו בוצעה כף יד מעקב אחר מולקולה בודדת כדי לרכוש מסלולי דיפוזיה של RAs בודדים. מתחמי RBD של חיל האוויר המלכותי תחת תאורה רציפה עם לייזרים של 561 ננומטר ו-405 ננומטר. מולקולות בודדות של PA m דובדבן אחד.

הפעל והחזיק מעמד כמה פריימים לפני הכניסה למצבים חשוכים שבהם הם נמצאו חסרי תנועה או ניידים. תרשים זה של הקלטות עבור מולקולות מרובות ממחיש בבירור את שני סוגי המסלולים. ניתן להסיק את אותה התפלגות הטרוגנית של מצבי דיפוזיה מההיסטוגרמה של תזוזה של מולקולות בין מסגרות עוקבות שמאסה שלט בהן.

טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שבוע עד שלושה שבועות, תלוי אם המבנים הם טרנסצנדנטליים, טרנספטנטיים או מדוכאים ביציבות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין פקדים כגון פוטין מוטנטי שחסר את האינטראקציה בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו ניתוח אשכולות, על מנת לענות על שאלות נוספות כמו, כיצד מאורגנות אינטראקציות החלבון מבחינה מרחבית בתא?

לצורך מעקב אחר תאי מעבדה, ניתן לבצע מעקב אחר בסיס הערכה, חלקיקים בודדים כדי לקבוע מצבי דיפוזיה והסתברויות המעבר לאחר התפתחותו. טכניקה זו משמשת במעבדה שלנו בתחום הביולוגיה של הסרטן כדי לחקור אינטראקציות של דחף RA כמו גם את ההומו והפיכת הקולטנים המשפחתיים שלה לתאי גידול אנושיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לתכנן וליישם ביופסיה של כף היד כדי לחקור אינטראקציה חלבונית מעניינת.

אל תשכח שעבודה עם אנטי-וירוס ותאי הגידול עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון פרוטוקולי הבטיחות הביולוגית הסטנדרטיים בעת ביצוע הליך זה.