כדאיות של מבנים ניידים Bioprinted באמצעות מדפסת הקרטזיאני Dispenser שלוש
22 בספטמבר 2015
מדפסת ביולוגית קרטזית תוכננה ויוצרה כדי לאפשר שקיעה מרובת חומרים בגיאומטריות מדויקות הניתנות לשחזור, תוך מתן אפשרות לשליטה בגורמים סביבתיים. באמצעות המדפסת הביולוגית התלת מימדית, ניתן להדפיס מבנים מורכבים ובני קיימא ולשכפל אותם בקלות.
המטרה הכללית של הליך זה היא לייצר מבנים בעלי גאומטריה מורכבת המכילים תאים חיוניים באמצעות הדפסה ביו-תלת-ממדית (3D Bioprint). דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד תאי סטרומה מרקמת שומן אנושית מתרבית. לאחר מכן, התאים מערבבים עם דיו ביולוגי של אלגינאט מחומצן המצומד ל-RGD שהוכן טרי.
בשלב הסופי, תאי ה-LA בתוך החומר הביולוגי נדחפים החוצה באמצעות הדפסה ביו-ממדית. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לנתח את החיוניות, השגשוג והנדידה של התאים המודפסים. היתרון המרכזי של הליך זה על פני הליכים קיימים, כגון יצירת פיגומים וזריעת תאים, הוא שבגישה שלנו ניתן למקם את התאים ואת מקבצי התאים באופן ישיר בדיוק במקום בו הם צריכים להיות כדי ליצור את הרקמה.
מי שתדגים את הפרוצדורה היום היא שרה גרייס דניס, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. התחילו בביצוע זריעה של 350,000 תאי סטרומה מרקמת שומן אנושית לבקבוק T 75 מטופל, ב-15 מיליליטר של TMEM עם גלוקוז נמוך, לצורך הרחבה באינקובטור לתרביות תאים. כאשר התרבית מגיעה ל-80% התמלאות (confluency), הסירו את המצע ושטפו את התאים ב-5 מיליליטר של DPBS ללא סידן ומגנזיום.
לאחר מכן, דגרו את התאים בחמישה מיליליטר של trypsin ו-DPBS למשך שתי דקות ב-37 °C. כאשר התאים ניתקו, עצרו את התגובה האנזימטית באמצעות שלושה מיליליטר של מצע גידול תאים והעבירו את התאים לשפופרת קונית של 50 מיליליטר. לאחר מכן, סבבבו את התאים בצנטריפוגה ותלו את המשקע בשני מיליליטר של מצע גידול תאים. לאחר מכן ספרו את התאים, העבירו מנה של 1.3 × 10⁶ תאים לשפופרת קונית של 15 מיליליטר וסבבבו את התאים שוב בצנטריפוגה.
שHוּ את המשקע במיליליטר אחד של דיו ביולוגי שהוכן טרי, תוך הקפדה על פיזור הומוגני של התאים בכל תמיסת האלגינט המימית. לאחר מכן, העבירו את התאים למזרק בן שלושה מיליליטרים התואם למדפסת סטרילית, והבריגו ראש פלסטיק סטרילי בכישור 22 (22 gauge).
כוון ידנית את טמפרטורת האמבט ל-4 °C עבור מנגנון הפעולה ואת פרמטרי ההדפסה עבור כל מפזר במחשב המפזר התואם. הגדר את נפח ההפצה ל-230 nanoliters, את מספר צעדי הנסיגה (back steps) לאפס, ואת קצב ההפצה ל-10 µL לשנייה. לאחר מכן, פתח את תוכנת העיצוב ואת התוכנית לצפייה בתצוגת מצלמת ה-USB במחשב.
בשלב הבא, הזינו ידנית את הקואורדינطات עבור מערך נקודות של חמישה על חמישה, עם מרווח של 2.4 millimeters בין הטיפות. שמרו את התוכנית ושלחו אותה לרובוט. לאחר מכן, הניחו צלחת פטרי הכילה ג'לטין וטיטניום דיאוקסיד על משטח ההדפסה בטמפרטורה של 4 °C, וסגרו ונעלו את דלת התא.
באמצעות בקר הלוגיקה הניתן לתכנות (PLC), הפעל את מקורות אור העובני (ultraviolet) כדי לעקר את התא. לאחר 90 שניות, פתח את התא והכנס את המזרק המכיל את תרחיף תאי הסטרומה של רקמת שומן אנושית לתוך אקדח מספר אחת; סגור ונעל את דלת התא והשתמש בבקר הלוגיקה הניתן לתכנות כדי להפעיל את מערכת המאווררים. המתן 30 שניות עד להשתווית הלחץ הפנימי, ולאחר מכן הרץ את התוכנית המכילה את המסלול הגיאומטרי ואת פרמטרי ההדפסה לאורך תהליך ההדפסה.
עקבו אחר התצוגה של מצלמת ה-USB במחשב כדי לוודא הדפסה מדויקת ואחידה. כדי לכמת את החיוניות של המבנים המודפסים בביו-הדפסה, טבלו אותם בתמיסת צבע שהוכנה טרי. לאחר מכן, הניחו את המבנים במקרר למשך 15 דקות בחושך כדי לאפשר לצבע להיקבע.
לאחר מכן, באמצעות תמונת מיקרוסקופ קונפוקאלי, אם המבנים הצבועים של התאים נראים צהובים או ירוקים, סווגו אותם כחיים; אם הם אדומים, התאים מתים. כפי שמדגימות תוצאות אלו, הדפסה ביו-טכנולוגית (bioprinting) מאפשרת שיקוע מדויק ועקבי של תאים והידרוגלים במיקומים תלת-ממדיים ספציפיים באמצעות תוכנה ממוחשבת. התוכנה קובעת את מיקומו של כל טיפה ושולטת ברבים מהפרמטרים של הפריקה.
אחד הדרישות לטכניקת ביו-הדפסה מוצלחת היא שהתאים יישארו חיוניים. תאים שהודפסו בדיו ביולוגי אלגינתי כפי שהודגם כעת, נותחו שעה אחת ושמונה ימים לאחר ההדפסה; 98% מהתאים נראו ירוקים וחיוניים ביום אפס, ו-95% ביום השמיני. כפי שמעיד הצביעה האדומה, נצפו מעט תאים מתים בשתי נקודות הזמן, מה שמאשר את התאמתה של הדיו החלופית לביו-הדפסה.
יתרה מכך, דיו אלגינט המשולב עם RGD משפר את היצמדות התאים למבנים המודפסים, מה שמוביל להפשטות (spreading) ולשגשוג משופרים של התאיים, כפי שכומת בשלושה אזורים נפרדים של ההידרוג'ל ביום אפס וביום שמונה. כאן, בוצעה השוואה בין איכות שילוב פפטיד RGD בביו-דיו אלגינט לבין שימוש בביו-דיו אלגינט לבדו ביום השמיני. הפשטות התאית שנצפתה בדגימה הצבועה של אלגינט המשולב עם RGD העידה על שילוב מוצלח של הפפטיד באלגינט, תופעה שהייתה חסרה באופן ניכר בדגימות הביודפוס שאינן משולבות לאחר פיתוחן.
טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הנדסת הרקמות לבחון ייצור תוסיפי כאמצעי להרכבת מבנים הנדסיים חיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג הליך ליצירת מבנים בעלי גיאומטריות מורכבות המכילים תאים חיוניים באמצעות מדפסת ביו-דו-ממדית (3D bioprinter). השיטה כוללת בידוד של תאי סטרומה מרקמת שומן אנושית וערבובם עם דיו ביולוגי (bio ink) לפני ההדפסה במדפסת הביו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביודפוס (Bioprinting)
- ביולוגיה של התא
- הנדסת רקמות
רקע
- ביו-הדפסה בתלת-ממד מאפשרת מיקום מדויק של תאים.
- שיטות מסורתיות כוללות יצירת פיגום והזרעת תאים.
- השתלה ישירה של תאים עשויה לשפר את היווצרות הרקמה.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת לניתוח חיוניות תאים.
מטרת המחקר
- ליצירת מבנים מורכבים וחיים באמצעות מדפסת ביו-תלת-ממדית.
- לשיפור הדיוק של מיקום התאים בהנדסת רקמות.
- לניתוח התנהגותם של תאים מודפסי-ביו לאחר ההדפסה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד תאי סטרומה מרקמת שומן אנושית.
- הכנת דיו ביולוגי של אלגינאט המשוייך ל-RGD מחומצן.
- הדפסה של חומר ביולוגי טעון בתאים באמצעות הדפסה ביולוגית (bioprinting).
- ניתוח חיוניות תאים, התרבות ותנועה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
תוצאים עיקריים
- ייצור מוצלח של מבנים חיוניים המכילים תאים.
- שליטה משופרת במיקום התאים בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- הוכחת חיוניות ופרליפרציה של תאים שהודפסו בביו-הדפסה.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית איששה את דפוסי נדידת התאים.
מסקנות
- המדפסת הביולוגית בתלת-ממד מאפשרת מיקום מדויק וניתן לשחזור של תאים.
- שיטה זו עשויה לקדם יישומים בתחום הנדסת הרקמות.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון יישומים נוספים של טכניקת הדפסה ביולוגית זו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטת ביו-הדפסה זו מאפשרת ארגון מרחבי מדויק של תאים בתוך גיאומטריות תלת-ממדיות מורכבות, ובכך נותנת מענה לאתגר מרכזי בהנדסת רקמות עבור רפואה רגנרטיבית ומודלינג של מחלות. על ידי שמירה על חיוניות תאים גבוהה ותמיכה בשגשוגם, גישה זו מספקת פלטפורמה ניתנת לשחזור להערכת מועמדים טיפוליים במבנים רלוונטיים פיזיולוגית. יכולת זו תומכת באימות מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים, על ידי מתן אפשרות למיקום ישיר של חומרים ביו-אקטיביים בסביבות מיקרוביות מוגדרות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות השקעת תאים בשליטה מרחבית במבנים ביומימטיים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי שמירה על חיות התאים (>95% ביום השמיני) ועל שגשוגם במבנים המודפסים.
- ערך ניבוי: מגביר את הוודאות לגבי מעורבות המטרה (target engagement) באמצעות שחזור ארגון דמוי רקמה טבעית לצורך סריקת תרכובות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר מבנים סטנדרטיים וחיים העמוסים בתאים, עם תוצרים מדידים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לבחינת חיוניות, שגשוג ונדידה.
- ערך תפעולי: מאפשר שחזור של הבדיקה באמצעות פרמטרי הדפסה ניתנים לבקרה וייצור מבוסס תכנון בעזרת מחשב.
- יכולת הרחבה: מקל על שימוש חוזר בפלטפורמה להערכת תרכובות בשלבים הבאים באמצעות מיקום מדויק של טיפות ובקרה סביבתית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תומך במעבר משלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית על ידי שמירה על תפקוד התאים בביו-דיו של אלגינאט המצומד ל-RGD.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: משפר את הביטחון החזוי באמצעות הגברת היצמדות התאים והתפשטותם הודות לצימוד פפטיד RGD.
- מערכת רלוונטית למחלה: מייצר מבני רקמה ביו-מימטיים המדמים באופן הדוק את ארגון המטריצה החוץ-תאית הטבעית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם ועד לזיהוי מובילים, באמצעות אספקת תוצאות ביולוגיות כמותיות וניתנות לשחזור ברקמות מהונדסות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים באמצעות מיקום מדויק של תאים והידרוגלים בנקודות תלת-ממדיות מוגדרות.
- סקר (Screening): מספקת מוכנות לביצוע בדיקות באמצעות ייצור סטנדרטי של מבנים ודימוי קונפוקאלי כמותי של התנהגות תאים.
- אנליטיקה: מאפשרת ניתוח השוואתי של תנאים באמצעות מדדי חיוניות, התרבות ונדידה ממבנים צבועים.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודות פרה-קליניות על ידי שמירה על תפקוד תאים בתוך דיו ביולוגי במשך שמונה ימים לאחר ההדפסה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת לשימוש חוזר ליצירת גיאומטריות מורכבות במגוון פרויקטים באמצעות הגשה ניתנת לתכנות ובקרת תוכנה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף מטרות באמצעות הפחתת עמימות מכניסטית באינטראקציות בין התא לסביבתו.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות פרמטרי חלוקה מבוקרים וסביבת תא סטרילית.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של תגובות תאיות בהקשרי דמויי רקמה.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים באמצעות נתונים כמותיים על חיוניות ופרוליפרציה התומכים בקריטריונים להתקדמות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בבידוד תאים, הכנת דיו ביולוגי (bio ink) ומיקרוסקופיה קונפוקלית להערכת חיוניות.
- תלוי בחומרת מדפסת הביו, במערכות מזרקים סטריליות ובבמי הדפסה בבקרה טמפרטורית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תכנוני CAD, קצבי הזרקה ובקרות סביבתיות.
- שיקולי התאמה כוללים את הרכב הדיו הביולוגי ותאימות סוג התאים למטריצות מבוססות אלגינאט.
- מגבלות מעשיות כוללות סיכונים לסתימת הנחיר וצורך בפרוטוקולי צביעה לאחר ההדפסה לצורך כימות החיוניות.
