ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי BBSRC להעניק לחבר הפרלמנט האירופי (BB / H010297 / 1), מלגת לימודי BBSRC מכסה לSAR, ומלגת לימודי MRC ל SWF.

<ol><li>Shen, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+signaling%3A+developmental+roles+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nodal signaling: developmental roles and regulation.</a> Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).</li>
<li>Shimmi, O., Newfeld, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+extracellular+and+post-translational+regulation+of+TGF-beta+family+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways.</a> J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Pownall, M. E., Isaacs, H. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPownall%2C+ME+%22FGF+Signalling+in+Vertebrate+Development%22">FGF Signalling in Vertebrate Development</a>. 1, Colloquium Series on Developmental Biology. 1-75 (2010).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127 (3), 469-480 (2006).</li>
<li>Ingham, P. W., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+in+animal+development%3A+paradigms+and+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles.</a> Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).</li>
<li>Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+hundred+years+of+positional+information%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">One hundred years of positional information.</a> Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).</li>
<li>Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics%2C+spatial+range%2C+and+transcriptional+interpretation+of+the+Dorsal+morphogen+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).</li>
<li>Erickson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+maintenance+of+morphogen+gradients%3A+an+essential+role+for+the+endomembrane+system+in+Drosophila+melanogaster+wing+development%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development.</a> Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).</li>
<li>Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+signalling+in+the+developing+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Gradients of signalling in the developing limb.</a> Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).</li>
<li>Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+vertebrate+neural+tube%3A+a+sonic+hedgehog+morphogen-regulated+transcriptional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network.</a> Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).</li>
<li>Briscoe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx2.2+and+specification+of+neuronal+identity+by+graded+Sonic+hedgehog+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling.</a> Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).</li>
<li>Ribes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Sonic+Hedgehog+signaling+dynamics+specify+floor+plate+and+ventral+neuronal+progenitors+in+the+vertebrate+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube.</a> Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).</li>
<li>Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+regulation+of+developmental+cell+signaling+by+XtSulf1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1.</a> Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).</li>
<li>Tao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+wnt11+activates+the+canonical+wnt+signaling+pathway+required+for+axis+formation+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos.</a> Cell. 120 (6), 857-871 (2005).</li>
<li>Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notochord-derived+Shh+concentrates+in+close+association+with+the+apically+positioned+basal+body+in+neural+target+cells+and+forms+a+dynamic+gradient+during+neural+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning.</a> Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).</li>
<li>Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulf1+influences+the+Shh+morphogen+gradient+during+the+dorsal+ventral+patterning+of+the+neural+tube+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis.</a> Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).</li>
<li>Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulf1+has+ligand+dependent+effects+on+canonical+and+non-canonical+WNT+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling.</a> Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).</li>
<li>Dytham, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDytham%2C+C+%22Choosing+and+using+statistics+%3A+A+biologist%27s+guide%22">Choosing and using statistics : A biologist's guide</a>. , Blackwell publishing. Oxford. (2005).</li>
<li>Fay, M. P., Proschan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wilcoxon-Mann-Whitney+or+t-test%3F+On+assumptions+for+hypothesis+tests+and+multiple+interpretations+of+decision+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Statistical+Surveys%22%5BJournal%5D)">Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules.</a> Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).</li>
<li>Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xwnt-8%2C+a+Xenopus+Wnt-1+%2Fint-1-related+gene+responsive+to+mesoderm-inducing+growth+factors%2C+may+play+a+role+in+ventral+mesodermal+patterning+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis.</a> Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).</li>
<li>Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+distinct+classes+and+functional+domains+of+Wnts+through+expression+of+wild-type+and+chimeric+proteins+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).</li>
<li>Tada, M., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xwnt11+is+a+target+of+Xenopus+Brachyury%3A+regulation+of+gastrulation+movements+via+Dishevelled%2C+but+not+through+the+canonical+Wnt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway.</a> Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).</li>
<li>Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+long-range+movement+of+the+morphogen+Xnr2+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo.</a> Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).</li>
<li>McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+has+direct+long-range+signalling+activity+and+can+form+a+concentration+gradient+by+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion.</a> Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).</li>
<li>Chen, Y., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+Nodal+signal+Squint+functions+as+a+morphogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen.</a> Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).</li>
<li>Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos+coincides+with+the+dorsal+enrichment+of+dishevelled+that+is+dependent+on+cortical+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation.</a> Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).</li>
<li>Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+and+Smad+signaling+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MAPK and Smad signaling during early Xenopus development.</a> Development. 129 (1), 37-52 (2002).</li>
<li>Muller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diffusivity+of+Nodal+and+Lefty+underlies+a+reaction-diffusion+patterning+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system.</a> Science. 336, 721-724 (2012).</li>
<li>Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+morphogen+gradient+forms+by+a+source-sink+mechanism+with+freely+diffusing+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules.</a> Nature. 461, 533-536 (2009).</li>
<li>Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+Wnt+recognition+by+Frizzled%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of Wnt recognition by Frizzled.</a> Science. 337, 59-64 (2012).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

חלק חיוני של פרוטוקול זה הוא יצירת ligands הפעיל ביולוגי שבדרך כלל מעובד, מופרש, ומסוגל לעורר תגובה בתא המקבל, למרות שיש מחצית ניאון המצורפת. זה קריטי כדי לקבוע כי מוצר הגן fluorescently- מתויג הוא פעיל ביולוגי באמצעות assay מתאים. לשש-GFP, היכולת להפעיל את הביטוי של ptc1 אושרה 16. יש Wnt8a יכולת להפליא חזקה כדי לגרום לציר משניים כאשר הביע ב20-21 blastomere הגחון אחת, וWnt8a-HA-eGFP הוצג לשמור על פעילות ביולוגית זו. Wnt11b מעכב explants ectodermal Ac...

במהלך התפתחות עוברית מוקדמת, תאים בהדרגה מחויבים לעקוב אחר שושלות ספציפיות של בידול: זה אומר קבוצה של totipotent (או pluripotent) התאים הפכו מוגבל בהדרגה להקמת אוכלוסיות של תאי אב נחושים לגרום לסוג תא אחד. איתות תאי תאים היא מרכזית להסדרת מפרט שושלת במהלך התפתחות עוברית. מניפולציה של אותות אלה תידרש לכוון תאי גזע לגורל מסוים כדי לתמוך טיפולים רפואיים חדשניים. מספר קטן יחסית של מסלולי איתות הם חזרו במהלך פיתוח, כולל מסלולים להגיב לsuperfamily TGF (nodals וBMPs) 1-2, 3 FGFs, 4 Wnts, וקיפודים 5. חלבונים מופרשים אלה נקשרים הקולטנים הנוכחיים על קרום התא כדי להפעיל הולכים אותות ובכך לשנות את ביטוי הגנים ו / או התנהגות תא. הרגולציה ההדוקה של תא סימןalling חיוני למפרט שושלת תא והתפתחות תקינה. בעוד הצטלבות בין מסלולים אלה היא חשובה בקביעת גורל תא, יגנד אחד יכול עצמו לעורר תגובה שונה בריכוזים שונים. הדרגתיים מורפוגן תוארו לפני למעלה מ -100 שנים כתאוריה המסבירה כיצד סוגים שונים של תאים יכולים לנבוע מתחום התאים 6. איתות מולקולות המיוצרות על ידי קבוצה אחת של תאים עשויה לפזר על פני טווח מסוים, ירידה בריכוז במרחק גדול יותר מהמקור. תאים שנחשפו לאות יגיבו לריכוז המקומי במעמדם בתחום תאים, עם תאים בעמדות שונות מגיבים באופן שונה לרמות של האות שונות. ראיות לקיומו של morphogens מגיעה ממחקרים של העובר המוקדם תסיסנית 7 והדיסק האגף 8, כמו גם את איבר חוליות 9 וצינור עצבי 10. שיטות יש צורך בvestigate איך מורפוגן הדרגתיים הוקמו ולזהות מולקולות אחרות חשובות בויסות הדרגתיים אלה. ניסויים אלגנטיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה לדמיין חלבונים אנדוגניים in vivo בהקשר של רקע גנטי שונה שימשו לחקור הדרגתיים מורפוגן 11-12. עם זאת, נוגדנים טובים ומוטציות ספציפיות לא תמיד זמינים, כך אנו מתארים כאן פרוטוקול באמצעות ביטוי יתר של ligands הניאון ב Xenopus, כדי לספק אלטרנטיבה, שיטה פשוטה לנתח כיצד מוצרי גן אקסוגני יכולים להשפיע הפצה של ligands על פני שדה של תאים. Xenopus laevis מספק מערכת מצוינת לבצע סוגים אלה של ניסויים כעוברים שלהם לפתח חיצוני ולכן הם נגישים בשלבים המוקדמים. גודלם הגדול (1-1.5mm קוטר) מפשט microinjection ומניפולציה כירורגית ועל ידי blastula שלבי התאים קלים לתמונה כפי שהם עדיין גדולים יחסית (כ -2081; מ &#39;רוחב). מחקרי ביטוי יתר בצפרדעים הם פשוט לעשות: mRNA מוזרק לתוך העובר המוקדם יכול להיות ממוקד לתאים מסוימים ומתורגם ביעילות. מבני Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP מתויגים fluorescently היו שנוצרו באמצעות pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 וeGFP. פפטיד HA חשוב לכלול, לא רק כדי לספק תג מולקולרי נוסף, אלא גם משום שהוא חשב לפעול כspacer הפרדת חלבוני Wnt וeGFP מאפשרים שני מוצרי הגן לתפקד. המבנה המשמש להדמיה של שש שימש בעבר כדי ליצור עכבר מהונדס מבטא חלבון היתוך ששש-eGFP 15; זה סופק באדיבות על ידי אנדי מקמהון. חשוב לציין, תג ה- GFP לכל המבנים הוא משובט 3 &#39;לאות הרצף כזה שנשמר לאחר העיבוד. כמו כן הוא חיוני על מנת להבטיח כי החלבון הסופי כולל רצפים הנדרשים לשינויים, כגון addition של שומנים כמו במקרה שלשישה וWnt ligands.The cDNAs היו subcloned לתוך וקטור pCS2 + ביטוי אשר מותאם במיוחד עבור prodution של mRNA הסינתטי; זה כולל אמרגן SP6 ואות polyadenylation (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors). העבודה המתוארת כאן מספקת פרוטוקול פשוט להשוואת ההפרשה ודיפוזיה של fluorescently מתויג Wnt ושישה מתויגים ligands. על ידי הזרקת כמויות מוגדרות של mRNA הסינתטי, הפרוטוקול עוקף כל בעיות הקשורות לביטוי משתנה מוקטורים שונים באמצעות יזמים שונים. לאחרונה שיטות אלה יושמו כדי לחקור את ההשפעות של endosulfatase סולפט heparan Sulf1 שבשש-eGFP וWnt8a / הפרשת Wnt11b-HA-eGFP ודיפוזיה בXenopus 16-17.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB 1200</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום אצטט</td><td>אמביון</td><td>מ-Megascript SP6 Kit AM 1330</td><td></td></tr><tr><td>ביקרבונט</td><td>VWR International</td><td>RC-091</td><td></td></tr><tr><td>סידן חנקתי</td><td>סיגמא</td><td>C13961</td><td></td></tr><tr><td>כובע אנלוגי (m7G(5'))Applied</td> <td>Biosystems</td><td>AM 8050</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C 2432</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>18427-013</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td> <td>Sigma</td><td>O3690</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>VWR International</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma</td><td>F 4375</td><td></td></tr><tr><td>Fiji image J תוכנה</td><td></td><td></td><td>להורדה חינם http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Melford</td><td>G 0124</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>פישר מדעי</td><td>A/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>תלושי כיסוי זכוכית, No.1.5&nbsp;</td><td>ציוד מעבדה מדעי</td><td>22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מחט זכוכית</td><td>Narishige</td><td>Narishige PC -10</td><td></td></tr><tr><td>מחטי משיכה מזכוכית</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>גונדוטרופין כרוני אנושי (HCG)</td> <td>Intervet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/7500/PB17</td><td></td></tr><tr><td>ליתיום כלוריד (LiCl)</td> <td>Sigma</td><td>L-7026</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 ו תוכנת זן (2008-2010)</td><td>קרל זייס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab תוכנה</td><td>Mathworks</td><td></td><td>http://uk.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>מים בדרגה מולקולרית&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP 2819-10</td><td></td></tr><tr><td>לכה לציפורניים&nbsp;</td><td>מגפיים</td><td>ברקוד 3600530 373048</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>Lab.tech בינלאומי</td><td>ND-1000 / ND8000</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי (55 מ"מ)</td> <td>VWR International</td><td>391-0865</td><td></td></tr><tr><td>פנול-כלורופורם</td><td>סיגמא</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת פוטושופ</td><td>Adobe</td><td></td><td>http://www.photoshop.com/products</td></tr><tr><td>פולימראז DNA בנאמנות גבוהה ו חוצצים&nbsp;</td><td>ביולאבס</td><td>M0530S&nbsp; מאגר - M0531S</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td></td></tr><tr><td>סרט בידוד PVC</td><td>Onecall</td><td>SH5006MPK</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>S28704</td><td></td></tr><tr><td>חוצצי אנזימי הגבלה</td><td>Roche</td><td>SuRE/CUT סט חיץ 11082 035 001</td><td></td></tr><tr><td>DNA ללא RNAse</td><td>Promega</td><td>ME10A</td><td></td></tr><tr><td>להבי קצה יחיד פלדה אחוריים</td><td>פרסונה</td><td>66-0403-0000</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>ערכת תמלול SP6</td><td>אמביון</td><td>AM1330</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות</td><td>תרמו פישר</td><td>SHE 2505</td><td></td></tr><tr><td>Tris בסיס</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>מחטי</td><td></td><td></td> טונגסטן <td>תוצרת בית</td></tr><tr><td>Zen lite תוכנה</td><td>קארל זייס</td><td></td><td>להורדה בחינם&nbsp; http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html</td></tr></tbody></table>

באמצעות ניתוח של confocal<em&gt; laevis xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן wnt וששש

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

פרוטוקול זה מתאר שיטה לדמיין ligands מופץ על פני שדה של תאים. קלות לבטא חלבונים אקסוגניים, יחד עם הגודל הגדול של תאיהם בעוברים מוקדמים, לעשות Xenopus laevis מודל שימושי המאפשר הדמיה ligands מתויג GFP. mRNAs סינטטי מתורגמים ביעילות לאחר הזרקה לעוברי צפרדעי שלב מוקדם, ויכולים להיות ממוקדת זריקות לתא בודד. בשילוב עם נותב שושלת כגון RFP קרום קשור, התא המוזרק (וצאצאיו) שמייצרים את חלבון ביטוי יתר יכולים בקלות להיות אחריו. פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור מתויגת fluorescently ligands Wnt ושש מmRNA המוזרק. השיטות כרוכות במילנתיחת CRO של explants ectodermal (כובעי בעלי חיים) והניתוח של דיפוזיה יגנד בדוגמאות רבות. באמצעות ההדמיה confocal, ניתן לקבל מידע על הפרשה ליגנד ודיפוזיה מעל שדה של תאים. ניתוחים סטטיסטיים של תמונות confocal לספק נתונים כמותיים על הצורה הדרגתיים ליגנד. שיטות אלה עשויות להיות שימושיות לחוקרים שרוצים לבדוק את ההשפעות של גורמים שעשויים להסדיר את הצורה הדרגתיים מורפוגן.

ניתוח confocal של explants כובע בעלי החיים לבטא חלבונים מתויגים fluorescently מספק מערכת יעילה המאפשר הדמיה הפצת יגנד תחת תנאי ניסוי שונים. בדוגמא אחת, ההפצה של ה- GFP מתויגת שישה מוצגים (איור 1). בשלב 2-התא, עוברי צפרדעים מוזרקים לשני התאים עם או עם mRNA שליטה או עם mRNA הקידוד לSulf1, אנזים שמשנה סולפט heparan פני תא ומשפיע על השיפוע מורפוגן ששש 16. עוברים אלה בתרבית עד שלב 32 תא ותא בודד הוא עם mRNAs קידוד לשש-GFP וmemRFP (כנותב שושלת) מוזרק...

כתב היד כאן מספקת מערכת פשוטה של שיטות לניתוח ההפרשה ודיפוזיה של ligands מתויג fluorescently ב Xenopus. זה מספק הקשר לבדיקת היכולת של חלבונים אחרים לשנות הפצת יגנד ומאפשר ניסויים שעשויות לתת תובנה מנגנוני ויסות הדרגתיים מורפוגן.

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא להדגים ויזואלית את ההפרשה והדיפוזיה של ליגנדים המסומנים פלואורסצנטית באפיתל שלם באמצעות ביטוי ב-xip pos lavis. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע להיווצרות של מדרגי morpho, אשר ידועים כחיוניים לקביעת שושלות תאים במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שמדובר בשיטה פשוטה להדמיה ויזואלית של התפלגות ליגנדים באפיתל שלם.חלק חיוני מהפרוטוקול הוא ייצור ליגנדים פעילים ביולוגית, המעובדים ומופרשים באופן רגיל ומסוגלים לעורר תגובה בתאי המטרה למרות היותם מסומנים בתג פלואורסצנטי. מיקרוסקופיה קונפוקלית היא דרך אידיאלית לחקר הלוקליזציה של חלבונים מסומני פלואורסצנציה בתוך רקמות תלת-ממדיות; השימוש בלייזרים וגלאים עצמאיים מאפשר ניתוח נקי בתוך סוגי רקמות מורכבים אלו ומאפשר איסוף של נתונים אמינים. לאחר ייצור mRNA לקידוד ליגנדים מסומני פלואורסצנציה והשגת עוברים של XUS lavis בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש להזריק את ה-mRNA יחד עם סמן שושלת (lineage tracer), כגון membrane RFP, לתא בודד בשלב של 16 עד 32 תאים. במידת הצורך, ניתן להזריק בסינרגיה מודולטור יחד עם הליגנד הפלואורסצנטי וסמן השושלת כדי לנתח את השפעותיו.לעיתים מועיל להזריק גם תא שכנ. כאן, מוזרק תא שני בסמיכות לתא שהוזרק קודם לכן. תא אחד מוזרק עם mRNAs המקודדים לליגנד המסומן ב-GFP ולסמן שורה (lineage tracer) כגון membrane RFP, בעוד שהתא השני מוזרק עם mRNAs המקודדים למודולטור ולסמן שורה שונה, כגון membrane cerulean. העבירו את העוברים לאינקובטור בטמפרטורה של 12.5 °C וטפחו אותם עד לשלב הבא. בשלב שמונה של Faber, למחרת, כאשר העוברים הגיעו לשלב שמונה, מלאו את הצלחונות המצופים ב-1% agarose ב-NAM 2 והעבירו את העוברים באמצעות פיפטה מזכוכית חתוכה תוך שימוש במחטי טונגסטן.בצעו דיסקציה של רססי (explants) עגולים מהקוטב החייתי שלו של עוברים מוזרקים ועוברים של ביקורת, תוך הקפדה שלא לכלול רקמה מזוכידרמלית. העבירו את הרססי החייתיים לפטריות פטרי בנפח 55 מילימטר, מצופות ב-1%aros, והדגרימו את העוברים למשך ארבע שעות כדי לאפשר לחלבונים הפלורסצנטיים להבשיל ולהפיק תבליט. לצורך הכנת שקופיות תבליט, הצמידו שתי שכבות של סרט בידוד PVC לשקופיות מיקרוסקופ, תוך כדי שטיחה מלאה שלהן.גזרו מלבן של 14 על 10 מילימטר מהסרט להרכבת כיפות בעלי חיים. לאחר מכן, טפטפו שתי טיפות נפרדות של NM two על גשמירה של תבנית עם שקע (relief slide). לאחר מכן, באמצעות טיפ של P 20 שקצצו את קצהו, העבירו עד 15 animal explan לכל גשמירה, ובעזרת פינצטה, כוונו את ה-X explants כך שהצד האפיקלי פונה כלפי מעלה.השתמשו בעט יהלום כדי לסמן כיסוי זכוכית ושברו אותו ליצירת כיסוי זכוכית קטן יותר. כדי להתאימו לשקופית תבליט, הורידו בעדינות כיסוי זכוכית על שקופית התבליט באמצעות מחט כפופה בכיול 19 gauge, ובכך דחסו את השכבה האפיקלית של תאי כיפת החי (animal cap cells).השתמשו בלק כדי לאטום את השקופית, ייבשו בחושך למשך 20 דקות וצלמו תוך ארבע עד שש שעות. כדי להבטיח קבלות של בעלי חיים תקינות, יש להכווין את קבלות בעלי החיים באופן נכון בשקופיות המותאמות ולאחר מכן בכיסויי השקופית. העמיסו אותן על השקופיות בעדינות.חשוב מאוד לא להשתמש בכמות מרובה מדי של לק ציפורניים לאיטום הפלסטיקות, שכן הדבר יגרום לסרט להקמט ולאחר מכן יפגע באיטום של הפלסטיקה בשלב מאוחר יותר. לאחר רכישת המיומנות, יהיה עליך להזריק כ-25 עוברים כדי להוציא 20 animal caps תקינים עבור כל תנאי שמעניין אותך. ניתן לנתח אותם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ביום למחרת.לביצוע הדמיה, השתמש בעדשה עם הגדלה נמוכה כדי למצוא את X explan. לאחר מכן, עבור לעדשת שמן של 63 x 1.4 להדמיה ברזולוציה גבוהה יותר. הפעל את הלייזרים הדרושים, כולל 405 עבור MIAN, 488 עבור GFP ו-561.עבור MRFP, יש לבצע אופטימיזציה לעוצמות הלייזר כך שניתן יהיה לזהות את כל הפלואורופורים. השתמש במערך של 32 גלאים תוך מזעור רמות המתח וההגבר הנדרשות, ולאחר מכן השתמש במצב Lambda ובחר בלייזרים ב-405 nanometers, 488 ו-561 nanometer. כדי לאפשר שדה ראייה רחב יותר, בצע זום-אאוט (הקטנה) של התמונה ל-0.6 x.בשלב הבא, הגדירו את גודל המסגרת (frame size) לגודל התמונה הרצוי. פעולה זו מספקת רזולוציה מספקת עבור הניתוח, כאשר הממוצע נקבע לארבע עד שמונה כדי להגדיל את יחס אות לרעש ולהבטיח אופטימיזציה של ה-pinhole עבור סט נתונים זה. יחידת שטח אחת, בהתאם ללייזר 561 nanometer, שימשה תוך שימוש ב-405, 488 ו-561.מראות Diic אוספות את האור הנפלט מ-Saru ממברנלי, GFP ו-RFP ממברנלי. בניסוי זה, נאסף אור בערך בכל 10 ננומטרים מ-415 עד 720 ננומטרים. בצעו ניתוח תמונה בהתאם לפרוטוקול הטקסט המוצג כאן; זוהי התפלגות של sonic hedgehog מתויג ב-GFP בעובר של חיה בחתך X. בתנאי בקרה, sonic hedgehog GFP מופרש ומפיץ את עצמו אל מחוץ לאזור המבטא את ה-mRNAs המוזרקים.עם זאת, בנוכחות המודולטור, SULF 1, התפוצה של Sonic Hedgehog GFP היא מוגבלת יותר. ובדגימה זו ניתן לראות רק מספר מוקדים של sonic Hedgehog GFP במרחק קצר מקולונית התאים המייצרת אותו. דמות זו מציגה את האפיון של שני ליגנדים של Wnt המסומנים פלואורסצנטית שהוזרקו לתאים כפי שמצוין כאן; הן Wnt 8A והן Wnt 11B-H-A-E-G-F-P מצטברים על הממברנה של תאי animal cap, כאשר Wnt 8A-H-A-E-G-F-P מצטבר ביעילות רבה יותר מאשר Wnt 11B. דמות זו מציגה את התפוצה של Wnt 8A-H-A-E-G-F-P המבטא בקולונית תאים המסומנת ב-cerulean קשור לממברנה.ניתן לראות את הליגנד המסומן פלואורסצנטית מפיץ את עצמו הרחק מתאי המקור ואל התאים הסובבים באפיתליום. תוכנה לניתוח תמונות משמשת להפקת נתונים על התפלגות ליגנדים של wind המסומנים פלואורסצנטית במספר דגימות ניסוייות, כפי שמוצג כאן. המרחק מהשבט המבטא את mem Saru ורמת הפלואורסצנציה של GFP נמדדים כדי לקבוע את טווח הדיפוזיה של wind ואת צורת הגרדיאנט.לאחר מדידת התפלגות הליגנד, ניתן להעריך גם את התוצר של מסלול איתות על ידי שילוב פרוטוקול זה עם בדיקה נוספת לניטור תגובת התאים המקבלים. בדרך זו, ניתן לנסות לקבוע את טווח הסף של מורפוגן.

using-confocal-analysis-xenopus-laevis-to-investigate-modulators-wnt

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

האאקטודרם Xenopus עובריים הפך מודל אטרקטיבי עבור מחקרים של הקוטביות בתא. Assay מתואר, שבה חלוקת subcellular של חלבוני ניאון נבחנת בתאים האאקטודרם. פרוטוקול זה יעזור כתובת לשאלות הקשורות שליטה מרחבית של איתות.

טרנסלוקציה מקוטב של חלבוני ניאון ב Xenopus האאקטודרם בתגובה איתות Wnt

תהליכים התפתחותיים כגון התפשטות, דפוסים, בידול, והדרכה האקסון יכולים להיות מודל בקלות בחוט השדרה דג הזברה. במאמר זה, אנו מתארים הליך הרכבה לעוברי דג הזברה, אשר מייעל את ההדמיה של אירועים אלה.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

confocal הדמיה זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה שימושית לאפיון התפתחות עוברית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ולאפיין המורפוגנזה craniofacial בסוג פראי, כמו גם PDGFRA, smad5, וSMO עוברים שעברו מוטציה.

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

בעוברי קסנופוס, תאים מגג הבלסטוקואל הם פלוריפוטנטיים וניתן לתכנת אותם ליצירת רקמות שונות. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לשימוש בצמחי גג בלסטוקואל דו-חיים כמערכת בדיקה לחקירת תכונות מפתח in vivo  ו-in vitro של התפתחות עצבית מוקדמת.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

במאמר זה וידאו מפרט פשוטה במתודולוגיה vivo, שניתן להשתמש בהם כדי בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות מורכבות ורשתות רגולטוריות בעוברים חסרי חוליות רבים.

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו<em&gt; ב Vivo</em&gt; מודלים התפתחותי לימוד Cell ל-תא קומפלקס אינטראקציות רשת איתות

פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד להחדיר מיקרוקל DNA/dotap תערובת לתוך eyebuds של יום אחד xenopus זריזה העוברים, וכיצד התמונה ולשחזר חלבון פלורסנט בודדים ירוק (gfp) המבטא האופטית סיבי סוכת ב tectal מידות של . שלמים וחיים של...

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

אנו מציגים פרוטוקול דו-חלקי המשלב הדמיה של סידן פלורסנט עם היברידיזציה באתרו, ומאפשר לניסויים לתאם דפוסים של פעילות הסידן עם פרופילי ביטוי גנים ברמה של תא אחד.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

כאן, אנו מתארים כלים ושיטות חישוביות המאפשרים הדמיה וניתוח של נתוני תמונה תלת-ממדיים וארבעה מימדיים של עוברי עכבר בהקשר של התארכות צירית וסגמנטציה, המתקבלים על ידי טומוגרפיה של הקרנה אופטית טוטו, ועל ידי הדמיה חיה וכתם אימונופלואורסצנטי בהר שלם באמצעות מיקרוסקופיה רב-פוטונית.

גישות הדמיה וניתוח תלת-ממדיות וארבעה מימדים לחקר התארכות צירית וסגמנטציה צירית של בעלי חוליות

כאן, פרוטוקול ממוטב שלב אחר שלב מסופק לקיבוע, חיסון וחתך של עוברים כדי לזהות פילופודיה איתותית מיוחדת הנקראת ציטונמות ברקמות עכבר מתפתחות.

קיבוע רקמת עכבר עוברית לניתוח ציטונמה

חקור את הפרשת הליגנדים המסומנים בפלואורסצנציה והתפשטותם באפיתל שלם ב-Xenopus laevis באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו מאפשרת לבחון כיצד חלבונים אחרים משנים את התפלגות הליגנדים ומסייעת להבנת רגולציית מורפוגנים בהתפתחות עוברית.

באמצעות ניתוח של Confocal

גלה סרטונים נוספים