באמצעות ניתוח של Confocal

המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא להדגים ויזואלית את ההפרשה והדיפוזיה של ליגנדים המסומנים פלואורסצנטית באפיתל שלם באמצעות ביטוי ב-xip pos lavis. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע להיווצרות של מדרגי morpho, אשר ידועים כחיוניים לקביעת שושלות תאים במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שמדובר בשיטה פשוטה להדמיה ויזואלית של התפלגות ליגנדים באפיתל שלם.

חלק חיוני מהפרוטוקול הוא ייצור ליגנדים פעילים ביולוגית, המעובדים ומופרשים באופן רגיל ומסוגלים לעורר תגובה בתאי המטרה למרות היותם מסומנים בתג פלואורסצנטי. מיקרוסקופיה קונפוקלית היא דרך אידיאלית לחקר הלוקליזציה של חלבונים מסומני פלואורסצנציה בתוך רקמות תלת-ממדיות; השימוש בלייזרים וגלאים עצמאיים מאפשר ניתוח נקי בתוך סוגי רקמות מורכבים אלו ומאפשר איסוף של נתונים אמינים. לאחר ייצור mRNA לקידוד ליגנדים מסומני פלואורסצנציה והשגת עוברים של XUS lavis בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש להזריק את ה-mRNA יחד עם סמן שושלת (lineage tracer), כגון membrane RFP, לתא בודד בשלב של 16 עד 32 תאים. במידת הצורך, ניתן להזריק בסינרגיה מודולטור יחד עם הליגנד הפלואורסצנטי וסמן השושלת כדי לנתח את השפעותיו.

לעיתים מועיל להזריק גם תא שכנ. כאן, מוזרק תא שני בסמיכות לתא שהוזרק קודם לכן. תא אחד מוזרק עם mRNAs המקודדים לליגנד המסומן ב-GFP ולסמן שורה (lineage tracer) כגון membrane RFP, בעוד שהתא השני מוזרק עם mRNAs המקודדים למודולטור ולסמן שורה שונה, כגון membrane cerulean. העבירו את העוברים לאינקובטור בטמפרטורה של 12.5 °C וטפחו אותם עד לשלב הבא. בשלב שמונה של Faber, למחרת, כאשר העוברים הגיעו לשלב שמונה, מלאו את הצלחונות המצופים ב-1% agarose ב-NAM 2 והעבירו את העוברים באמצעות פיפטה מזכוכית חתוכה תוך שימוש במחטי טונגסטן.

בצעו דיסקציה של רססי (explants) עגולים מהקוטב החייתי שלו של עוברים מוזרקים ועוברים של ביקורת, תוך הקפדה שלא לכלול רקמה מזוכידרמלית. העבירו את הרססי החייתיים לפטריות פטרי בנפח 55 מילימטר, מצופות ב-1%aros, והדגרימו את העוברים למשך ארבע שעות כדי לאפשר לחלבונים הפלורסצנטיים להבשיל ולהפיק תבליט. לצורך הכנת שקופיות תבליט, הצמידו שתי שכבות של סרט בידוד PVC לשקופיות מיקרוסקופ, תוך כדי שטיחה מלאה שלהן.

גזרו מלבן של 14 על 10 מילימטר מהסרט להרכבת כיפות בעלי חיים. לאחר מכן, טפטפו שתי טיפות נפרדות של NM two על גשמירה של תבנית עם שקע (relief slide). לאחר מכן, באמצעות טיפ של P 20 שקצצו את קצהו, העבירו עד 15 animal explan לכל גשמירה, ובעזרת פינצטה, כוונו את ה-X explants כך שהצד האפיקלי פונה כלפי מעלה.

השתמשו בעט יהלום כדי לסמן כיסוי זכוכית ושברו אותו ליצירת כיסוי זכוכית קטן יותר. כדי להתאימו לשקופית תבליט, הורידו בעדינות כיסוי זכוכית על שקופית התבליט באמצעות מחט כפופה בכיול 19 gauge, ובכך דחסו את השכבה האפיקלית של תאי כיפת החי (animal cap cells).

השתמשו בלק כדי לאטום את השקופית, ייבשו בחושך למשך 20 דקות וצלמו תוך ארבע עד שש שעות. כדי להבטיח קבלות של בעלי חיים תקינות, יש להכווין את קבלות בעלי החיים באופן נכון בשקופיות המותאמות ולאחר מכן בכיסויי השקופית. העמיסו אותן על השקופיות בעדינות.

חשוב מאוד לא להשתמש בכמות מרובה מדי של לק ציפורניים לאיטום הפלסטיקות, שכן הדבר יגרום לסרט להקמט ולאחר מכן יפגע באיטום של הפלסטיקה בשלב מאוחר יותר. לאחר רכישת המיומנות, יהיה עליך להזריק כ-25 עוברים כדי להוציא 20 animal caps תקינים עבור כל תנאי שמעניין אותך. ניתן לנתח אותם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ביום למחרת.

לביצוע הדמיה, השתמש בעדשה עם הגדלה נמוכה כדי למצוא את X explan. לאחר מכן, עבור לעדשת שמן של 63 x 1.4 להדמיה ברזולוציה גבוהה יותר. הפעל את הלייזרים הדרושים, כולל 405 עבור MIAN, 488 עבור GFP ו-561.

עבור MRFP, יש לבצע אופטימיזציה לעוצמות הלייזר כך שניתן יהיה לזהות את כל הפלואורופורים. השתמש במערך של 32 גלאים תוך מזעור רמות המתח וההגבר הנדרשות, ולאחר מכן השתמש במצב Lambda ובחר בלייזרים ב-405 nanometers, 488 ו-561 nanometer. כדי לאפשר שדה ראייה רחב יותר, בצע זום-אאוט (הקטנה) של התמונה ל-0.6 x.

בשלב הבא, הגדירו את גודל המסגרת (frame size) לגודל התמונה הרצוי. פעולה זו מספקת רזולוציה מספקת עבור הניתוח, כאשר הממוצע נקבע לארבע עד שמונה כדי להגדיל את יחס אות לרעש ולהבטיח אופטימיזציה של ה-pinhole עבור סט נתונים זה. יחידת שטח אחת, בהתאם ללייזר 561 nanometer, שימשה תוך שימוש ב-405, 488 ו-561.

מראות Diic אוספות את האור הנפלט מ-Saru ממברנלי, GFP ו-RFP ממברנלי. בניסוי זה, נאסף אור בערך בכל 10 ננומטרים מ-415 עד 720 ננומטרים. בצעו ניתוח תמונה בהתאם לפרוטוקול הטקסט המוצג כאן; זוהי התפלגות של sonic hedgehog מתויג ב-GFP בעובר של חיה בחתך X. בתנאי בקרה, sonic hedgehog GFP מופרש ומפיץ את עצמו אל מחוץ לאזור המבטא את ה-mRNAs המוזרקים.

עם זאת, בנוכחות המודולטור, SULF 1, התפוצה של Sonic Hedgehog GFP היא מוגבלת יותר. ובדגימה זו ניתן לראות רק מספר מוקדים של sonic Hedgehog GFP במרחק קצר מקולונית התאים המייצרת אותו. דמות זו מציגה את האפיון של שני ליגנדים של Wnt המסומנים פלואורסצנטית שהוזרקו לתאים כפי שמצוין כאן; הן Wnt 8A והן Wnt 11B-H-A-E-G-F-P מצטברים על הממברנה של תאי animal cap, כאשר Wnt 8A-H-A-E-G-F-P מצטבר ביעילות רבה יותר מאשר Wnt 11B. דמות זו מציגה את התפוצה של Wnt 8A-H-A-E-G-F-P המבטא בקולונית תאים המסומנת ב-cerulean קשור לממברנה.

ניתן לראות את הליגנד המסומן פלואורסצנטית מפיץ את עצמו הרחק מתאי המקור ואל התאים הסובבים באפיתליום. תוכנה לניתוח תמונות משמשת להפקת נתונים על התפלגות ליגנדים של wind המסומנים פלואורסצנטית במספר דגימות ניסוייות, כפי שמוצג כאן. המרחק מהשבט המבטא את mem Saru ורמת הפלואורסצנציה של GFP נמדדים כדי לקבוע את טווח הדיפוזיה של wind ואת צורת הגרדיאנט.

לאחר מדידת התפלגות הליגנד, ניתן להעריך גם את התוצר של מסלול איתות על ידי שילוב פרוטוקול זה עם בדיקה נוספת לניטור תגובת התאים המקבלים. בדרך זו, ניתן לנסות לקבוע את טווח הסף של מורפוגן.