חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להציל חלקיקי נגיף זיהומיים העשויים כולו מ-CDNA משובט של גדיל חיובי, נגיפי RNA שהגנום שלהם נמצא באותה קוטביות כמו Mr.NA תאי, כגון נגיף דלקת המוח היפני. גנטיקה רגנרית מבוססת CNA זו היא שיטה למחצה המאפשרת מניפולציה ישירה של ה-RNA הגנומי הנגיפי, ובכך מייצרת וירוסים רקומביננטיים למחקר מולקולרי וגנטי בשכפול ויראלי ופתוגנזה. טכניקה זו מספקת גם פלטפורמה רבת ערך המאפשרת פיתוח של וקטורים חיסוניים וויראליים מוגדרים גנטית להעברת גנים זרים.

כלים אלה ישימים לשיבוט CDNA באורך מלא עבור אורך או זן חיובי, נגיפי RNA, במיוחד אלה עם גנום גדול מ-10 kb. ידגימו את ההליך כמה חברים של עוזר המחקר במעבדה שלי, פרופסור סאן נון לעמית הפוסט-דוקטורט UNG ו-Xing y Kim והסטודנטים לתואר ראשון, ג'ורדן פרנק. חלק הווידיאו של פרסום זה מכסה את הכנת הכרומוזום המלאכותי החיידקי המכיל את הרצפים המעניינים, סינתזה של RNA, המתועתק מהפלסמיד האחורי, וכיצד למדוד את הדבקת ה-RNA ואת תפוקת הנגיף.

כל ההליכים המשמשים לפני יצירת הפלסמיד האחורי מסופקים בפרוטוקול הטקסט בפירוט רב. לצורך הליך זה, יש לגדל תחילה מושבה אחת של אי קולי DH 10 B, הנושאת את הפלסמיד האחורי בשלושה מיליליטר של שני מרק XYT עם כלורמפניקול. דגרו על התרבית למשך 10 שעות בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס עם טלטול במהירות של 225 עד 250 סל"ד.

לאחר 10 שעות, הגדל את התרבית, ואז חסן 500 מיקרוליטר גידול ל-500 מיליליטר של מדיום וטפח את החיסון במשך שש שעות בניעור נמרץ לאחר שש שעות. צנטריפוגה את תרבית החיידקים ב-2 בקבוקי 250 מיליליטר ב-3,100 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן השעו מחדש כל כדור ב -30 מיליליטר של תמיסת GTE.

מוסיפים 500 מיקרוליטר ליזוזים ומדגרים את המתלים על קרח למשך 10 דקות. בינתיים, הכינו תמיסת ליזה טרייה לשלב הבא. לאחר 10 דקות מוסיפים 60 מיליליטר מתמיסת הליזיס ומערבבים על ידי מערבולת עד שהתמיסה נראית צלולה.

תן לתגובות לעבור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 45 מיליליטר של תמיסת נטרול לכל בקבוק והפכו את הבקבוקים עד שהם מעורבבים היטב. לאחר מכן הניחו אותם על קרח למשך 10 דקות.

אוספים את הליזטים המנוטרלים עם הצנטריפוגה המקוררת הגבוהה G. לאחר מכן אספו את הסופרנטנטים לשני בקבוקים חדשים של 250 מיליליטר. הוסף 0.6 נפחים של 100% איזופרופנול לכל אחד והניח אותם על קרח למשך 20 דקות.

לאחר מכן, סובבו את המשקעים, ואז השליכו את הסופרנטנטים והמיסו את הכדורים בחמישה מיליליטר של מאגר TE. שלב את שני הנפחים בצינור יחיד של 50 מיליליטר וזרז את ה-RNA על ידי הוספת נפח שווה של חמישה ליתיום כלוריד מולארי ודגירה של התערובת על קרח למשך 10 דקות. השתמש בצנטריפוגה קרה של 20 דקות כדי לאסוף את משקעי ה-RNA.

לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 250 מיליליטר. הוסף שני נפחים של 100% איזופרופנול והניח את הצינור על קרח כך שייווצר משקע ה-DNA. לאחר 20 דקות, סובבו את המשקעים, שאפו את הסופרנטנט, השעו מחדש את כדור ה-DNA ב-9.5 מיליליטר של מאגר TE והעבירו את תמיסת ה-DNA לצינור של 50 מיליליטר.

המשך את ההכנה על ידי הגדרת שיפוע הצזיום כלוריד עם th dium bromide. טען את התערובת לצינור פוליפרופילן אטום באמצעות מזרק עם מחט בגודל 18 ואטום את הצינור. סובב את הצינור האטום למשך הלילה באולטרה-צנטריפוגה ליצירת שיפוע צזיום כלוריד.

למחרת אסוף רצועת DNA של פלסמיד אחורי משיפוע הצזיום כלוריד. השתמש במחט בגודל 18 כדי ליצור פתח אוורור בחלק העליון של השיפוע ובמחט בגודל 20 עם מזרק כדי לאסוף את ה-DNA האחורי מהצד של השיפוע, ולאחר מכן להעביר את האוסף לצינור מיקרו פוגה של 1.7 מיליליטר. בצע שטיפה, הוסף 2.5 נפחים של בוטנול רווי במים וערבב עם מערבולת רגילה.

לאחר מכן צנטריפוגה את התערובת בטמפרטורת החדר והעבירו את השלב המימי התחתון לצינור מיקרו פוגה חדש בנפח 1.7 מיליליטר. חזור על שטיפה זו בסך הכל שש פעמים כדי להסיר את כל האתידיום ברומיד. כעת זרז את ה- DNA האחורי.

הוסף נפח עשירי של שלושה נתרן אצטט מולארי ו -2.5 נפחים של 100% אתנול לשפופרת. דגרו את התערובת על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את המשקעים בטמפרטורת החדר ושטוף את כדור ה- DNA עם מיליליטר אחד של 70% אתנול.

חזור על הסיבוב ואסוף את הכדור שוב. לבסוף, יבשו את ה-DNA הגלולי באוויר למשך 10 דקות והניחו אותו ב-200 מיקרוליטר של מאגר TE. התחל עם עיכול אנזים הגבלה בקנה מידה גדול של הפלסמיד האחורי עם xbo.

אחד בנפח כולל של 100 מיקרוליטר. בצע עיכול זה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 15 שעות. לאחר מכן, דגרו עוד יותר על העיכול עם 25 יחידות נוספות של נוקלאז שעועית מונג ב-30 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר הדגירה, הביאו את הנפח עד 300 מיקרוליטר עם מים מזוקקים. כעת בצע מיצוי פנול על ידי הוספת נפח שווה של פנול כלורופורם, אלכוהול איזואמיל לדגימה המדוללת. מערבולת נמרצת במשך דקה, מסתובבת במורד הצינור ומעבירה את השלב המימי העליון לצינור חדש.

לאחר מכן חזור על המיצוי עם כלורופורם. לאחר מכן, שחזר את ה- DNA האחורי הליניארי על ידי משקעי אתנול. אוספים את כדור ה-DNA בצנטריפוגה, זורקים את הסופרנטנט ושוטפים את הגלולה עם מיליליטר אחד של אתנול 70%.

חזור על שלב הצנטריפוגה וייבש את הגלולה באוויר. לאחר 10 דקות של ייבוש, ממיסים את כדור ה-DNA ב-30 מיקרוליטר מים מזוקקים. לאחר מכן בדוק מיקרוליטר אחד של הגב המשוחזר על ג'ל AROS 0.8%.

לאחר מכן, הגדר שעתוק נגר של 25 מיקרוליטר של ה-DNA האחורי הליניארי, כולל UTP משולש לכימות RNA. בצע את התגובה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן בדוק מיקרוליטר אחד או שניים של תגובת שעתוק הנגר על ג'ל AROS של 0.6%.

התחל עם BHK 21 תאים שגדלו במשך 24 שעות בכלים של 150 מילימטר בציפוי של 3 מיליון תאים למנה. שוטפים את שכבת התא בתמיסה קרה A ואז מנתקים אותם על ידי טריפסין. איזציה. אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה ב -270 GS למשך שתי דקות.

לאחר מכן השעו מחדש את התאים ב -50 מיליליטר של תמיסה קרה A וסובבו אותם שוב. חזור על כביסה זו שלוש פעמים לאחר הכביסה האחרונה. השעו מחדש את התאים ב-20 מיליון למיליליטר בתמיסה A.לאחר מכן ערבבו 400 מיקרוליטר של תרחיף התא עם שני מיקרוגרם של RNA סינתטי ב-vet של שני מילימטרים.

יש לטהר מיד את התערובת בתנאים אופטימליים ולתת לתאים לנוח במשך 10 דקות. לאחר מכן העבירו את התאים לצינור מיקרו פוגה המכיל 600 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם. כעת הכינו דילול סדרתי פי עשרה של התאים האלקטרופורטיים בנפחים של מיליליטר אחד צלחת 100 מיקרוליטר של כל דילול על חד-שכבות של תאי bhk 21 רגילים לאחר ארבע עד שש שעות של דגירה, כיסו את התאים עם 0.5%aros ב-MEM בתוספת FBS ותרבו אותם במשך ארבעה ימים נוספים.

תאי Bhk 21 נצבעו באלקטרופוציה או באלקטרופוציה עם תעתיקי RNA שמקורם בשני שיבוטים עצמאיים של JEV באורך מלא ארבעה ימים לאחר מכן, התאים נצבעו בסגול קריסטל כדי לראות את ה-RNA הזיהומי בתאים. באמצעות כתם זה, המרכזים הנגועים כומתו. ביטוי החלבון הנגיפי הבא נבדק בתאים אלקטרופוטיים של RNA 20 שעות לאחר הטרנספקציה באמצעות אנטי NS, סרום אנטי ארנב אחד ונוגדנים משניים מצומדים SI שלושה שנראה באדום.

הגרעינים היו כתמים נגדיים עם DAPI שנראה בכחול. מאוחר יותר, 22 ו-40 שעות לאחר הטרנספקציה, הצטבר ייצור של וריאנים זיהומיים בתרבית. סופרנטנטים של תאים אלקטרופוטיים של RNA נבדקו על ידי מבחני פלאק.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להציל נגיף מדבק לחלוטין מ-CNA משובט של זן חיובי, RNA, כגון נגיף דלקת המוח היפני. אז אל תשכח שעבודה עם נגיף דלקת המוח היפני ופתוגנים אנושיים אחרים יכולה להיות מסוכנת ביותר. יש צורך בהכשרה נכונה לבטיחות ביולוגית לפני ביצוע הליך זה.