מהיר

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע היברידיזציה מהירה מסוג in situ ברקמת מוח מקובעת בפראלדהיד. דבר זה מושג תחילה על ידי דהידרציה של חיתוכי רקמת מוח וטיפול בחיתוכים באמצעות ריאגנטים של קדם-טיפול 1, 2 ו-3. השלב השני הוא ביצוע היברידיזציה של החיתוכים עם גששים (probes) אוליגונוקלאוטידיים ראשוניים, ולאחר מכן עם גששים שניים, שלישיים ורביעיים.

בשלב הבא, יש להוסיף סובסטרט fast red כדי לזהות את ה-RNA המטרה. השלב הסופי הוא כימות רמת אותות ה-mRNA באמצעות תוכנת Image J. לבסוף, ניתן להפיק נתונים על שינויים בביטוי הגנים של ה-RNA על ידי השוואה בין הקבוצה הניסויית לקבוצת הביקורת.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא פשוטה יחסית, זולה, הניתנת לשחזור, ולהשלמתה נדרשים פחות מיומיים. עבודה זו פותחה על ידי עצמי וג'ון ג'יי לנן מבית הספר לרפואה וטרינרית של אוניברסיטת רוס, ועל ידי ז'אן סוזה ו-RU טאו מהפקולטה לרפואה של אוניברסיטת פלורידה אטלנטיק. בהליך זה, לשלב התייבשות, הוציאו ארבעה סליידים מקופסאות סליידים של מיקרוסקופ שנשמרו במקפיא של 80- מעלות צלזיוס.

הקצו את החלקים לבדיקות של P-P-I-B-D-A-P-B ו-HT two A genes, סמנו אותם וסמנו אותם בעזרת עט כדורי. לאחר מכן, השקיעו את השקופיות באלכוהול 100% בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן ייבשו את השקופיות למשך חמש דקות במכסה המנדף; כטיפול מקדמי, העבירו בפיפטה 20 µL של ריאגנט pretreatment one לכל חלק, והניחו את השקופיות על מסילת תושבת במגש לחות.

נער בעדינות את מגש הלחות על נער水平 (shaker) במהירות נמוכה למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטוף את השקופיות פעמיים במים מזוקקים כפולים למשך שתי דקות. טבול את השקופיות בכלי כימי (beaker) של 1000 מיליליטר המכיל 450 מיליליטר של ריאגנט קדם-טיפול 2.

בשלב הבא, הרתיחו את השקופיות במשך חמש דקות בסך הכל בטמפרטורה של 100 °C כדי לשחזר את מבנה ה-RNA. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים במים מזוקקים כפולה במשך שתי דקות בכל פעם. הניחו את השקופיות באלכוהול 100% למשך חמש דקות.

לאחר מכן, ייבשו את השקופיות למשך חמש דקות. במנדף, השתמשו בעט הידרופובי כדי לצייר עיגול מסביב לאזור הנבחר בחתך הרקמה. לאחר מכן, טפטפו 10 µL מרכיב הקדם-טיפול השלישי לכל אזור נבחר כדי להגביר את חדירות הגשוש (probe) וכסו את תבנית הלחות במכסה.

לאחר מכן, הניחו את המגש בתנור ההכלאה (hybridization oven) המצויד במנער אופקי. הגדירו את טמפרטורת התנור ל-40 °C ונערה בעדינות את המגש למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים במים מזוקקים פעמיים למשך שתי דקות בכל פעם. בשלב זה, טפטפו 10 µL של P-P-I-B-D-A-P-B או probe HTR two A על האזורים הנבחרים.

לאחר מכן, כסו את מגש הלחות במכסה כדי למנוע התאיידות של הרכיב. נערו בעדינות את השקופיות על השייקר האופקי במהירות נמוכה תוךما דגירה בתנור בטמפרטורה של 40 °C למשך שעתיים. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם בופר שטיפה למשך שתי דקות בכל פעם, וטפטפו 10 µL של רכיב הגברה 1 (amplification one reagent) על כל אזור נבחר.

נערו והדגירו את השקופיות בטמפרטורה של 40 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם בופר שטיפה למשך שתי דקות בכל פעם, והעבירו באמצעות פיפט 10 µL של ריאגנט ההגברה 2 לכל אזור שנבחר. נערו והדגירו את השקופיות בטמפרטורה של 40 °C למשך 15 דקות.

לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם בופר שטיפה למשך שתי דקות. בכל פעם, טפטפו 10 µL של ריאגנט הגברה 3 על כל אזור שנבחר. נערו והדגרו את השקופיות בטמפרטורה של 40 °C למשך 30 דקות.

לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם תמיסת שטיפה למשך שתי דקות. העבירו בפיפטה 10 µL של ריאגנט הגברה 4 לכל אזור שנבחר. נערנערו והדגרו את השקופיות בטמפרטורה של 40 °C למשך 15 דקות.

בשלב הבא, שטפו את השקופיות פעמיים עם בופר שטיפה למשך שתי דקות. טפטפו 10 µL של ריאגנט הגברה חמש על כל אזור נבחר. נערה והדגיתו את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם בופר שטיפה למשך שתי דקות. טפטפו 10 µL של ריאגנט הגברה שש על כל אזור שנבחר. נערו והדגירו את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

לאחר מכן, שטפו שוב את השקופיות פעמיים עם תמיסת שטיפה למשך שתי דקות בכל פעם. כעת, העבירו בפיפטה 10 µL מהריאגנט האדום לכל אזור נבחר, הניחו את השקופיות במגש הלחות על השייקר האופקי בטמפרטורת החדר ונערה בעדינות במהירות נמוכה למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים במים מזוקקים כפולים למשך 10 דקות.

בכל פעם, ייבשו את השקופיות בתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, הניחו את השקופיות בתוך xylene במכסה הfume hood למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו בפיפט 20 µL של חומר הרכבה מבוסס xylene לכל אזור שנבחר וכסו בזכוכית כיסוי.

בשלב זה, גררו והניחו את קובץ התמונה אל חלון התמונה הראשי J. עברו לסרגל התפריטים ובחרו ב-image. לאחר מכן, בחרו ב-type מהתפריט הנפתח ובחרו ב-eight bit.

בשלב הבא, בחרו ב-adjust ולאחר מכן ב-threshold כדי לפתוח את תיבת הדיאלוג. התאימו את ערך הסרגל התחתון בתיבת הדיאלוג כך שהרקע הבלתי רצוי יוסר. עברו לשורת התפריטים ובחרו ב-Analyze, ולאחר מכן ב-analyze particles כדי לפתוח תיבת דיאלוג שנייה.

הגדירו את גודל החלקיקים ל-10. לאחר מכן, בחרו באפשרות להצגת קווי מתאר ובחרו בהצגת תוצאות ותיבות סיכום. לבסוף, לחצו על אישור כדי לצפות בנתוני החלקיקים בתיבות הדיאלוג.

לצורך חישוב בגיליון אלקטרוני, הזניחו את הנתונים לתוך גיליון ה-Excel וחשבו את הממוצע של מספר החלקיקים בקבוצת המלח (saline) כקו בסיס. לאחר מכן, חשבו את רמת האחוזים של כל חלק והכינו גרף בהתאם. להלן תמונות במיקרוסקופ אור של אותות ההכלאה (hybridization), המסומנים בנקודות אדומות.

רקמות קובעו בפורמלין בחולדות תחת הרדמה עמוקה שטופלו בעבר בתמיסת מלח (saline) וב-MDMA. הגששים האוליגונוקלאוטידיים שנעשה בהם שימוש הם D-A-P-B-P-P-I-B ו-HT two A. איור זה מראה את ההשפעה על ביטוי הגן HT two A בהיפותלמוס בחולדות שטופלו בעבר ב-MDMA, ונצפתה הפחתה של 20% בביטוי של HT two A. טכניקה זו מקלה על חוקרים בתחום מדעי המוח למדוד ביטוי של גני mRNA, באמצעות היברידיזציה in situ ברקמת מוח שקובעה בפורמלין.