Name: מהיר באתר הכלאה באמצעות oligonucleotide בדיקות במוח-התחילית Paraformaldehyde של חולדות עם סרוטונין תסמונת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: למדו שיטת הכלאה באתר מהירה לזיהוי ביטוי גנים במוח חולדות באמצעות זנודות oligonucleotide. הפרוטוקול מאומת בזיהוי גן htr2a ומאפשר ניתוח כמותי של רמות mRNA בפחות מיומיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענק NIH (R15DA029863), מענק אוניברסיטת פלורידה אטלנטיק מחקר לתואר ראשון (M30014) ואוניברסיטת רוס של מענק מחקר לרפואת הווטרינרית. ברצוננו להודות למכון הלאומי לשימוש בסמים (Rockville, MD) למתן (±) 3,4-methylenedioxymethamphetamine (± MDMA) עבור עבודה זו.

נהלי שימוש בבעלי חיים מתוארים להלן אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת רוס לרפואת וטרינרית ואוניברסיטת פלורידה אטלנטיק. למרות טכניקות וכפפות סטריליות נדרשות, הסביבה נטול RNase אין צורך בעת השימוש בפרוטוקול זה. 1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת רקמה וחתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקצאת חולדות באופן אקראי לשלוש קבוצות: טרי / מלוח (SAL; 0.9% NaCl), ולפניה / SAL וקידומת / 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ראה פירוט בטבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל שלושה מינונים של 1 מיליליטר / קילוגרם SAL ו -10 מ&quot;ג / קילוגרם MDMA intraperitoneally, בהתאמה, לקבוצות SAL וMDMA במרווח 2 שעות. הרשה בעלי חיים כדי לשרוד את הטיפול במשך 6 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 7, לנהל 100 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין בשילוב של 5 מ&quot;ג / קילוגרם xylazine intraperitoneally לחולדות להרדמה עמוקה (כלומר, הפסד של מצמוץ בקרנית ות&quot;אil לצבוט רפלקסים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוצה הטרי / SAL, לערוף מהירות חולדות ולהסיר את המוח לבדיקת המוח הטרי (ראה פירוט בהתייחסות 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוצות / MDMA קידומת / SAL וקידומת, לעשות חתך לאורך עצם החזה על 10 -12 סנטימטרים ולאחר מכן לחשוף את הסוף של עצם החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הקצה של עצם החזה עם hemostat ולחתוך את הסרעפת רוחבית בשני הצדדים עם מספריים חדים ולאחר מכן לחתוך כלפי מעלה על פני הצלעות ומקבילות לריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביד אחת, מחזיק את קצה הגחון של הלב עם מלקחיים קטנים. ביד השנייה, פירס החדר השמאלי עם מחט מזרק G 18 (שים לב לצד המתאם של המחט מחוברת עם צינור סיליקון בצורת אות V למכולות SAL וparaformaldehyde קר כקרח ומשאבות peristaltic; ראה התייחסות 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת SAL ברמה בינונית של קצב הזרימה (~ 5 מיליליטר / דקה) ולנקב את אטריום ימין עם המלקחיים כדי לאפשר הבריחה של circ התמורהulation. לשמור זלוף SAL למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת paraformaldehyde ברמה בינונית ולאפשר paraformaldehyde 4% קרים כקרח לינקב את החיה במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מכשיר זלוף ולערוף את החיה. הפוך posteroanterior לחתוך את קו האמצע של הגולגולת, ואז לנפנף את הגולגולת כדי לחשוף את חלל גולגולת 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח עם מרית מחלל הגולגולת ולמקם את המוח בצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של 4% paraformaldehyde. שמור את המוח בתוך הצינור המכיל paraformaldehyde ב 4 מעלות צלזיוס מקרר למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את המוח לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של 30% תמיסת סוכרוז ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. לבסוף, לאחסן המוח בתוך שקיות פלסטיק ב -80 ° C עד שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר המוח על צ&#39;אק עם תקשורת הטבעה ולהקפיא את תקשורת ההטבעה מכילה מוח בcryostat בטמפרטורה של -26 מעלות צלזיוס. חותך את קפא הטרימוח n ל -20 מיקרומטר חלקים וparaformaldehyde-התחילית מוח לסעיפים 10 מיקרומטר. העבר את הסעיף לשקופית מיקרוסקופ RT על ידי נגיעה בשקופית לסעיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר יבש ב RT במשך 4 שעות. אחסן את שקופיות הסעיף בשקית אטומה הדוק ב -80 ° C עד שימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייבשות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח שקופיות מהמקפיא -80 ° C ולהקצות חלקים לאחת משלוש בדיקות: HT2A, ppiB (ביקורת חיובית) או dapB (שליטה שלילית); סימן וחתכים תווית עם עט כדורי (לא להשתמש בעיפרון). לצלול שקופיות באלכוהול 100% ב RT במשך 5 דקות. ייבש את השקופיות במשך 5 דקות במנדף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול מקדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 20 μl של המגיב לפני הטיפול-1 (איון של phosphatase אלקליין) בסעיפים בשקופיות. מניחים את השקופיות על רכבת מתלה במגש לחות (שים לב שהמגש מכוסה במכסה כדי לשמור על לחות גבוהה למניעת אידוי מsolutio התגובהn). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את מגש הלחות על שייקר אופקי במהירות נמוכה במשך 10 דקות. שטוף את השקופיות פעמיים עם מים מזוקקים כפולים (DDH 2 O) במשך 2 דקות. להטביע את השקופיות בכוס 200 מיליליטר המכילה 150 מיליליטר של המגיב לפני הטיפול-2 (שבירה של הקשרים בין-הנגרמים על ידי קיבוע paraformaldehyde). מרתיחים את השקופיות עבור הסכום כולל של 5 דקות ב 100 מעלות צלזיוס (שיקום מושרה חום של מבנה RNA 11). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים עם DDH 2 O 2 דקות. מניחים את השקופיות באלכוהול 100% במשך 5 דקות. ייבש את השקופיות במשך 5 דקות במנדף. השתמש בעט הידרופובי לצייר מעגל מסביב לאזור שנבחר בסעיף הרקמות (למשל, מבנים שאינן בקליפת המוח, כוללים התלמוס וההיפותלמוס כפי שמתוארים באיור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של המגיב לפני הטיפול-3 (עלייה בחדירת בדיקה) לכל אזור שנבחר, ולכסות את מגש הלחות עם המכסה. מניחים את המגש בתנור ההכלאהמצויד בייקר האופקי ולהגדיר את טמפרטורת התנור ב -40 מעלות צלזיוס; נער בעדינות את המגש למשך 30 דקות. שטוף את השקופיות פעמיים עם DDH 2 O 2 דקות. </li></ol></li></ol> 2. הכלאה והגברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של htr2a, ריאגנטים בדיקה ppiB וdapB, בהתאמה, באזורים הנבחרים. מכסה את מגש הלחות עם המכסה כדי למנוע אידוי של המגיב. נער בעדינות על שייקר האופקי להגדיר במהירות נמוכה. דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס בתנור למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-1 על כל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-2 על כל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים wה- i כביסה חיץ במשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-3 בכל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-4 בכל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-5 בכל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב RT למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-6 בכל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב RT במשך 15 דקות. שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. </li></ol> 3. גילוי אותות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של המגיב האדום לכל אזור שנבחר (שים לב שמגיב היא תערובת של אדום-B ואדום-ביחס 1:60 ויש להשתמש ביmmediately). מניחים את השקף במגש הלחות על שייקר האופקי ב RT וללחוץ בעדינות במהירות נמוכה במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים עם (DDH 2 O) במשך 10 דקות. ייבש את השקופיות על 60 מעלות צלזיוס בתנור במשך 15 דקות. מניחים את השקופיות בקסילן מתחת למכסת מנוע קטר במשך 5 דקות. פיפטה 20 μl של תקשורת הרכבה מבוססת קסילן בכל אזור שנבחר ולכסות עם coverslip. </li></ol> לכידת 4. תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח microphotographs הדיגיטלי של האזורים הנבחרים (לדוגמא, ההיפותלמוס, איורים 1 ו 3) עם הגדלה של 4 × 20 × ועדשות אובייקטיביות. שמור את קובץ התמונה. </li></ol> ניתוח חלקיקים 5. תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרור ושחרר את קובץ התמונה בחלון ImageJ העיקרי. עבור לשורת תפריטים ובחרו &#39;תמונה&#39;, הבא לבחור &quot;סוג&quot; מהתפריט הנפתח, ובחר &#39;8 סיביות &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה &#39;התאם&#39;, ולאחר מכן בחר &#39;Threshold &#39;כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח. התאם את ערך הסרגל התחתון בתיבת הדו שיח כדי שהרקע לא רצוי יוסר. עבור לשורת תפריטים ובחרו &#39;לנתח&#39;, ולאחר מכן בחר &#39;לנתח חלקיקים&#39; כדי לפתוח תיבה דו-שיח שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גודל חלקיקים בגיל 10, הבא בחר &#39;הצג מתווה&#39; ובחר &#39;צג תוצאות &quot;ו&#39;קופסות&#39; לסכם. לבסוף, לחץ על &#39;אישור&#39; כדי להציג נתונים חלקיקים בתיבות דו-שיח. </li></ol> חישוב 6. גיליון אלקטרוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את הנתונים לגיליון Excel וממוצע המספרים של חלקיקים בקבוצת SAL כבסיס. לחשב את האחוז של כל קטע ולעשות גרף בהתאם (איור 4). </li></ol>

<ol><li>Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+syndrome+after+a+massive+overdose+of+controlled-release+paroxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychosomatics%22%5BJournal%5D)">Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine.</a> Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).</li>
<li>Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+recovery+after+severe+serotonin+syndrome%2C+severe+rhabdomyolysis%2C+multi-organ+failure+and+disseminated+intravascular+coagulopathy+from+MDMA%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Lung%22%5BJournal%5D)">Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA.</a> Heart Lung. 43, 117-119 (2014).</li>
<li>Bosch, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verbal+memory+deficits+are+correlated+with+prefrontal+hypometabolism+in+18FDG+PET+of+recreational+MDMA+users%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+On%22%5BJournal%5D)">Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users.</a> PLoS On. 8, e61234(2013).</li>
<li>Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+overnight+memory+consolidation+in+ecstasy+users%5BTitle%5D)+AND+%22J+Psychopharmaco%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users.</a> J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).</li>
<li>Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+radioactive+in+situ+hybridization+using+full+length+hydrolyzed+riboprobes+to+detect+%CE%B12+adrenoceptor+subtype+mRNAs+in+adult+and+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Proto%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain.</a> Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).</li>
<li>Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-ethylmaleimide+%28NEM%29+can+significantly+improve+in+situ+hybridization+results+using+35S-labeled+oligodeoxynucleotide+or+complementary+RNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytoche%22%5BJournal%5D)">N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes.</a> J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diag%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+E%22%5BJournal%5D)">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> J Vis E. , (2014).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+E%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis E. , (2012).</li>
<li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pericytes+and+capillary+diameter+in+brain+slices+and+isolated+retinae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proto%22%5BJournal%5D)">Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae.</a> Nat Proto. 9, 323-336 (2014).</li>
<li>Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+techniques%3A+current+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytoche%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval techniques: current perspectives.</a> J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).</li>
<li>Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+patterns+in+rat+dentate+granule+cells%3A+comparison+between+fresh+and+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Method%22%5BJournal%5D)">Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue.</a> J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).</li>
<li>Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+messenger+RNA+expression+by+in+situ+hybridization+using+RNA+probes+synthesized+via+in+vitro+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Method%22%5BJournal%5D)">Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription.</a> Method. 52, 322-331 (2010).</li>
<li>Mijnster, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+and+cellular+distribution+of+serotonin+5-hydroxytryptamine2a+receptor+mRNA+in+the+nucleus+accumbens%2C+olfactory+tubercle%2C+and+caudate+putamen+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neuro%22%5BJournal%5D)">Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat.</a> J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+region-specific+alterations+of+5-HT2A+and+5-HT2C+receptors+in+serotonin+transporter+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroche%22%5BJournal%5D)">Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice.</a> J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).</li>
<li>Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+5-HT2A+receptor+mRNA+expression+following+withdrawal+from+a+chronic+escalating+dose+regimen+of+D-amphetamine%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Re%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine.</a> Brain Re. 1390, 10-20 (2011).</li>
<li>Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+5-HT2A+receptors+in+prefrontal+cortex+pyramidal+neurons+projecting+to+nucleus+accumbens.+Potential+relevance+for+atypical+antipsychotic+action%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacolog%22%5BJournal%5D)">Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action.</a> Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).</li>
<li>Reneman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+and+chronic+effects+of+MDMA+%28%27Ecstasy%27%29+on+cortical+5-HT2A+receptors+in+rat+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human.</a> 26, 387-396 (2002).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אחד החששות העיקריים של בדיקת הכלאה באתרה הוא בחירת טכניקות מתאימות המשמשות לשימור RNA בגלל אנזימי RNase. ידוע כי אנזימים אלה נמצאים באופן נרחב בתאים ובסביבה מה שיכול להשפיע על התוצאות. עם זאת, ניתן להבחין במהירות בפעילות האנזים על ידי הנחת הרקמה בתמיסת הקרח היבש/אלכוהול5,12. למרות ששימור מהיר הוא קריטי להכלאה באמצעות ריבופרוב13, מעט ידוע על תנאי ניסוי לבדיקות אוליגונוקלאוטיד. במחקר זה באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטיד, מצאנו כי אין הבדל בין המוח הקידומתי פרפורמלדהיד לבין המוח הטרי שנשמר במהירו...

תסמונת סרוטונין (5-הידרוקסיטריפטמין; 5-HT) היא הפרעה נוירולוגית חריפה הנגרמת על ידי תרופות מקדמות 5-HT כגון תרופות נוגדות דיכאון1, בעוד שהיא מתרחשת גם במצבים של שימוש ב-MDMA למטרות פנאי2. מנגנונים מולקולריים האחראים לשינויים במצב הרוח, ליקויי למידה וזיכרון המתרחשים בקשר לתסמונת החריפה אינם מובנים היטב3,4. הכלאה באתרה היא כלי מחקר רב עוצמה המאפשר זיהוי וכימות של mRNAs ספציפיים המתבטאים באופן פוטנציאלי ברמת תא בודד. הדרך הקונבנציונלית לבצע הכלאה באתרה היא להשתמש בריבופרוב בעל תווית רדיואקטיבית שעושה הכלאה ספציפית של הגן המעניין. עם זאת, החיסרון העיקרי הוא שהשיטה דורשת הכנת בדיקה ושלבי הכלאה מסובכים וגוזלי זמן, כמו גם גישה לרקמות קפואות טריות הנשמרות בסביבה נטולת RNase5,6. 
בדיקות אוליגונוקלאוטידים פותחו לאחרונה כדי להכליא שברי RNA קצרים יותר מאלה הנדרשים לריבופרוב7. יתר על כן, הגשושיות מייצרות אות רקע נמוך מבלי להקריב את הספציפיות8. ניתן להשתמש בטכנולוגיית בדיקה חדשה זו שפותחה במקום הכלאה על רקמות מוח עם קידומת פרפורמלדהיד הזמינות בדרך כלל במעבדות אימונוציטוכימיות.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול להכלאה באתרה באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטידים על מוח חולדה עם קידומת פרפורמלדהיד ומשווים את הממצאים לאלה שצוינו במוח קפוא טרי5,6. פרוטוקול זה משמש לבדיקת ההשערה כי שימוש לרעה בחומרים MDMA גורם לשינויים בגן הקולטן 5-HT2A htr2a mRNA במוח. התחלנו את ההליך בטיפול ב-MDMA ואחריו זלוף רקמות פרפורמלדהיד של החיה, הכלאה באתרה של בדיקת thr2a וניתוח נתונים. שימו לב ש-dapB (הגן החיידקי המקודד לדיהידרודיפיקולינט רדוקטאז) משמש כבקרה שלילית, ו-ppiB (קידוד גן משק בית לפפטידילפרוליל איזומראז B) כבקרה חיובית.

<table><tbody><tr><td>בדיקת בקרה שלילית RNAscope-DapB</td><td>אבחון תאים מתקדם, INC</td><td>310098</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Pretreat 4</td><td>אבחון תאים מתקדם, ערכת</td><td></td> ריאגנטים RNAscope 2.0 HD 320046 <td></td></tr> - <tr><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>אדום</td>, בדיקת RNAscope <td>310036</td><td></td>INC</tr><tr>- <td>אבחון תאים מתקדם</td><td>Rn-Ppib</td>, INC <td>313921</td><td></td></tr><tr><td>Htr2a</td> <td>חולדהאבחון תאים מתקדם, INC</td><td>300031</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אופקי</td><td>VWR</td><td>88032-088</td><td></td></tr><tr><td>תנור היברידיזציה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>222000</td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ סופרפרוסט פלוס</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>עט הידרופובי</td><td>וקטור</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>פרוביס AX70</td><td></td></tr></tbody></table>

מהיר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה באמצעות oligonucleotide בדיקות במוח-התחילית paraformaldehyde של חולדות עם סרוטונין תסמונת

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

רעילות 3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; אקסטזי) עלולה לגרום לשינויים ספציפיים לאזור בביטוי mRNA סרוטונרגי עקב תסמונת סרוטונין חריפה (5-הידרוקסיטריפטמין; 5-HT). ניתן לבחון השערה זו באמצעות הכלאה באתרה כדי לזהות את גן הקולטן סרוטונין 5-HT2A htr2a. בעבר, הליכים כאלה, תוך שימוש בריבופרוב רדיואקטיבי, היו קשים בגלל זרימת העבודה המסובכת שדורשת מספר ימים לביצוע והקושי הנוסף שהטכניקה דרשה שימוש ברקמות קפואות טריות שנשמרו בסביבה נטולת RNase. לאחרונה, הפיתוח של בדיקות אוליגונוקלאוטידים קצרות פישט את הליכי ההכלאה באתרם ואיפשר שימוש בקטעי מוח עם קידומת פרפורמלדהיד, הזמינים יותר במעבדות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטידים לא רדיואקטיביות על רקמות המוח המקודמות. בדיקות הכלאה המשמשות למחקר זה כוללות dapB (גן חיידקי המקודד לדיהידרודיפיקולינט רדוקטאז), ppiB (גן משק בית המקודד לפפטידילפרוליל איזומראז B) ו-htr2a (גן סרוטונין המקודד לקולטני 5-HT2A). שיטה זו פשוטה יחסית, זולה, ניתנת לשחזור ודורשת פחות מיומיים להשלמתה.

שימוש בבדיקות RNA oligonucleotide (&lt;25 NT), הכלאה יכולה להתגלות כנקודות אדומות בתאי ההיפותלמוס הוכנו מהמוח הקפוא-התחילית paraformaldehyde וטרי. מולקולות mRNA htr2a נמצאות בכמה תאים (המסומנים בחצים מוצקים), אך לא לאחרים (חיצים פתוחים). הבחנו כי אין הבדל בין-התחילית paraformaldehyde והרקמות קפואים (איור 1). הכלאה מוצלחת ניתן להעריך ראשון בעין בלתי מזוינת (איור 2). מצאנו שהאזור שנבחר (מסומן בעיגולים) הכלאה עם הבדיקה dapB לא הראה ...

פרוטוקול זה מתאר שיטת הכלאה מהירה ופשוטה באתרה אידיאלית למוח עם קידומת פרה-פורמלדהיד, ובכך מפחית את הצורך בשלבים מורכבים ממושכים תוך שימוש ברקמות קפואות טריות. השיטה מאומתת באמצעות זיהוי גן הקולטן סרוטונין 5-HT2A htr2a בחולדות.

מהיר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה באמצעות oligonucleotide בדיקות במוח-התחילית Paraformaldehyde של חולדות עם סרוטונין תסמונת

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע היברידיזציה מהירה מסוג in situ ברקמת מוח מקובעת בפראלדהיד. דבר זה מושג תחילה על ידי דהידרציה של חיתוכי רקמת מוח וטיפול בחיתוכים באמצעות ריאגנטים של קדם-טיפול 1, 2 ו-3. השלב השני הוא ביצוע היברידיזציה של החיתוכים עם גששים (probes) אוליגונוקלאוטידיים ראשוניים, ולאחר מכן עם גששים שניים, שלישיים ורביעיים.בשלב הבא, יש להוסיף סובסטרט fast red כדי לזהות את ה-RNA המטרה. השלב הסופי הוא כימות רמת אותות ה-mRNA באמצעות תוכנת Image J. לבסוף, ניתן להפיק נתונים על שינויים בביטוי הגנים של ה-RNA על ידי השוואה בין הקבוצה הניסויית לקבוצת הביקורת.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא פשוטה יחסית, זולה, הניתנת לשחזור, ולהשלמתה נדרשים פחות מיומיים. עבודה זו פותחה על ידי עצמי וג'ון ג'יי לנן מבית הספר לרפואה וטרינרית של אוניברסיטת רוס, ועל ידי ז'אן סוזה ו-RU טאו מהפקולטה לרפואה של אוניברסיטת פלורידה אטלנטיק. בהליך זה, לשלב התייבשות, הוציאו ארבעה סליידים מקופסאות סליידים של מיקרוסקופ שנשמרו במקפיא של 80- מעלות צלזיוס.הקצו את החלקים לבדיקות של P-P-I-B-D-A-P-B ו-HT two A genes, סמנו אותם וסמנו אותם בעזרת עט כדורי. לאחר מכן, השקיעו את השקופיות באלכוהול 100% בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן ייבשו את השקופיות למשך חמש דקות במכסה המנדף; כטיפול מקדמי, העבירו בפיפטה 20 µL של ריאגנט pretreatment one לכל חלק, והניחו את השקופיות על מסילת תושבת במגש לחות.נער בעדינות את מגש הלחות על נער水平 (shaker) במהירות נמוכה למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטוף את השקופיות פעמיים במים מזוקקים כפולים למשך שתי דקות. טבול את השקופיות בכלי כימי (beaker) של 1000 מיליליטר המכיל 450 מיליליטר של ריאגנט קדם-טיפול 2.בשלב הבא, הרתיחו את השקופיות במשך חמש דקות בסך הכל בטמפרטורה של 100 °C כדי לשחזר את מבנה ה-RNA. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים במים מזוקקים כפולה במשך שתי דקות בכל פעם. הניחו את השקופיות באלכוהול 100% למשך חמש דקות.לאחר מכן, ייבשו את השקופיות למשך חמש דקות. במנדף, השתמשו בעט הידרופובי כדי לצייר עיגול מסביב לאזור הנבחר בחתך הרקמה. לאחר מכן, טפטפו 10 µL מרכיב הקדם-טיפול השלישי לכל אזור נבחר כדי להגביר את חדירות הגשוש (probe) וכסו את תבנית הלחות במכסה.לאחר מכן, הניחו את המגש בתנור ההכלאה (hybridization oven) המצויד במנער אופקי. הגדירו את טמפרטורת התנור ל-40 °C ונערה בעדינות את המגש למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים במים מזוקקים פעמיים למשך שתי דקות בכל פעם. בשלב זה, טפטפו 10 µL של P-P-I-B-D-A-P-B או probe HTR two A על האזורים הנבחרים.לאחר מכן, כסו את מגש הלחות במכסה כדי למנוע התאיידות של הרכיב. נערו בעדינות את השקופיות על השייקר האופקי במהירות נמוכה תוךما דגירה בתנור בטמפרטורה של 40 °C למשך שעתיים. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם בופר שטיפה למשך שתי דקות בכל פעם, וטפטפו 10 µL של רכיב הגברה 1 (amplification one reagent) על כל אזור נבחר.נערו והדגירו את השקופיות בטמפרטורה של 40 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם בופר שטיפה למשך שתי דקות בכל פעם, והעבירו באמצעות פיפט 10 µL של ריאגנט ההגברה 2 לכל אזור שנבחר. נערו והדגירו את השקופיות בטמפרטורה של 40 °C למשך 15 דקות.לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם בופר שטיפה למשך שתי דקות. בכל פעם, טפטפו 10 µL של ריאגנט הגברה 3 על כל אזור שנבחר. נערו והדגרו את השקופיות בטמפרטורה של 40 °C למשך 30 דקות.לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם תמיסת שטיפה למשך שתי דקות. העבירו בפיפטה 10 µL של ריאגנט הגברה 4 לכל אזור שנבחר. נערנערו והדגרו את השקופיות בטמפרטורה של 40 °C למשך 15 דקות.בשלב הבא, שטפו את השקופיות פעמיים עם בופר שטיפה למשך שתי דקות. טפטפו 10 µL של ריאגנט הגברה חמש על כל אזור נבחר. נערה והדגיתו את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם בופר שטיפה למשך שתי דקות. טפטפו 10 µL של ריאגנט הגברה שש על כל אזור שנבחר. נערו והדגירו את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.לאחר מכן, שטפו שוב את השקופיות פעמיים עם תמיסת שטיפה למשך שתי דקות בכל פעם. כעת, העבירו בפיפטה 10 µL מהריאגנט האדום לכל אזור נבחר, הניחו את השקופיות במגש הלחות על השייקר האופקי בטמפרטורת החדר ונערה בעדינות במהירות נמוכה למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים במים מזוקקים כפולים למשך 10 דקות.בכל פעם, ייבשו את השקופיות בתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, הניחו את השקופיות בתוך xylene במכסה הfume hood למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו בפיפט 20 µL של חומר הרכבה מבוסס xylene לכל אזור שנבחר וכסו בזכוכית כיסוי.בשלב זה, גררו והניחו את קובץ התמונה אל חלון התמונה הראשי J. עברו לסרגל התפריטים ובחרו ב-image. לאחר מכן, בחרו ב-type מהתפריט הנפתח ובחרו ב-eight bit.בשלב הבא, בחרו ב-adjust ולאחר מכן ב-threshold כדי לפתוח את תיבת הדיאלוג. התאימו את ערך הסרגל התחתון בתיבת הדיאלוג כך שהרקע הבלתי רצוי יוסר. עברו לשורת התפריטים ובחרו ב-Analyze, ולאחר מכן ב-analyze particles כדי לפתוח תיבת דיאלוג שנייה.הגדירו את גודל החלקיקים ל-10. לאחר מכן, בחרו באפשרות להצגת קווי מתאר ובחרו בהצגת תוצאות ותיבות סיכום. לבסוף, לחצו על אישור כדי לצפות בנתוני החלקיקים בתיבות הדיאלוג.לצורך חישוב בגיליון אלקטרוני, הזניחו את הנתונים לתוך גיליון ה-Excel וחשבו את הממוצע של מספר החלקיקים בקבוצת המלח (saline) כקו בסיס. לאחר מכן, חשבו את רמת האחוזים של כל חלק והכינו גרף בהתאם. להלן תמונות במיקרוסקופ אור של אותות ההכלאה (hybridization), המסומנים בנקודות אדומות.רקמות קובעו בפורמלין בחולדות תחת הרדמה עמוקה שטופלו בעבר בתמיסת מלח (saline) וב-MDMA. הגששים האוליגונוקלאוטידיים שנעשה בהם שימוש הם D-A-P-B-P-P-I-B ו-HT two A. איור זה מראה את ההשפעה על ביטוי הגן HT two A בהיפותלמוס בחולדות שטופלו בעבר ב-MDMA, ונצפתה הפחתה של 20% בביטוי של HT two A. טכניקה זו מקלה על חוקרים בתחום מדעי המוח למדוד ביטוי של גני mRNA, באמצעות היברידיזציה in situ ברקמת מוח שקובעה בפורמלין.

rapid-situ-hybridization-using-oligonucleotide-probes-on

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

סרטון זה מדגים את הזיהוי של סינתזת RNA של קולטני סרוטונין באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטידים ברקמת מוח של חולדות המושפעות מתסמונת סרוטונין. הפרוטוקול כולל טיפול מקדים ברקמות, הכלאת בדיקה וזיהוי אנזימטי כדי לדמיין ולכמת את ביטוי ה-RNA של קולטני סרוטונין במיקרוסקופ.

הכלאה באתרה באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטידים לחקר ביטוי RNA בחלקי מוח של חולדות

מקור: Jolly, S., et.al. שילוב של פלואורסצנציה כפולה  בהכלאה באתר עם תיוג חיסוני לזיהוי ביטוי של שלושה גנים במקטעי מוח של עכברים. J. Vis. Exp. (2016). סרטון זה מדגים את השימוש בפלואורסצנציה כפולה בהכלאה באתרה כדי לדמיין את הביטוי של שתי מטרות RNA במקטעי מוח של עכברים. הפרוטוקול כולל זיהוי רציף של RNA באמצעות בדיקות המסומנות בפלואורסצאין איזותיוציאנט ודיגוקסיגנין, ואחריו הגברת אות אנזימטית להגברת הרגישות. הקרינה המתקבלת מאפשרת ניתוח לוקליזציה משותפת של רנ"א המטרה בתוך הרקמה.

 ביצוע הכלאה של פלואורסצנציה כפולה באתרה לאיתור ביטוי גנים במקטעי מוח של עכבר

RNA in situ hybridization (ISH) מאפשר הדמיה של RNA בתאים וברקמות. כאן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בהצלחה בשילוב של RNAscope ISH עם אימונוהיסטוכימיה או צבעים היסטולוגיים כדי לזהות mRNAs הממוקמים באקסונים בחלקים של מוחות עכברים ובני אדם.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

לוקליזציה של ביטוי גנים לסוגי תאים ספציפיים יכולה להיות מאתגרת בשל היעדר נוגדנים ספציפיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי משולש בו זמנית של ביטוי גנים על ידי שילוב של RNA פלואורסצנטי כפול הכלאה באתרו עם צביעה חיסונית.

שילוב קרינה זוגית<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

הפעלנו גירוי מגנטי טרנס-גולגולתי חוזר ונשנה (rTMS) על ההמיספרה החד-צדדית של מוח החולדה, על ידי הנחת סליל 25 מ"מ דמות 8 1 ס"מ לרוחב הקודקוד על הקו הדו-אוזני וזווית הסליל ב-45 מעלות. מערכת קירור מים פנימית שימשה ל-rTMS במשך יותר מ-20 דקות.

גירוי מגנטי Transcranial חוזרים אל חצי הכדור החד-צדדית של המוח עכברוש

זיהוי של דופמין קולטן D1-אלפא גרעין האקומבנס חיוני שהבהרת בתפקוד קולטן D1 בזמן מחלה במערכת העצבים המרכזית. ביצענו את הרומן RNA בחיי עיר הכלאה assay להמחיש מולקולות RNA יחיד באזור ספציפי במוח.

זיהוי של דופמין קולטן D1-אלפא בתוך מכרסמים גרעין האקומבנס על ידי טכנולוגיה חדשנית RNA בחיי עיר זיהוי

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC) באזורי מוח עכבר טריים קפואים וקבועים, במטרה להשיג FISH רב-תוויות ואות IHC פלואורסצנטי. IHC התמקד בחלבונים ציטופלזמיים וחלבונים המחוברים לממברנה.

שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים

DetectSyn הוא בדיקה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת המודדת שינויים במספר הסינפסות היחסי (טרום ופוסט-סינפטי) בין טיפולים או מצבי מחלה. טכניקה זו משתמשת בטכניקת קשירת קרבה שניתן להשתמש בה הן בתאי עצב בתרבית והן ברקמות קבועות.

DetectSyn: שיטה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת לזיהוי שינויים בצפיפות הסינפסה

הקמנו מבחן הכלאה דופלקס באתרו למיפוי איזופורמים של קולטני אינסולין IR-A ו-IR-B במקלעת הכורואיד של העכבר, תוך התגברות על מגבלות השיטות המסורתיות. גישה ברזולוציה גבוהה זו חושפת ביטוי ספציפי לאיזופורמים, ומציעה תובנות חדשות לגבי איתות אינסולין במוח וטיפולים ממוקדי איזופורמים פוטנציאליים להפרעות נוירולוגיות.

הדמיה מדויקת של קולטני אינסולין A ו-B במוח עכברים עם בדיקת היברידיזציה של RNA באתרו

למדו שיטת הכלאה באתר מהירה לזיהוי ביטוי גנים במוח חולדות באמצעות זנודות oligonucleotide. הפרוטוקול מאומת בזיהוי גן htr2a ומאפשר ניתוח כמותי של רמות mRNA בפחות מיומיים.

מהיר

גלה סרטונים נוספים