מהיר באתר הכלאה באמצעות oligonucleotide בדיקות במוח-התחילית Paraformaldehyde של חולדות עם סרוטונין תסמונת

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע הכלאה מהירה ב-C 2 על רקמת מוח עם קידומת אלדהיד פרפורמית. זה מושג על ידי ייבוש ראשוני של חלקי רקמת המוח וטיפול בחלקים עם ריאגנטים אחד, שניים ושלושה לפני הטיפול. השלב השני הוא הכלאה של החלקים עם בדיקות אוליגונוקלאוטידים ראשוניות ולאחר מכן בדיקות שנייה, שלישית ורביעית.

לאחר מכן, הוסף מצע אדום מהיר כדי לזהות RNA מטרה. השלב האחרון הוא לכמת את רמת אותות ה-mRNA עם תוכנת Image J. בסופו של דבר, ניתן להשיג שינויים בביטוי הגנים של RNA על ידי השוואה בין קבוצות הניסוי והביקורת.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שהיא פשוטה יחסית, זולה ניתנת לשחזור ולוקחת פחות מיומיים להשלים. עבודה זו פותחה על ידי ג'ון ג'יי לנאן מבית הספר לרפואה וטרינרית של אוניברסיטת רוס וג'ין סוזה ורו טאו מהמכללה לרפואה, אוניברסיטת פלורידה אטלנטיק. בהליך זה, ההתייבשות שלה לוקחת ארבע שקופיות מקופסאות מיקרוסקופ המאוחסנות במקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס.

הקצה את החלקים לבדיקות של P-P-I-B-D-A-P-B ו-HT שני גנים A מסמנים ותייג אותם בעט כדורי. לאחר מכן, טבלו את המגלשות ב-100% אלכוהול בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן יבש את השקופיות במשך חמש דקות במכסה האדים לטיפול מקדים פיפטה 20 מיקרוליטר של הטיפול המקדים מגיב אחד לכל חלק, הנח את השקופיות על מסילת מתלה במגש לחות.

יש לנער בעדינות את מגש הלחות על שייקר אופקי במהירות נמוכה למשך 10 דקות. לאחר מכן שטפו את המגלשות פעמיים במים מזוקקים כפולים למשך שתי דקות. טבלו את השקופיות בכוס של 1000 מיליליטר המכילה 450 מיליליטר של שני ריאגנטים לטיפול מקדים.

לאחר מכן, הרתיחו את השקופיות למשך חמש דקות בסך הכל בחום של 100 מעלות צלזיוס כדי לשחזר את מבנה ה-RNA. לאחר מכן, שטפו את המגלשות פעמיים במים מזוקקים כפולים למשך שתי דקות בכל פעם. מניחים את השקופיות ב-100% אלכוהול למשך חמש דקות.

לאחר מכן יבש את השקופיות למשך חמש דקות. במכסה האדים, השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר עיגול סביב האזור שנבחר בקטע הרקמות. לאחר מכן, פיפטה 10 מיקרוליטר של הטיפול המקדים שלושה ריאגנטים לכל אזור שנבחר כדי להגביר את חדירת הבדיקה ולכסות את מגש הלחות במכסה.

לאחר מכן, הכניסו את המגש לתנור ההיברידיזציה המצויד בשייקר אופקי. מכוונים את טמפרטורת התנור ל -40 מעלות צלזיוס ומנערים בעדינות את המגש למשך 30 דקות לאחר מכן, שוטפים את השקופיות פעמיים במים מזוקקים כפולים למשך שתי דקות בכל פעם. בשלב זה, פיפטה 10 מיקרוליטר של בדיקה P-P-I-B-D-A-P-B או HTR 2 A על האזורים שנבחרו.

לאחר מכן מכסים את מגש הלחות במכסה כדי למנוע אידוי של המגיב. מנערים בעדינות את השקופיות על השייקר האופקי במהירות נמוכה תוך כדי דגירה בחום של 40 מעלות צלזיוס בתנור למשך שעתיים. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך שתי דקות בכל פעם, פיפטה 10 מיקרוליטר של ההגברה מגיב אחד על כל אזור שנבחר.

מנערים ומדגרים את השקופיות בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך שתי דקות בכל פעם, פיפטה 10 מיקרוליטר של ההגברה שני מגיב על כל אזור שנבחר. מנערים ומדגרים את המגלשות בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך שתי דקות. בכל פעם, פיפטה 10 מיקרוליטר של ההגברה שלושה ריאגנטים על כל אזור שנבחר. מנערים ומדגרים את השקופיות בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר מכן שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך שתי דקות. פיפטה 10 מיקרוליטר של מגיב ההגברה ארבעה על כל אזור שנבחר. מנערים ומדגרים את המגלשות בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך שתי דקות. פיפט 10 מיקרוליטר של מגיב ההגברה חמישה על כל אזור שנבחר. מנערים ומדגרים את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך שתי דקות. פיפט 10 מיקרוליטר של ההגברה שישה ריאגנטים על כל אזור שנבחר. מנערים ומדגרים את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

לאחר מכן שטפו את השקופיות שוב פעמיים עם מאגר כביסה למשך שתי דקות בכל פעם. כעת פיפטה 10 מיקרוליטר מהמגיב האדום לכל אזור שנבחר, הניחו את השקופיות במגש הלחות על השייקר האופקי בטמפרטורת החדר ונערו בעדינות במהירות נמוכה למשך 10 דקות. לאחר מכן שטפו את המגלשות פעמיים במים מזוקקים כפולים למשך 10 דקות.

בכל פעם מייבשים את השקופיות בחום של 60 מעלות צלזיוס בתנור למשך 15 דקות. לאחר מכן, הניחו את השקופיות בקסילן במכסה האדים למשך חמש דקות. לאחר מכן, פיפטה 20 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה מבוססי קסילן על כל אזור שנבחר וכסו בהחלקת כיסוי.

בשלב זה, גרור ושחרר את קובץ התמונה לחלון J של התמונה הראשית. עבור לשורת התפריטים ובחר תמונה. לאחר מכן, בחר סוג מהתפריט הנפתח ובחר שמונה סיביות.

לאחר מכן, בחר התאמה ולאחר מכן בחר סף כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח. התאם את ערך הסרגל התחתון בתיבת הדו-שיח כך שהרקע הלא רצוי יוסר. עבור אל שורת התפריטים ובחר נתח, ולאחר מכן בחר נתח חלקיקים כדי לפתוח תיבת דו-שיח שנייה.

הגדר את גודל החלקיקים ל-10. לאחר מכן, בחר הצג קווי מתאר ובחר הצג תוצאות ותיבות סיכום. לבסוף, לחץ על אישור כדי להציג נתוני חלקיקים בתיבות הדו-שיח.

לחישוב גיליון אלקטרוני, הזן את הנתונים בגיליון Excel וחשב ממוצע של מספר החלקיקים בקבוצת המלח כקו בסיס. לאחר מכן חשב את רמת האחוזים של כל קטע וצור גרף בהתאם. להלן התצוגות המיקרוסקופיות הקלות של אותות ההכלאה המסומנים על ידי הנקודות האדומות.

רקמות קיבלו קידומת של אלדהיד פרפורמי בחולדות שעברו הרדמה עמוקה שטופלו בעבר במי מלח ו-MDMA. בדיקות האוליגונוקלאוטידים המשמשות הן D-A-P-B-P-P-I-B, ו-HT 2 A.איור זה מראה את ההשפעה על ביטוי הגן HT 2 A בהיפותלמוס בחולדות שטופלו בעבר ב-MDMA והפחתה של 20% ב-HT 2, נצפתה ביטוי. טכניקה זו מקלה על חוקרים בתחום מדעי המוח למדוד את ביטוי הגנים של השליח Ra, באמצעות איזציה באתרה על פרפורם, רקמת המוח עם קידומת הגובה.