ריאות הגידול תא גיוס Assay
26 בפברואר 2019
כתב יד זה מתאר שיטה לכמת הצטברות תאים גידול בריאות במודל חיה של גרורות הגידול.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הגידול על המנגנונים המולקולריים של גרורות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי גיוס של תאים סרטניים בתוך איבר מרוחק ניתן לכמת. התחל על ידי שימוש ריאגנט דיסוציאציה תאים שאינם אנזימטיים כדי להסיר חלבון פלואורסצנטי מבטא קרצינומה ריאות לואיס, או LLC, תאים ממכל התרבות שלהם על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
העבר את פתרון התא וכתוצאה מכך לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר לפני צנטריפוגה, צנטריפוגה לשטוף את כדורי פעמיים בחמישה מיליליטר של PBS לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, מסננים את התאים דרך מסננת תאי נקבוביות של 40 מיקרומטר, ומדללים את ההשעיה לריכוז של פי 10 לששת התאים למיליליטר. ואז לטעון את התאים לתוך מזרק אחד מיליליטר מצויד מחט 29-מד, ולהזריק 100 microliters של תאים לתוך וריד הזנב של כל שמונה עד 10 שבועות, C57-שחור-6, עכבר זכר.
בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, השתמש במספריים כדי להסיר את העור מפני השטח הגחוניים של כל עכבר, וחתוך את הצלעות והסרעפת כדי לחשוף את חלל בית החזה. השתמש מחט עירוי מכונף 25-מד צינורות כדי לשטוף 15 מיליליטר של PBS דרך החדר הימני, ולהסיר את הלב ואת התימוס. אוחז את קנה הנשימה עם מלכודות, למשוך למעלה, לנתח את רקמות החיבור סביב קנה הנשימה, כדי לקצור את הריאות.
ואז לשטוף את הריאות PBS, ולנתק אונה אחת להדמיה של התאים הפלואורסצנטיים במקום תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לעכל את רקמת הריאה, ראשית קוביות האונה caudal עם מספריים, ולמקם את חתיכות הריאה במזרק 10 מיליליטר. סגור את המזרק עם הבוכנה, ושואפ חמישה מיליליטר של פתרון עיכול לתוך המזרק, הזזת הבוכנה פנימה ומחוץ לפיר המזרק עד רקמת הריאה מופץ לאורך כל הפתרון.
מחלקים את תרחיף הריאה לצינור 50 מיליליטר, ולעכל את הרקמה על שייקר הדדי במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 150 סל"ד. בסוף הדגירה, triturate הרקמה הנותרת עד תאי הריאה מפוזרים לחלוטין, ולהחזיר את הצינור שייקר במשך 30 דקות נוספות. לאחר מכן לסנן את התאים דרך מסננת נקבוביות 40 מיקרומטר, ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.
כדי לנתח את תאי הריאה המבודדים על ידי ציטומטריית זרימה, להשתמש שוב את גלולה בשני מיליליטר של חיץ תמוגה תא דם אדום במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. ואז צנטריפוגה גלולה פעמיים בחמישה מיליליטר של PBS טרי בתוספת 1% אלבומין סרום בקר לכל לשטוף. לאחר הצנטריפוגה השנייה, יש למצות את גלולת הכדור במיליליטר אחד של PBS טרי בתוספת BSA, ולסנן את התאים באמצעות מסננת נקבוביות חדשה של 40 מיקרומטר לכימות תאי הגידול על ידי ציטומטריית זרימה.
הריאות מציגות תאים רבים GFP-LLC שעתיים לאחר ההזרקה, עם הרוב המכריע של התאים נעלמים מן הריאות בתוך 24 שעות. שים לב שיש לא לכלול בספירת התאים כתמים פלואורסצנטיים שזוהו בתוך המסנן האדום. כדי לאשר את מספר GFP-LLC בריאות, אחת האונות יכולה לשמש לניתוח ציטומטרי זרימה כפי שהודגם.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי הליך סעיף קפוא היא שיטה מדויקת יותר להתבוננות במיקום המדויק של תאים סרטניים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב יד זה מתאר שיטה לכימות הצטברות תאי גידול בריאות במודל חיות של גרורות גידול. טכניקה זו מאפשרת כימות של גיוס תאי גידול בתוך איבר מרוחק, ובכך מספקת תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים של גרורות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אונקולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- הבנת גרורות גידולים היא קריטית למחקר הסרטן.
- כימות הצטברות תאי גידול יכול לחשוף תובנות ביולוגיות חשובות.
- השימוש במודלים של בעלי חיים נפוץ בחקר התקדמות הסרטן.
- תאים המבטאים חלבון פלואורסצנטי מקלים על המעקב והכימות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לכימות הצטברות תאי גידול בריאות.
- בחינת גיוס תאי גידול במודל גרורתי.
- העמקת ההבנה של המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הגרורה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש במא reagent לדיסוציאציית תאים שאינו אנזימטי.
- סנטריפוגציה ושטיפה של משקעי תאים ב-PBS.
- סינון תאים דרך מסננת תאים בעלת נקבים של 40-micrometer.
- הזרקת תרחיף תאים מדולל לווריד הזנב של עכברים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת כימות יעיל של הצטברות תאי גידול.
- הוכח כי ניתן לעקוב אחר תאי גידול in vivo.
- סופקו תובנות לגבי הדינמיקה של גיוס תאי גידול.
- השיטה תרמה להבנת תהליכי גרורות.
מסקנות
- שיטה זו מהווה כלי בעל ערך לחקר הביולוגיה של גידולים סרטניים.
- היא משפרת את היכולת לחקור גרורות במודלים של בעלי חיים.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על טכניקה זו כדי לבחון מטרות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקה זו מאפשרת הערכה כמותית של גיוס תאי גידול לאיברים מרוחקים, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליך גילוי תרופות המכוונות למטסטזיס. על ידי עקיפת שלבי הפלישה של הגידול הראשוני, היא מתמקדת באינטראקציות סטורמליות ובאירועי יציאה מכלי דם (extravasation) הקריטיים לתיקוף יעדים בשלב הפרה-קליני. השיטה מספקת מדד הניתן לשחזור ובקנה מידה רחב להערכת תרכובות אנטי-מטסטטיות in vivo.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות לגבי תרומה של הסטרומה למטסטזיס באיברים רחוקים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי כימות הצטברות תאי גידול בריאות לאחר הזרקה.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי תרופות על ידי מדידת השפעות של תרכובות על דינמיקת גיוס תאי גידול.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר פלטים כמותיים וסטנדרטיים באמצעות ציטומטריית זרימה עבור קמפיינים של סריקת תרכובות.
- שחזוריות: משתמש בריכוזי תאים ונפחי הזרקה מוגדרים כדי להבטיח מודלי גרורות עקביים.
- סקביליות: תואם לעיבוד בבארות מרובות ולניתוח בעל תוכן גבוה (high-content analysis) לצורך הפחתת סיכונים של מטרות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה מיקרו-מטאסטזות בריאה כדי לחקור מנגנוני התנחלות ספציפיים לאיבר.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאי מחקר לגילוי לבין תיקוף פרה-קליני של חומרים אנטי-מטאסטטיים.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקריטריוני "המשך/עצירה" (go/no-go) בהתבסס על הפחתה במספר תאי הגומלול המסומנים.
שילוב תהליכי עבודה וקוים למסירה
מיקומים בתוך רצף הגילוי, החל מבדיקת השערות על מטרות ועד לאופטימיזציה של תרכיבים מובילים, המאפשרים הערכה כמותית של תרכובות המווסתות גרורות.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בחקירה מכניסטית של אינטראקציות בין גידול לסטרומה בנישות מטאסטטיות.
- סריקה: מספק קריאות כמותיות מבוססות פלואורסצנציה לצורך תיקוף פגיעות (hits) במבחני מטאסטזה.
- אנליטיקה: מייצר נתוני תאי גידול ניתנים לספירה באמצעות ציטומטריה של זרימה לצורך ניתוח סטטיסטי ומעקב של תגובה למינון.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם אסטרטגיות של סממנים ביולוגיים על ידי מעקב אחר התפשטות תאים מסומנים in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמה לשימוש חוזר למחקרי מנגנוני מטאסטזה חוצי-פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במסלולי גרורות באמצעות גיוס מדיד הסגופי לאיברים.
- ערך תפעולי: מנstandardיז את הובלת תאי הגידול ועיבוד הרקמות לצורך השוואות הדירות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור הפחתת סיכונים מוקדמת של תרופיתים המכוונים לגרורות.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בקבלת החלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על נתוני דיכוי גרורות פרה-קליניים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהזרקה לווריד הזנב של עכברים ובטכניקות לפירוק רקמות.
- תלוי במכשור ציטומטריה זורמת ובבקרות פיצוי פלואורסצנציה.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת תאים בין צוותי המחקר.
- כולל אופטימיזציה של מינון התאים כדי למנוע אותות מטעות כתוצאה מהצטברות מופרזת בריאות.
- מוגבל לכימות ההצטברות בריאות; אינו לוכד פלישה של גידול ראשוני או צמיחה מטאסטטית מאוחרת.
