דור של תאי גזע האינטגרציה נטול האדם המושרה pluripotent שימוש קרטינוציטים נגזר שיער

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים באמצעות קרטינוציטים שמקורם בשיער. זה מושג על ידי בידוד שערות מתורם. השלב השני הוא ציפוי השערות על מנת להקל על צמיחת קרטינוציטים.

לאחר מכן, הקרטינוציטים נשמרים ומורחבים במבחנה. השלב האחרון הוא לתכנת מחדש את הקרטינוציטים לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם באמצעות שיטת תכנות מחדש אפיזומלית. בסופו של דבר, ניתן לבודד ולאפיין תאי IPS אנושיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה כדי להראות את הביטוי של סמנים פלוריפוטנטיים.

היתרון הכולל של שיטה זו על פני שיטות קיימות כגון שיטה רטרו-ויראלית או לנטי-ויראלית, הוא שעל ידי שימוש בגורם אפיזומלי, אנו נמנעים מטרנסגן לא רצוי. ההשתלבות בגנום בתאי הגזע הנוצרים מתחילים על ידי הפשרת בקבוקון של תמיסת מטריצה חוץ-תאית על קרח בן לילה. למחרת בבוקר, השתמש בקצות פיפטה מקוררות מראש כדי להוסיף 200 מיקרוליטר מהתמיסה ל-12 מיליליטר של מדיום DM F 12 צונן.

הוסף מיליליטר אחד מתמיסת המטריצה החוץ-תאית המדוללת לכל באר של 12. צלחת היטב ודגר את הצלחת למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס כדי לצפות את הבארות במטריצה. לאחר מכן, אספו שיער אנושי ראשוני מראשו של התורם על ידי הנחת אצבעות קרוב לשורש השיער ומריטת השיער בתנועה אחת מהירה וחלקה.

בדוק כדי לוודא שכל שערה שנאספה מכילה זקיק שיער שלם. הניחו את הזקיק מתחת למיקרוסקופ מנתח וקבעו את שלב הצמיחה של כל שערה. אספו חמש עד 10 שערות אנטיגן מכל אדם כדי לחלץ קרטין.

שלב האנטיגן, בניגוד לשלב T, מכיל שכבות מרובות של אפיתל. הכניסו את דגימות השיער לצלחת פטרי המכילה 10 מיליליטר של תערובת אנטיביוטיקה למשך חמש דקות, ולאחר מכן שטפו אותן ב-PBS במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, תפסו את השיער בעזרת מלקחיים סטריליים והשתמשו במספריים סטריליים כדי לחתוך את פיר השיער העודף, ולהשאיר שבר שיער עם זקיק שיער שלם וכ-0.5 עד סנטימטר אחד של פיר שיער.

העבירו בזהירות שבר שערה אחד לכל באר של הצלחת המצופה מטריצה חוץ-תאית. באמצעות המלקחיים הסטריליים אני מלטף כ-100 עד 200 מיקרוליטר של תחליף סרום. טיפה בינונית לכל באר המכילה דגימות שיער.

לאחר מכן הניחו את הצלחת בחממה ואפשרו לזקיקים להיצמד למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למחרת. יש להוסיף בעדינות עוד 100 עד 200 מיקרוליטר של תחליף סרום, בטמפרטורה בינונית כדי לשמור על לחות דגימות השיער. בדוק את דגימות השיער מדי יום כדי לוודא שזקיקי השיער נצמדו בהצלחה לצלחת.

לאחר החיבור, הוסיפו בעדינות 500 מיקרוליטר נוספים של מדיום לבאר. החלף מדיה כל יומיים. Preco צלחת שישה קירות עם קולגן.

סוג אחד באמצעות טיפול מקדים כגון ערכת מטריצת ציפוי ב-680 מיקרוליטר של מדיום הדילול מהערכה לכל באר ואחריה 6.8 מיקרוליטר של תמיסת מטריצת הציפוי. נענע את הצלחת בעדינות כדי להבטיח ציפוי אחיד. הניחו לצלחת המצופה לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני ציפוי הקרטינוציטים.

הסר את תמיסת הציפוי, פרק את הקרטינוציטים בתרבית לתרחיף תא בודד על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין לבאר ודגיר הצלחות למשך שתיים עד חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שהתאים משתחררים מהצלחת, השביתו את הטריפסין עם 500 מיקרוליטר של סרום המכיל מדיום ואספו את התאים בצינור סטרילי של 15 מיליליטר. הסר את שבר השיער באמצעות מלקחיים מעוקרים, גלולה את התאים ולאחר מכן החייאה.

השעו אותם בצלחת גידול קרטינוציטים טריים 40,000 קרטינוציטים לבאר אחת של הצלחת המצופה קולגן בנוכחות מדיום קרטינוציטים. החלף את המדיה כל יום והעביר את התאים כאשר התרבית היא בערך 80% קוד V משולב צלחת שש דופן עם ג'לטין על ידי הוספת שני מיליליטר של תמיסת ג'לטין של 0.1% לכל אחד, ובכן אפשר לג'לטין לצפות לפחות 20 דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, יש לפרק את הקרטינוציטים העוברים שש ומטה לתרחיף תא בודד על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.25% טריין לבאר ודגירה של התאים למשך שתיים עד חמש דקות.

בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, השביתו את הטריפסין עם מיליליטר אחד של חומר המכיל סרום ואספו את התאים בשפופרת של 15 מיליליטר. גלולה את התאים והשעיה אותם מחדש במדיום קרטינוציטים. לאחר מכן צלחת 100,000 עד 150,000 קרטינוציטים לבאר בצלחת שש בארות מג'לטין ודגירה אותם למשך הלילה למחרת, יום האפס, בדוק את הצלחת כדי לוודא שהתאים מתכנסים 50 עד 60%.

בצע טרנספקציה של וקטורי התכנות מחדש האפיזומליים על הקרטינוציטים באמצעות יחס של שמונה מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה לשני מיקרוגרם של DNA פלזמה כולל כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. למחרת, היום הראשון, החליפו את תווך הקרטינוציטים ובדקו את יעילות הטרנספקציה על ידי הערכת אחוז התאים החיוביים לחלבון פלואורסצנטי ירוק תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יעילות טרנספקציה של 60 עד 70% צפויה ביום השני.

חזור על הטרנספקציה כדי להגביר את יעילות הטרנספקציה ליותר מ-90%ואז קודד מראש צלחת של 10 סנטימטר עם חמישה מיליליטר של 0.1% ג'לטין למשך 20 דקות לפחות. צלח 4 מיליון תאי הזנה מומתים מיטוטית לכל צלחת של 10 סנטימטר במדיום FBS כמתואר בקונרד אל הכל ואפשר לתאים להתיישב ולהיצמד למשך הלילה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ביום השלישי. קצרו את הקרטינוציטים שעברו טרנספטציה כפי שהוצג קודם לכן, והשעו אותם מחדש בצלחת בינונית KSR.

90% מהקרטינוציטים מאחת הבארות לתוך צלחת של 10 ס"מ שהוכנה עם תאי הזנה ומכסים אותם ב-KSR. מדיום לבודד מושבות תאי גזע פלוריפוטנטיות המושרות על ידי בני אדם על ידי דיסקציה ידנית מהיום ה-21 ואילך. הימנע ממושבות המקובצות זו לזו ובחר רק מושבות המופרדות בבירור מאחרות.

לדיסקציה ידנית, השתמש במחט בגודל 26 כדי לחתוך את המושבות לחתיכות קטנות באורך של כ-300 עד 600 מיקרומטר תחת מיקרוסקופ חיתוך. העבירו את החלקים ממושבה אחת לתוך צלחת הזנה חדשה של MEF כדי ליצור קו משובט של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. ברגע שהתרבית מגיעה ל-70 עד 80% עם מושבות תאי גזע פלוריפוטנטיות אנושיות בקוטר של כ-1.5 מילימטרים, התאים משתמשים בשיטות אריזה אנזימטיות סטנדרטיות כגון אקוטן, סאז או קולגנאז.

ארבעה, על פי הוראות היצרן. כאשר מקפידים על פרוטוקול זה, ניתן להבחין בצמיחה של השיער כבר שלושה ימים לאחר הצמדת השיער וימשיכו להתרבות. הקרטינוציטים המוצגים כאן הועברו על לוח חדש וניתן לשמור על תאים אלה למספר מעברים.

תמונה זו מציגה מושבת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושית טיפוסית שמקורה בקרטינוציטים. לאחר 32 יום של תכנות מחדש, יכולה להתרחש התמיינות מסוימת במרכז מושבת תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרה על ידי בני אדם. לאחר שנבחרו ידנית, התאים הנגזרים מציגים בדרך כלל יחס גרעין גבוה לציטופלזמי וגבול מושבה מוגדר.

הם גם מבטאים מספר סמנים פלוריפוטנטיים כגון OCT 4 nag ו-TRA אחד 60. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ קרטינוציטים משיער ולתכנת אותם מחדש לתאי גזע לכאורה המושרים על ידי בני אדם.