Name: דור של תאי גזע האינטגרציה נטול האדם המושרה pluripotent שימוש קרטינוציטים נגזר שיער (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: חקור שיטה ליצירת תאי גזע pluripotent מושרים מקרטינוציטים נגזרי שיער באמצעות וקטורים אפיזומליים ללא אינטגרציה גנומית. שיטה זו מאפשרת ייצור תאים לרפואה רגנרטיבית ומחקר מחלות בבטיחות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות להארין רנג'יתקומאראן ולסטייסי ג'קסון על התמיכה הטכנית. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהמועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (R.C.B. Wong, A. Pébay), אוניברסיטת מלבורן (R.C.B. Wong), רשתית אוסטרליה (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) והמכון לחקר העיניים של אוסטרליה (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); מלגת העתיד של מועצת המחקר האוסטרלית (A. Pébay, FT140100047), מלגת קרן קרנבורן (R.C.B. Wong); מימון פנימי מהמכונים הלאומיים לבריאות (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) ותמיכה בתשתיות תפעוליות מהממשלה הוויקטוריאנית.

האוסף של מדגם שיער אדם מאנשים דורש אישור אתי על ידי ועדת האתיקה מחקר האנושית במוסדות המארח וצריך להיעשות בהתאם להנחיות מוסדיות. 1. בידוד של קרטינוציטים משיער פריטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מטריקס הפשרת פתרון (ECM) (כלומר, Matrigel) בO קרח / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת הטיפים פיפטה מראש צונן, להוסיף 200 פתרון ECM μl 12 מיליליטר של מדיום DMEM / F12 המצונן. מעיל צלחת 12-היטב עם 1 מיליליטר של תמיסת ECM מדוללת לכל אחד. דגירה O הצלחת המצופה / N על 37 מעלות צלזיוס. לשטוף את הצלחת המצופה עם DMEM בינוני F12 / מראש חימם לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את שיער אנושי ראשוני מראשו של הפרט על ידי הצבת את אצבעות קרובות לשורש השיער ומריטת השיער בתנועה אחת מהירה וחלקה. בדוק כדי לוודא שכל שיער שנאסף מכיל זקיקי שיער ללא פגע ולקבוע את שלב הצמיחה של האו&quot;ם השיערder מיקרוסקופ לנתח (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 5-10 שערות anagen מכל אדם כדי לחלץ קרטינוציטים. תהליך קטף שערות בהקדם האפשרי על מנת להבטיח גזירה מוצלחת של קרטינוציטים. הערה: איור 1 מדגים את המורפולוגיה של שערות בשלבים שונים של מחזור הצמיחה. שיער אנגן הוא בשלב הצמיחה, עם שכבה חיצונית גלויה של האפיתל המקיף את אורכו של השיער, הידוע בשם ORS. מצד השני, שיער telogen מייצג שיער בשלב המנוחה ואין לי ORS גלוי, אך יש לו כדור ברור של תאים המכסים את השורש של השיער, הידוע בשם בליטת telogen. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את דגימות שיער לתוך צלחת פטרי המכילה 10 מיליליטר של האנטיביוטיקה מיקס לשטוף במשך 5 דקות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים ומלקחיים מעוקרים, מנותק שערה מוגזמת, עוזב בר שיער עם זקיק שיער ללא פגע וסביב 0.5-1 סנטימטר של שערה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרה בזהירותnsfer בר שיער 1 לבאר כל צלחת ECM מצופה באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 1 מיליליטר, להוסיף טיפות כ 3 של החלפת נוק סרום בינוני (KSR) (~ 100 - 200 μl) על דגימות השיער. הערה: שמור את שברי השיער בקשר הדוק אל פני השטח הצלחת כדי לאפשר התקשרות ותולדת keratinocyte שלאחר מכן. הוספת תקשורת מוגזמת בשלב זה רשאי גורם ברי השיער לצוף ומקטין את הסיכוי של קובץ מצורף שיער מוצלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות השיער בחממה 37 ° C עם 5% CO 2 ולאפשר את זקיקי השיער לצרף O / N. ביום הבא, בעדינות להוסיף 3 טיפות נוספות של מדיום KSR (~ 100 - 200 μl) כדי לשמור על דגימות שיער לחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לדגימות השיער מדי יום כדי לוודא שזקיקי השיער צירפו בהצלחה. בדרך כלל חיבור של זקיקי שיער הוא לכאורה בתוך 1-3 ימים. שערות עבות הן בדרך כלל קלים יותר לצרף לעומת שערות, כמו שערות עדינות יש לי גבוהה יותרנטייה לצוף אשר מעכבת את תהליך העיקול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהשיער שצורף לצלחת המצופה, להוסיף 500 μl של מדיום KSR לטוב. קח טיפול נוסף בעת הוספה בינוני כדגימות שיער אולי לא מחוברת היטב. מנקודה זו, לשנות תקשורת כל 2 ימים. הערה: בצמחים keratinocyte צריכים להיות גלויים מאזור ORS של בר השיער לאחר 3-7 ימים (איור 2 א-ב). לאפשר קרטינוציטים לגדול עד 14 ימים לפני passaging התאים כפי שתואר בסעיף הבא. </li></ol></li></ol> 2. תחזוקה וPassaging של קרטינוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מעיל 6-גם צלחת באמצעות ערכת הציפוי מטריקס. להוסיף 680 μl של מדיום הדילול מהערכה היטב כל אחד, ואחריו 6.8 μl של ציפוי מטריקס פתרון. לנער את הצלחת על מנת להבטיח פיזור אחיד של פתרון מטריקס הציפוי על הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את הצלחת המצופה לדגירה במשך 30 דקות ב RT. הסרפתרון הציפוי מטריקס לפני הציפוי של קרטינוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק קרטינוציטים להשעית תא בודד עם 500 μl של טריפסין 0.25% בכל טוב במשך 2-5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. להשבית טריפסין עם 500 μl של סרום בינוני המכיל (למשל, שור עוברי סרום בינוני (FBS)) ולאסוף לתוך צינור 15 מיליליטר סטרילי. הסר את בר השיער באמצעות מלקחיים מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר התאים שנקטפו באמצעות haemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים 3 דקות ב 200 x גרם. לשטוף את התאים עם PBS וצנטריפוגה החוזרת. לשאוב PBS וresuspend התא גלולה במדיום keratinocyte טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 4 × 10 4 קרטינוציטים לטובים אחד של צלחת ECM מצופה בנוכחות בינונית keratinocyte. שמור את קרטינוציטים בחממה 37 ° C עם 5% CO 2 (איור 2 ג). שינוי תקשורת בכל יום ותאי מעבר כאשר התרבות היא ~ 80% ומחוברות, WHIפרק יכול לקחת כ 2-7 ימים בהתאם לשיעור מספר המעבר והתפשטות של קרטינוציטים. יש להרחיב קרטינוציטים נגזרים ליצור מניות קפוא מספיק בשיטות הקפאת הקפאה איטיות סטנדרטית 16. הערה: תנאי התרבות המתוארים לתמוך בהתרחבות של אוכלוסייה הומוגנית של קרטינוציטים עם מורפולוגיה מרוצפת טיפוסית (איור 2 ג). מדי פעם, כמה קרטינוציטים מובחנים, עם מורפולוגיה גדולה ושטוחה ואיבדתי את פוטנציאל replicative, אפשר לראות בתרבות. אפיון של קרטינוציטים יכול להתבצע על ידי immunostaining נוגדנים נגד שימוש cytokeratin 14 כפי שתואר קודם לכן 17. שורות תאי keratinocyte הוקמו גם צריכה להיבדק לmycoplasma אחרי 1-3 מעברים באמצעות ערכה זמינה מסחרי. </li></ol> 3. דור של hiPSCs מקרטינוציטים שימוש Episomal וקטורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מעיל 6-גם צלחת עםג&#39;לטין 0.1% (2 מיליליטר / טוב). לאפשר ג&#39;לטין למעייל לפחות 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניסוי תכנות מחדש, קרטינוציטים שימוש לא יאוחרו מהחלוף 6. לנתק קרטינוציטים להשעית תא בודד עם 1 מיליליטר של 0.25% לטריפסין היטב במשך 2-5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. להשבית טריפסין עם 1 מיליליטר של סרום המכיל תקשורת (למשל, תקשורת FBS) ולאסוף בצינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 200 תאי XG וגלולים במדיום keratinocyte. צלחת 1 × 10 × 10 5 -1.5 5 קרטינוציטים בכל טוב בצלחת O gelatinized / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הבא (יום 0), לבדוק את הצלחת כדי להבטיח תאים ומחוברות 50-60%. הערה: אם קרטינוציטים הם פחות מ ~ 50% ומחוברות הם עלולים לא לגדול גם לאחר transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 0, לבצע transfection של וקטורי תכנות מחדש episomal על קרטינוציטים, באמצעות יחס של מגיב transfection 8 μl 2 מיקרוגרם הכולל פלסמיד דנ&quot;א.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 0.5 מיקרוגרם לכל אחד 4 פלסמידים (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-גבעת הרמה) ולדלל בסרום של מדיום מופחת (למשל, OPTI-MEM) 100 μl. הערה: פלסמיד pCXLE-eGFP משמש כדי לפקח יעיל transfection בקרטינוציטים ואינו נדרש לתכנות מחדש מוצלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 μl של מגיב transfection ל- DNA בדילול מלא. מערבבים על ידי מצליף את הצינורית. לאפשר את תערובת תגובת DNA לנוח ללא הפרעה על RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מדיום keratinocyte עם מדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף את תערובת תגובת DNA לתרבות keratinocyte דגירה בחממה 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 4 שעות. הערה: לא מומלץ לבצע O transfection הממושך / N בקרטינוציטים כפי שהם מפגינים הישרדות נמוכה לאחר transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לאחר transfection 4 שעות, להחליף בינוני keratinocyte עם מדיום חדש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1 (יום 1 פוסט-טראנסfection), לשנות את מדיום keratinocyte ולבדוק יעילות transfection על ידי אומדן אחוז התאים חיוביים eGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדרך כלל&gt; 60-70% יעילות transfection הוא ציין לקרטינוציטים ראשוניים תוך שימוש בפרוטוקול זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, חוזר transfection כמתואר בשלב 3.5. שני transfections רצוף בדרך כלל היה להשיג&gt; 90% יעילות transfection. תרבות keratinocyte בדרך כלל מגיעה למפגש בסוף transfection השני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת 10 סנטימטרים של מזין עכבר פיברובלסטים עובריים (MEF) עבור כל תגובת תכנות מחדש. הכן ניזונים MEF mitotically מומתים כפי שתואר קודם לכן 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מעיל צלחת 10 סנטימטרים עם 5 מיליליטר של ג&#39;לטין 0.1% לפחות 20 דקות. הצלחת 4 × 10 6 MEF mitotically מומת לכל צלחת 10 ס&quot;מ בינוניים FBS. אפשר התאים להתיישב ולצרף O / N בחממה 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, הריבשילו קרטינוציטים עם טריפסין 0.25% כפי שמתואר בשלב 3.2 ו -3.3. Resuspend קרטינוציטים במדיום KSR וצלחת 90% מקרטינוציטים מהיטב 1 של 6-גם צלחת לתוך צלחת מזין MEF 10 סנטימטרים עם מדיום KSR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיום 4 ואילך, לשנות את מדיום KSR כל יום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין לאחר 18 יום, להחליף בינוני תרבות בכל יום שני. הערה: קרטינוציטים-לתכנות מחדש ללא יחדלו להתרבות, ואילו מושבות hiPSC עם גבול מוגדר דומים לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) תצא מהיום 14-21. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד מושבות hiPSC ידי נתיחה ידנית מיום 21 ואילך. הימנע מושבות hiPSC שהתקבצו יחד באופן הדוק ורק להרים מושבות hiPSC שברורות מופרדות מאחרים. ניתן לאסוף מושבות hiPSC קודם לכן, אבל המושבה עם גבולות מוגדרים לא יכולה להיות ברורה בנקודות זמן קודמות בהתחשב בגודל המושבה הקטן: הערה. יעילות תכנות מחדש עשויה להשתנות בין ההבדלשל מטופל erent קרטינוציטים, והוא גם מושפעים מגורמים אחרים כגון מספר מעבר או שיעור התפשטות של קרטינוציטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתיחה במדריך של מושבות hiPSC, להשתמש במחט 26G לחתוך מושבות hiPSC תחת מיקרוסקופ לנתח. חותך מושבה hiPSC לחתיכות קטנות סביב 300-600 מיקרומטר באורך. העבר את החתיכות מאחד המושבה hiPSC לתוך צלחת חדשה MEF מזין (2.5 × 10 MEF 4/2 סנטימטר) להקים קו משובט של hiPSCs. בתחילה, תרבות כל שורה משובט hiPSC ובאחד 12 מנות צלחת או תרבות איבר היטב, לאחר מכן להרחיב עד 6 פורמט צלחת היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על קווים הוקמו משובטים של hiPSCs במדיום KSR על מתקני האכלת MEF. ברגע שהתרבות להגיע 70 - 80% confluency עם מושבות hiPSC ~ 1.5 מ&quot;מ קוטר, hiPSCs מעבר תוך שימוש בשיטות סטנדרטיים האנזימטית passaging (Accutase, Dispase או Collagenase IV) על פי הוראות היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין קו hiPSC הוקםים כדי לאשר pluripotency ויכולתם להתמיין לתאי נציג של שלוש השכבות נבט במבחנה ו / או בvivo 13,19. כמו כן, קווי hiPSC באופן שגרתי בדיקה שהוקמו לmycoplasma באמצעות ערכות זמינות מסחרי כדי לוודא שהם ללא הפתוגן. באופן שיגרתי לפקח יציבות גנומית של קווי hiPSC ידי karyotyping או ניתוח הווריאציה עותק מספר מבוסס מערך (CNV). </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, U141-U141 (2008).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31, 458-466 (2013).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from urine.</a> J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Peters, A., Zambidis, E. Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Lineage-Specific+Differentiation+Protocols.Springer+Protocols+Handbooks%22">Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks</a>. Ye, K., Jin, S. , Springer. 203-227 (2012).</li>
<li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratching+the+surface+of+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445, 834-842 (2007).</li>
<li>Limat, A., Noser, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+cultivation+of+single+keratinocytes+from+the+outer+root+sheath+of+human+scalp+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles.</a> J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).</li>
<li>Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+keratinocytes+by+simple+transfection+of+episomal+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors.</a> Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).</li>
<li>Higgins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+hair+follicle+dermal+papilla+cells+into+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells.</a> J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).</li>
<li>Muchkaeva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+iPS+Cells+from+Human+Hair+Follice+Dermal+Papilla+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+naturae%22%5BJournal%5D)">Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells.</a> Acta naturae. 6, 45-53 (2014).</li>
<li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen%22%5BJournal%5D)">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen. , (2013).</li>
<li>Sporl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+membrane+cholesterol+reveals+new+insights+into+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).</li>
<li>Conner, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. N., et al. 23, Unit 23 22(2001).</li>
<li>Pebay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+of+sphingosine-1-phosphate+and+platelet-derived+growth+factor+in+the+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).</li>
<li>Myung, P., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+bulge+in+hair+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Dissecting the bulge in hair regeneration.</a> J Clin Invest. 122, 448-454 (2012).</li>
<li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hair+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The hair cycle.</a> J Cell Sci. 119, 391-393 (2006).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+coordination+of+large-scale+human+induced+pluripotent+stem+cell+initiatives%3A+Wellcome+Trust+and+ISSCR+workshops+white+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper.</a> Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).</li>
<li>McKernan, R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+point+of+large-scale+collections+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).</li>
<li>Utikal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+eliminates+a+roadblock+during+cellular+reprogramming+into+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells.</a> Nature. 460, U1145-U1112 (2009).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+rate+of+somatic+cells+affects+reprogramming+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency.</a> J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+passage+human+fibroblasts+induced+to+pluripotency+are+capable+of+directed+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation.</a> Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).</li>
<li>Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+genetic+variation+in+somatic+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Extensive genetic variation in somatic human tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).</li>
<li>Abyzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+copy+number+mosaicism+in+human+skin+revealed+by+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 492, 438-442 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין ניגוד אינטרסים.

דור של hiPSCs מטופל ספציפי מציע גישה ייחודית ללימוד פתוגנזה בסוגים החולים תאים במבחנה, וגם מספק פלטפורמה להקרנת סמים לזהות מולקולות רומן שיכול להציל את פנוטיפים המחלה. גישת דוגמנות זה מחלה באמצעות hiPSCs הניבה תוצאות מבטיחות עבור מגוון רחב של מחלות, כולל תסמונת Long QT, מחלת הנטינגטון, מחלת פרקינסון וטרשת לרוחב amyotrophic 22. מספר יוזמות כבר יצאו לדרך להקמתן של ספריות בקנה מידה גדולה של hiPSCs מטופל ספציפי, כוללים קונסורציומים בארה&quot;ב, אירופה, אוסטרליה, סי...

הגילוי של תאי גזע אנושיים pluripotent מושרה (hiPSCs) חולל מהפכה בתחום של רפואת רגנרטיבית, מתן שיטה ריאלי עבור דור של תאי גזע מטופל ספציפי 1-3. hiPSCs כבר נוצר בהצלחה מסוגים שונים סומטי תא, כולל fibroblasts 4,5, תאי hematopoietic 6,7, תאי האפיתל כליות מהשתן 8 וקרטינוציטים 9,10. עד כה, fibroblasts עור ותאי hematopoietic מייצגים מקורות תא הנפוצים ביותר ליצירת iPSCs מטופל ספציפי. ניתן לטעון, וזאת בשל העובדה כי ביופסיות עור ואיסוף דם הם הליכים רפואיים שיגרתי וbiobanks הגדול של דגימות דם או עור מטופל הוקמו במדינות רבות. בניגוד לתאי דם ופיברובלסטים עור הדורשים שיטות מיצוי פולשנית, קרטינוציטים מייצגים סוג תא נגיש לדור hiPSC. Keratinocytes הם תאי אפיתל קרטין עשיר היוצרים את מחסום האפידרמיס החיצוני של העור ונמצאים גם בציפורניים ושיער 11. בפרט, ניתן למצוא קרטינוציטים על המעטפת החיצונית השורש (ORS) של זקיקי שיער, שכבה חיצונית סלולרית שכיסתה את השערה יחד עם נדן השורש הפנימי (IRS) תאים (12, איור 1). כאוסף שיער הוא הליך פשוט שאינו דורש הסיוע של צוות רפואי, הוא מספק הזדמנות לחולים כדי לאסוף ולשלוח דגימות השיער שלהם למעבדות, אשר תאפשר איסוף דגימות מטופל לדור hiPSC מאוד. קרטינוציטים אפידרמיס יש גם יעילות גבוהה יותר תכנות מחדש וקינטיקה תכנות מחדש מהר יותר בהשוואה לfibroblasts, מוסיף ליתרונות של שימוש בקרטינוציטים כתאים מתחילים לדור hiPSC 9,13. יתר על כן, hiPSCs יכול גם להיות שנוצר באמצעות אוכלוסיות תאים אחרות בתוך זקיק השיער,כולל תאי עורי papilla ממוקמים בבסיס 14,15 זקיק שיער. דיווחים קודמים של דור iPSC באמצעות תאים שמקורם בשיער לעתים קרובות להשתמש בשיטות תכנות מחדש retroviral או מבוסס lentiviral 9,14,15. עם זאת, שיטות נגיפיות אלה להציג את שילוב רצוי הגנומי של transgenes הזר בתכנות מחדש. לשם השוואה, השימוש בוקטורי episomal מייצג שיטה אפשרית, שאינה נגיפית תכנות מחדש כדי ליצור iPSCs ללא אינטגרציה 4. פיתחנו בעבר שיטה לתכנת מחדש keratinocyte לhiPSCs באמצעות וקטורי episomal 13 ביעילות פשוטה, חסכונית ושאינו נגיפית. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לדור של hiPSCs נגזר keratinocyte, כוללים הגזירה של קרטינוציטים מקטפו שיער, הרחבה ותחזוקה של קרטינוציטים ותכנות מחדש לאחר ליצור hiPSCs.

<table><tbody><tr><td>תערובת אנטיביוטיקה:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ננוגרם/מ"ל אמפוטריצין אנטי-פטרייתי B</td><td>Sigma</td><td>A2942-20 מ"ל</td><td>תערובת אנטיביוטיקה מורכבת ב-PBS.</td></tr><tr><td>1X פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>החלפת סרום נוקאאוט (KSR) בינוני:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>מדיום KSR מסונן באמצעות Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) לפני השימוש. bFGF מתווסף טרי למדיה לפני השימוש.</td></tr><tr><td>20% החלפת סרום נוקאאוט (KSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 עם גלוטמקס</td><td>Invitrogen</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>1& פעמים; MEM חומצת אמינו לא חיונית</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 0.5 פעמים; פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 0.1 מ"מ &בטא;-מרקפטואתנול</td><td>Invitrogen</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; bFGF (10 ננוגרם/מ"ל, תוספת טרי)</td><td>Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>קרטינוציטים בינוניים:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; EpiLife עם 60&nbsp; ומיקרו; M סידן</td><td>אינוויטרוגן</td><td>M-EPI-500-CA</td><td></td></tr><tr><td>1& פעמים; תוסף גידול קרטינוציטים אנושיים (HKGS)</td><td>Invitrogen</td><td>S-001-5</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS) בינוני:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>מדיום FBS מסונן באמצעות Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) לפני השימוש.</td></tr><tr><td>10% סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>0.5x פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"מ L-גלוטמין</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>0.25% טריפסין-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>מטריצה חוץ-תאית (ECM):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354234</td><td>מלאי Aliquot Matrigel ואחסן ב-80&deg; C בעקבות היצרן s הוראות. ריכוז המלאי של מטריג'ל משתנה מעט מאצווה לאצווה (~9 מ"ג/מ"ל). אנו ממליצים להשתמש ב-200&micro; l מטריג'ל לציפוי צלחת 12 בארות (~150&micro; g/well).&nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת מטריצת ציפוי&nbsp;</td>פלסמידים <td>Invitrogen</td><td>R-011-K</td><td></td></tr><tr><td>:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>שימו לב ש-pCXLE-eGFP משמש רק לניטור יעילות טרנספקציה ואינו נדרש לתכנות מחדש.</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-eGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hOct3/4-shP53F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>מגיב טרנספקציה Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E231B</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין (מעור חזיר)</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>מהווה 0.1% ג'לטין במים מזוקקים. חיטוי לפני השימוש.&nbsp;</td></tr><tr><td>מדיום סרום מופחת: OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ml</td><td></td></tr><tr><td>מזין</td><td></td><td></td> פיברובלסטים עובריים של <td>עכבר (MEF) MEF ניתן להשבית על ידי טיפול או הקרנה של מיטומיצין C כמתואר קודם לכן 16.</td></tr><tr><td>מחט 26 גרם</td><td>Terumo</td><td>NN2613R</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות (טופלה בתרבית רקמות)</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 12 בארות (טופלה בתרבית רקמה)</td><td>BD Biosciences</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 10 ס"מ (טופלה בתרבית רקמה)</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>שימוש ב-10 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>קולגנאז IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>לשימוש ב-1 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>נוגדן TRA-160</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td>לשימוש ב-5 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>נוגדן OCT4</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-5279</td><td>לשימוש ב-5 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>נוגדן NANOG</td><td>R& D Systems</td><td>AF1997</td><td>שימוש ב-10 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>ערכת זיהוי MycoAlert</td><td>Lonza</td><td>LT07-418</td><td></td></tr></tbody></table>

דור של תאי גזע האינטגרציה נטול האדם המושרה pluripotent שימוש קרטינוציטים נגזר שיער

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

ההתקדמות האחרונה בתכנות מחדש מאפשרת לנו להפוך תאים סומטיים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSCs). מידול מחלה באמצעות hiPSCs ספציפיים לחולה מאפשר לחקור את המנגנון הבסיסי לפתוגנזה, ומספק גם פלטפורמה לפיתוח בדיקת תרופות חוץ גופית וריפוי גנטי לשיפור אפשרויות הטיפול. הפוטנציאל המבטיח של hiPSCs לרפואה רגנרטיבית ניכר גם במספר ההולך וגדל של פרסומים (>7000) על iPSCs בשנים האחרונות. סוגי תאים שונים משושלות שונות שימשו בהצלחה ליצירת hiPSC, כולל פיברובלסטים של העור, תאים המטופויאטיים וקרטינוציטים אפידרמיסיים. בעוד שביופסיות עור ואיסוף דם מבוצעות באופן שגרתי במעבדות רבות כמקור לתאים סומטיים ליצירת hiPSCs, האיסוף והגזירה של קרטינוציטים בשיער נמצאים בשימוש פחות נפוץ. קרטינוציטים שמקורם בשיער מייצגים גישה לא פולשנית להשגת דגימות תאים ממטופלים. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ולא פולשנית להפקת קרטינוציטים משיער מרוט. אנו מספקים גם הוראות לתחזוקה של קרטינוציטים ותכנות מחדש לאחר מכן ליצירת hiPSC ללא אינטגרציה באמצעות וקטורים אפיזומליים.

השיער עובר 3 שלבים שונים של מחזור צמיחה: anagen (שלב הצמיחה), Catagen (שלב רגרסיה) וטלוגן (שלב המנוחה) 20,21. זקיק שיער anagen מכיל מספר שכבות של אפיתל; שכבות אלה כוללות ORS, מס הכנסה ושערה (איור 1). שיער Anagen סופו של דבר עובר במעבר לשלב Catagen, שמסומן על ידי אפופטוזיס של ORS וסיום בידול שערה. לבסוף, מעבר שיער Catagen לשלב telogen, שבו הופסקה אפופטוזיס וזקיק telogen הופכים שקטים עם telogen אופיינית הבליטה 20,21. <p class="jove_content"...

כתב יד זה מספק נוהל שלב אחר שלב לגזירה ותחזוקה של קרטינוציטים אנושיים משיער מרוט ויצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ללא אינטגרציה (hiPSCs) על ידי וקטורים אפיזומליים.

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להפיק תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים באמצעות קרטינוציטים המופקים משיער. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד שערות מתורם. השלב השני הוא זריעת השערות בצלחות כדי להקל על צמיחת הקרטינוציטים.בשלב הבא, הקרטינוציטים מתוחזקים ומופנים (expanded) במעבדה (in vitro). השלב הסופי הוא תכנות מחדש של הקרטינוציטים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים (human-induced pluripotent stem cells) באמצעות שיטת תכנות מחדש אפיזומלית. לבסוף, ניתן לבודד תאי IPS אנושיים ולאפיין אותם באמצעות אימונוהיסטוכימיה כדי להדגים את הביטוי של סמנים פלוריפוטנטיים.היתרון הכולל של שיטה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטת הרטרו-וירוס או הלנטי-וירוס, הוא שעל ידי שימוש בגורם אפיזומלי, אנו נמנעים מהחדרת טרנסגן לא רצויה לתוך הגנום בתאי הגזע שנוצרו. התחל על ידי הפשרה של מבחנה עם תמיסת מטריקס חוץ-תאי על קרח למשך לילה. למחרת בבוקר, השתמש בקצות פטות מקוררות מראש כדי להוסיף 200 µL מהתמיסה ל-12 mL של מצע DMF 12 מקורר.הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת המטריקס החוץ-תאי המדוללת לכל באער של פלטת 12 באערים, והדגירו את הפלטה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C כדי לצפות את הבאערים במטריקס. לאחר מכן, אספו שיער אנושי ראשוני מראשו של התורם על ידי הנחת האצבעות קרוב לשורש השערה ותלישתה בתנועה אחת מהירה וחלקה.בדקו כדי לאשר שכל שערה שנאספה מכילה זקיק שערה שלם. הניחו את הזקיק תחת מיקרוסקופ סטריאוסclementine וקבעו את שלב הצמיחה של כל שערה. אספו חמש עד 10 שערות אנטיגן מכל פרט כדי להפיק קרטין.שלב האנטיגן, בניגוד לשלב ה-T, מכיל שכבות מרובות של אפיתל. מקמי את דגימות השיער לצלח פטרי המכיל 10 milliliters של תערובת אנטיביוטית למשך חמש דקות, ולאחר מכן שטפי אותן ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, אחזי את השיער באמצעות פינצטה סטרילית והשתמשי במספריים סטריליים כדי לגזור את עודפי גבעול השערה, כך שיישאר פרגמנט שיער עם זקיק שערה שלם וכ-0.5 עד סנטימטר אחד של גבעול השערה.העבירו בזהירות מקטע שערה אחת לכל באער של פלטה מצופה במטריצה חוץ-תאית. באמצעות פינצטה סטרילית, טפטפו בערך 100 עד 200 µL של מצע החלפת סרום לכל באער המכיל דגימות שערה.לאחר מכן, הניחו את הפלטה באינקובטור ואפשרו לזקיקי השיער להיקשר במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. למחרת, הוסיפו בעדינות 100 עד 200 µL נוספים של מצע תחליף סרום (serum replacement medium) בטיפות כדי לשמור על דגימות השיער לחות. בדקו את דגימות השיער מדי יום כדי לוודא שזקיקי השיער נקשרו בהצלחה לפלטה.לאחר ההצמדה, הוסף בעדינות 500 µL נוספים של מצע לבאר. החלף את המצע מדי יומיים. צפה פלטה בעלת שש בארות בקולגן.סוג אחד משתמש בטיפול מקדים כגון ערכה למטריצת ציפוי, על ידי הוספת 680 microliters של תוכה המדלל מהערכה לכל באער, ולאחר מכן 6.8 microliters של תמיסת מטריצת הציפוי. נערו את הפלטה בעדינות כדי להבטיח ציפוי אחיד. הניחו לפלטה המצופה להדגר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני זריעת קרטינוציטים.הסיר את תמיסת הציפוי, נתק את הקרטנוציטים בתרבית למש suspension של תאים בודדים על ידי הוספה של 500 µL של 0.25% trypsin לכל באר, והדגר את הפלטות למשך שתיים עד חמש דקות ב-37 °C. לאחר שהתאים השתחררו מהפלטה, נטרל את ה-trypsin באמצעות 500 µL של מצע הכיל סרום ואסוף את התאים לשפופרת סטרילית של 15 mL. הסר את שערת השיער באמצעות פינצטה סטרילית, השקע את התאים ולאחר מכן השהה.שעלה אותם במדיום גידול רענן לקרטינוציטים, וזריעה של 40,000 קרטינוציטים לתוך באר אחת של פלטה מצופה קולגן בנוכחות מדיום לקרטינוציטים. החליפו את המדיום מדי יום ובצעו מעבר תרבויות כאשר התרבית מגיעה לכ-80% התמלאות (confluence). כסו פלטה של שש בארות בג'לטין על ידי הוספת 2 mL של תמיסת ג'לטין בריכוז 0.1% לכל באר, והמתינו לפחות 20 דקות בטמפרטורת החדר לספיגת הג'לטין. בינתיים, הפרידו קרטינוציטים שנמצאים במעבר שישי או נמוך יותר לתליה של תאים בודדים על ידי הוספת 1 mL של 0.25% tryin לכל באר ודגירה של התאים למשך שתי עד חמש דקות.בטמפרטורה של 37 °C, בטלו את פעילות ה-trypsin באמצעות מיליליטר אחד של מצע המכיל סרום ואספו את התאים לשפפור של 15 מיליליטר. השקיעו את התאים וסספנדו אותם מחדש במצע לקרטינוציטים. לאחר מכן, זרעו 100,000 עד 150,000 קרטינוציטים לכל באר בלוח של שש בארות שעובד בג'לטין והדגרימו אותם במהלך הלילה. ביום למחרת, יום אפס, בדקו את הלוח כדי לוודא שהתאים הגיעו ל-50% עד 60% התלכדות (confluence).בצע טרנספקציה של וקטורי תכנות מחדש אפיסומליים לתאי קרטינוציטים, תוך שימוש ביחס של 8 µL של ריאגנט טרנספקציה ל-2 µg של DNA פלסמי סה"כ, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. למחרת, ביום הראשון, החלף את מצע הגדילה של הקרטינוציטים ובדוק את יעילות הטרנספקציה על ידי הערכת אחוז התאים החיוביים לחלבון פלואורסצנטי ירוק תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ביום השני צפויה יעילות טרנספקציה של 60% עד 70%.חזור על התהליך של הטרנספקציה כדי להעלות את יעילות הטרנספקציה למעל 90%. לאחר מכן, בצע ציפוי מוקדם (pre-coat) של צלחת בקוטר 10 ס"מ עם חמישה מיליליטר של 0.1% gelatin למשך 20 דקות לפחות. זרע 4 מיליון תאי מאכיל (feeder cells) שעברו אינאקטיבציה מיטוטית לכל צלחת 10 ס"מ במצע FBS כפי שמתואר ב-Conrad Al et al, ואפשר לתאים לשקוע ולהיקשר למצע למשך הלילה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide ביום השלישי. אסוף את הקרטינוציטים שעברו טרנספקציה כפי שהודגם קודם לכן, ותלה אותם מחדש במצע KSR בצלחת.העבר 90% מהקרטינוציטים מאחת הבארות לצלחת של 10 סנטימטר שהוכנה עם תאי מאכלה (feeder cells) וכסה אותם ב-KSR. Medium בצע בידוד של מושבות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים באמצעות דיסקציה ידנית החל מהיום ה-21 ואילך. הימנע ממושבות הצמודות זו לזו ובחר רק מושבות המופרדות בבירור מאחרות.עבור דיסקציה ידנית, השתמשו במחט מדד 26 כדי לחתוך את המושבות לחתיכות קטנות באורך של כ-300 עד 600 מיקרומטרים תחת מיקרוסקופ דיסקציה. העבירו את החתיכות ממושבה אחת לצלחת הזנה של MEF חדשה כדי להקים קו קלונאלי של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים. ברגע שהתרבית מגיעה ל-70 עד 80% התמלאות (confluency) עם מושבות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים בעלות קוטר של כ-1.5 מילימטרים, בצעו מעבר (passage) לתאים באמצעות שיטות פירוק אנזימתי סטנדרטיות כגון Accutane, sase או collagenase.ארבעה, בהתאם להוראות היצרן. בעת ביצוע פרוטוקול זה, ניתן להבחין בצמיחות חוזרות של תאים כבר שלושה ימים לאחר הצמדת השערה, והם ימשיכו להתרבות. הקרטינוציטים המוצגים כאן הועברו לצלחת חדשה, וניתן להחזיק תאים אלו למספר מעברים.תמונה זו מציגה מושבה טיפוסית של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים שהופקו מקרטינוציטים. לאחר 32 ימים של תכנות מחדש, עשויה להתרחש дифרנציאציה מסוימת במרכז מושבת התאיים הגזעים הפלוריפוטנטיים המושריים האנושיים. לאחר בידוד ידני, התאים שהופקו מציגים בדרך כלל יחס גבוה של גרעין לציטופלזמה וגבול מושבה מוגדר.הם מבטאים גם מספר סממנים של רב-פוטנציאליות (pluripotent markers) כגון OCT4 ו-TRA-1-60. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק קרטינוציטים משיער ולתכנתם מחדש לתאי גזע אנושיים מושריים (human induced pluripotent stem cells).

generation-integration-free-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מדגימים את פרוטוקול עבור הדור של המושרה בתאי גזע pluripotent מן האדם תאים סומטיים באמצעות lentivirus בתיווך המסירה של גורמים אנושיים Oct4, Sox2, Nanog, ו Lin28. Pluripotency אושרה על ידי המורפולוגיה ואת הנוכחות של גזע עובריים (ES) סמנים ספציפיים התא.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts האדם עם Lentivirus Stemgent TF האדם הגדר

פרוטוקול הבאה מספקת הדרכה והתאמת האדם הנגרמת גזע pluripotent (שב"ס) תאים עד תרבות מזין בחינם באמצעות נוקאאוט להשלים סרום מזין החלפה ללא בינוני (KSR-FF). מותאם פעם, הוראות תחזוקה מתמדת ניתנים גם.

מזין ללא עיבוד, התרבות Passaging של תאים שב&quot;ס האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני

פרוטוקול זה מתאר את נוהל מפורט עבור cryopreserving אדם בתאי iPS במדיום בנוקאאוט SR cryopreservation ושחזור אלה תאים להשלים בנוקאאוט SR מזין חינם (KSR-FF) בינוני או מבוססי מזין בנוקאאוט בינוני SR.

Cryopreserving ו שחזור של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם מזין ללא החלפת סרום בינוני

מאמר זה מציג פרוטוקול חזק לבידוד ולתרבות של תאי גזע רכס עצביים מן זקיקי שיער אדם.

בידוד ותרבות של תאי גזע עצביים קרסט מזקיקי שיער אנושיים

תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs) מהווים מקור של רקמות מטופל ספציפי ליישומים קליניים ומחקר בסיסי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתכנת מחדש תאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMNCs) המתקבלים ממעיילי אפים קפואים לiPSCs הנגיפי ללא שימוש בפלסמידים episomal הלא שילוב.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת לייצור יעיל של iPSCs ללא אינטגרציה מתאי דם היקפיים אנושיים בוגרים. עם שימוש בארבעה וקטורים אפיזומליים מבוססי oriP/EBNA כדי לבטא את גורמי התכנות מחדש, KLF4, MYC, BCL-XL, או OCT4 ו-SOX2, ניתן להשיג אלפי מושבות iPSC מ-1 מ"ל של דם היקפי.

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

גזירה חזקים של האדם המושרה האדם pluripotent גזע (hiPS) תאים הושג באמצעות שילוב של וירוס Sendai וירוס (Sev) וקטור בתיווך תיכנות של fibroblasts עורי. HiPS התא תחזוקה התרחבות המשוב בוצע באמצעות xeno חופשי ו מוגדר תנאי תרבות כימית עם laminin רקומביננטי אנושי 521 (LN-521) מטריקס Essential E8 (E8) בינוני.

אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס

אנו מציעים פרוטוקול זה מראה כיצד להבדיל keratinocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה ו fibroblasts וליצור תא צורב של העור תלת-ממד באמצעות אלה keratinocytes ו fibroblasts. פרוטוקול זה מכיל צעד נוסף של יצירת מודל humanized עכברים. הטכניקה המובאת כאן תשפר את המחקר דרמטולוגית.

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

אנו מציגים כאן עבור הבידול בתאי גזע pluripotent המושרה אנושי לתוך כל נגזרת somite (myotome, sclerotome, פלסטיים ו syndetome) פרוטוקול בתנאים מוגדרים כימי, אשר יש יישומים בדוגמנות מחלות בעתיד, טיפולים מבוססי תא לכירורגיה אורטופדית.

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

מתכנות התא מחייב הקדמה של גנים מרכזיים, אשר לווסת ולתחזק את מצב התאים pluriפוטנטי. הפרוטוקול המתואר מאפשר היווצרות של תאי גזע מושרה pluripotent iPSCs) מושבות של האדם המעטפת הגוף ללא ויראלי/שילוב שיטות אך באמצעות RNAs שאינו משתנה (ננומטר-RNAs) בשילוב עם גורמי התחמקות החיסון הפחתת מנגנוני ההגנה הסלולריים.

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור אורגנואידים בעור המכילים זקיקי שיער מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם באמצעות מערכת תרבית ממשק אוויר-נוזל מישורית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית כדי לשכפל את הארכיטקטורה והתפקוד של העור.

יצירת אורגנואידים מעור מישוריים נושאי שיער שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות מערכת תרבית ממשק אוויר-נוזל

חקור שיטה ליצירת תאי גזע pluripotent מושרים מקרטינוציטים נגזרי שיער באמצעות וקטורים אפיזומליים ללא אינטגרציה גנומית. שיטה זו מאפשרת ייצור תאים לרפואה רגנרטיבית ומחקר מחלות בבטיחות גבוהה.

דור של תאי גזע האינטגרציה נטול האדם המושרה pluripotent שימוש קרטינוציטים נגזר שיער

גלה סרטונים נוספים