משלוח של חלבונים, פפטידים או מולקולות קטנות Cell-חדיר לתאים חיים על ידי דגירה עם Endosomolytic מגיב dfTAT

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להחדיר מקרו-מולקולות לתאים חיים באמצעות dimer, fluorescent tat או df tat, ריאגנט המסוגל לחדור לתאים ביעילות רבה מבלי לפגוע בהם. הדבר מושג תחילה על ידי ייצור וטיהור של סוכן ההחדרה. Dfta כשלב שני.

מדגרירים את Dfta עם תאים למשך שעה אחת ב-37 degrees Celsius בנוכחות המטען המקרומולקולרי הרצוי; df tat משרה את ספיגת המטען לתוך וסיקולות אנדוציטוטיות. הוסיקולות מבשילות לאנדוזומים מוקדמים, ומגיעות לבסוף לשלב האנדוזום המאוחר שבו df tat מסוגל לשחרר את המטען אל החלל הציטוזולי של התאים. לאחר מכן, התאים נדגמים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להעריך את יעילות ההובלה של detta ואת המטען הרצוי.

התוצאות מראות כי DF TT יכול להיכנס לתאים ביעילות גבוהה וללא ציטוטוקסיות ניכרת; DF tat יכול להוביל מקרו-מולקולות בגדלים שונים אל המרחב הציטוזולי של התאים, כפי שניתן לראות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני גישות הובלה מוצקות קיימות הוא שלסוכן ההובלה שלנו יש יעילות הובלה גבוהה ללא השפעה שלילית ניכרת על הפיזיולוגיה התאית. בנוסף, השימוש בו קל שכן הוא דורש רק שלב פשוט של דגירה משותפת (co-incubation).

כדי להתחיל בסינתזת ה-FTA, נפחו 500 מיליגרם של שרף R amide, MBHA ודימאתילפורממיד או DMF בכלי SPPS סטנדרטי של 50 מיליליטר למשך שעה אחת; בצעו את התגובה בטמפרטורת החדר תוך שימוש בכמות מספקת של גז חנקן כדי ליצור בועות בתגובה. סנתזו FTA על שרף rink amide MBHA תוך שימוש ב-1.2 מילימול של כל חומצה אמינו מוגנת FM המפורטת בפרוטוקול הטקסט עבור כל תגובת צימוד של חומצה אמינו. הוסיפו גם 0.44 גרם HBTU ו-0.51 מיליליטר של DIEA המומסים ב-DMF; בצעו כל תגובת צימוד של חומצה אמינו למשך ארבע שעות; לאחר הצימוד של ארבע השעות.

שטפו את השרף ב-DMF ובצעו את שלב ההגנה של FD כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסטואלי. חזרו על הפעולה עד לסנתזה של שרשרת הפפטיד הליניארית של FTA. לאחר מכן, הסירו את קבוצת ההגנה MTT על ידי דגירה של השרף עם 20 milliliters של תמיסה המורכבת מ-1% trifluoroacetic acid או TFA ו-2% triisopropylsilane או TIS ב-DCM למשך חמש דקות.

מכיוון שהסרת קבוצת המגן MTT תגרום להופעת צבע צהוב, יש לחזור על הפעולה עד שלא נצפה צבע צהוב, תוך שטיפת השרף ב-DCM וב-DMF בין השלבים. יש להוסיף לשרף תמיסה נוספת של 1% TFA ב-DCM כדי לוודא שלא הוסר MTT ושהתמיסה נשארת שקופה.

בשלב הבא, המיסו T-M-R-H-B-T-U ו-DIEA ב-DMF והוסיפו תערובת זו לשרף. בצעו את התגובה במהלך הלילה תוך שימוש בחנקן יבש כדי לספק ערבוב, לאחר הגנת fm d וצימוד חומצות אמינו. שטפו את השרף ב-DCM והניחו לו להתייבש לצורך ניתוק מלא של הפפטיד מהשרף.

הוסיפו לשרף הפפטידי תמיסה המכילה 92.5%TFA, 2.5%מים, 2.5%TIS ו-2.5%ethane di thiol למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר, כדי להשיג הסרה מקיפה של קבוצות ההגנה וניתוק מהשרף. השקיפו את תוצרי הפפטיד הגולמיים באמצעות אתיל אתר אנहाइडרי קר, על ידי ניקוז התמיסה שהוכנה לתוך 40 milliliters של eyl ether. סובבו את המשקעת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ו-4, 000 G למשך 20 עד 25 דקות.

חזור על שלב זה כדי לאפשר שטיפה של המשקע ב-ethyl ether אנहाइडרי קר. השהה את המשקעים במים ובצע ליופיליזציה, ולאחר מכן השהה מחדש את המוצרים שהתקבלו ב-TFA מימי 0.1% ACEDONITE trial. בצע ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית בעוצמה גבוהה או HPLC באמצעות עמודת C 18 אנליטית.

לניתוח של כל פפטיד, השתמשו בקצב זרימה של 1 mL לדקה ובגילוי ב-214 nm וב-550 nm. לאחר מכן, בצעו HPLC חצי-פרפרטיבי על עמודה מסוג C 18 לצורך טיהור הפפטידים. השתמשו בקצב זרימה של 4 mL לדקה ובגילוי ב-214 nm וב-550 nm עבור כל ההרצות.

השתמש במדרגות ריכוז ליניאריות לפני ביצוע תגובת החמצון. אשר את הזהות הנכונה של הפפטידים באמצעות MALDI בהתאם לפרוטוקול היצרן. המס FTA בתמיסת phosphate buffered saline מאווררת.

ודאו כי ה-pH הוא בין 7.0 ל-7.5. לאחר הוספת הפפטיד, השאירו את התגובה למשך הלילה כדי לאפשר לה להסתיים במלואה. טהרו את המוצר באמצעות HPLC פאזה הפוכה ובצעו אנליזה באמצעות ספקטרומטריית מסות כפי שנעשה קודם לכן; לאחר מכן, בצעו ליופיליזציה ל-DF tat הטהור והמסו אותו מחדש ב-200 µL של מים כדי למדוד את הריכוז.

ראשית, המסו אליקוט של DF tat מטוהר ב-149 microliters של תמיסת TCEP בריכוז 50 millimolar והמתינו כ-20 דקות לתגובה. בשלב זה, DF tat מחוזר למקבילו המונומרי F tat כדי לבטל את כיבוי הבליעה (absorbance quenching) המתרחש עקב הקרבה הגבוהה של TMR floor four ל-DF tat. העבירו את כל התמיסות ל-quartz CVE ומדדו את הבליעה ב-556 nanometers.

באמצעות חוק ביר, קבע את ריכוז התמיסה. ערך זה תואם לריכוז ה-fta.

חלקו את ריכוז ה-FTA בשניים כדי לקבל את ריכוז ה-dfta. גדלו את התאים במצע מתאים עד להגעה ל-80 עד 90% Confluency באטמוספירה לחה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius המכילה 5%CO2, שטפו את התאים שלוש פעמים עם 200 microliters של PBS ופעם אחת עם NRL 15. דגרו את התאים עם חמישה micromolar df tat עם או בלי מטען, כגון enhanced green fluorescent protein, ושמרו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת כדי להשרות דליפה אנדוזומלית לאחר הדגירה.

שטפו את התאים שלוש פעמים עם heparin במצע L 15 כדי להסיר DF tat הקשור לממברנה הפלזמטית של התאים. כשלב סופי, דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה; דמיינו את DF tat באמצעות חלבון פלואורסצנטי אדום או מסנן RFP כדי להעריך את ההבדל בין F TAT ל-D ftt. תאי HeLa מושקים עם כל פפטיד כדי לקבוע את ההבדל בלוקליזציה התאית שלהם.

כפי שמוצג כאן, FTA ממוקם בהתפלגות נקודתית. התפלגות זו עולה בקנה אחד עם הישארות הפפטיד כלוא בתוך אנדוזומים. לעומת זאת, האות הפלואורסצנטי של dfta מציג התפלגות הומוגנית לאורך הציטוזול והגרעין.

ההתפלגות הציטופלזמית של DF tat נצפתה במספר קווי תאים שונים. תמונות בהגדלה של 20x מראות כי אחוז גבוה מאוד של תאים בצלחת מציגים התפלגות ציטופלזמית של DF tat ללא רעילות תאית, כפי שניתן לראות מהיעדר צביעת גרעין ב-cyt blue, זאת כדי לקבוע האם דליפה אנדוזומלית המתווכת על ידי dfta מעבירה חלבונים גדולים אל הציטזול של התאים. EGFP שימש לזיהוי העברה של חלבון מקופל כהלכה.

EGFP הפגין התפלגות פלואורסצנטית ירוקה ציטוזולית וגרעינית, בדומה למה שנצפה עבור DF tat ביותר מ-90% מהתאים ללא רעילות ניכרת. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי התאים לא צריכים להיות בעלי התמזגות (confluence) גבוהה מדי. בנוסף, יש לשטוף את התאים ביסודיות כדי להסיר FPS לפני הוספת df tap.