משלוח של חלבונים, פפטידים או מולקולות קטנות Cell-חדיר לתאים חיים על ידי דגירה עם Endosomolytic מגיב dfTAT

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעביר מקרומולקולות לתאים חיים באמצעות מגיב דימר, פלואורסצנטי או df tat שיכול לחדור לתאים ביעילות רבה מבלי לפגוע בהם. זה מושג על ידי ייצור וטיהור תחילה של חומר המשלוח. Dfta כצעד שני.

Dfta מודגר עם תאים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בנוכחות המטען המקרומולקולי המעניין, df tat גורם לספיגת המטען בתוך שלפוחיות אנדוציטיות. שלפוחיות מבשילות לאנדוזומים מוקדמים, ולבסוף מגיעות לשלב האנדוזום המאוחר שבו DF tat מסוגל לשחרר את המטען לחלל הציטוזולי של התאים. לאחר מכן, התאים מצולמים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי על מנת להעריך את יעילות המסירה של דטה והמטען המעניין.

התוצאות מראות כי DF TT יכול להיכנס לתאים ביעילות גבוהה וללא ציטוטוקסיות נצפית DF tat יכול להעביר מקרומולקולות בגדלים שונים לחלל הציטוזולי של התאים כפי שניתן לראות במיקרוסקופ פלואורסצנטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני גישות אספקה מוצקות קיימות הוא שלחומר האספקה שלנו יש יעילות אספקה גבוהה ללא השפעה שלילית ניכרת על הפיזיולוגיה של התא. בנוסף, הוא קל לשימוש מכיוון שהוא דורש רק שלב דגירה משותף פשוט.

כדי להתחיל, סינתזת FTA מתנפחת 500 מיליגרם של R אמיד, שרף MBHA ודימתילפורממיד או DMF בכלי SPPS סטנדרטי של 50 מיליליטר למשך שעה אחת לבצע את התגובה בטמפרטורת החדר תוך שימוש במספיק גז חנקן כדי לבעבע את התגובה. סנתז FTA על שרף אמיד MBHA באמצעות 1.2 מילימול של כל חומצת אמינו מוגנת FM המפורטת בפרוטוקול הטקסט עבור כל תגובת צימוד חומצות אמינו. הוסף גם נקודה 44 גרם HBTU ונקודה 51 מיליליטר של DIEA מומס ב-DMF בצע כל תגובת צימוד של חומצות אמינו במשך ארבע שעות לאחר הצימוד של ארבע שעות.

שטפו את השרף עם DMF ובצעו את שלב הגנת ה-FD כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חזור על הפעולה עד לסינתזה של שרשרת הפפטידים הליניארית של FTA. לאחר מכן, קלב את קבוצת ההגנה של MTT על ידי דגירה של השרף עם 20 מיליליטר של תמיסה המורכבת מחומצה אצטית 1% tri Fluor או TFA ו-2% tri isopropyl cy או TIS ב-DCM למשך חמש דקות.

מכיוון שהסרת קבוצת ההגנה על MTT תביא להופעת צבע צהוב. חזור על כך עד שלא נצפו צבעים צהובים שטיפת השרף עם DCM ו-DMF ביניהם. הוסף פתרון נוסף עם 1% TFA ב-DCM לשרף כדי להבטיח שלא יוסר MTT והתמיסה תישאר ברורה.

לאחר מכן, המס את T-M-R-H-B-T-U ו-DIEA ב-DMF והוסף את התערובת הזו לשרף. בצע את התגובה בן לילה באמצעות חנקן יבש כדי לספק תסיסה לאחר הגנת fm d וצמידות חומצות אמינו. שטפו את השרף עם DCM והניחו לו להתייבש לחיתוך מלא של הפפטיד מהשרף.

הוסף לשרף הפפטידיל תמיסה המכילה 92.5% TFA, 2.5% מים, 2.5% TIS ו-2.5% אתאן די תיול למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר כדי להשיג הגנה עמוקה גלובלית וחשיפה מהשרף. זרז את תוצרי הפפטיד הגולמי באמצעות אתר אתילי נטול מים קר על ידי ניקוז התמיסה המוכנה ל-40 מיליליטר של אתר איל. סובב את זה בארבע מעלות צלזיוס ו-4,000 גרם למשך 20 עד 25 דקות.

חזור על שלב זה כדי לאפשר שטיפה של המשקעים עם אתיל אתר נטול מים קר. השעו את המשקעים במים וליופיליזציה, ואז השעו מחדש את המוצרים שהתקבלו בניסוי TFA ACEDONITE מימי של 0.1%. בצע כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים או ניתוח HPLC עם עמודת C 18 אנליטית.

כדי לנתח כל פפטיד, השתמש בקצב זרימה של מיליליטר לדקה וזיהוי ב-214 ננומטר ו-550 ננומטר. לאחר מכן, בצע HPLC הכנה למחצה על עמודת C 18 לטיהור פפטידים. השתמש בקצב זרימה של ארבעה מיליליטר לדקה וזיהוי ב-214 ננומטר ו-550 ננומטר עבור כל הריצות.

השתמש בשיפועים ליניאריים לפני ביצוע תגובת החמצון. אשר את הזהות הנכונה של הפפטידים על ידי MALDI בהתאם לפרוטוקול היצרן. ממיסים FTA בתמיסת מלח פוספט מוגזת.

ודא שה-pH הוא בין 7.0 ל-7.5. לאחר הוספת הפפטיד, מוטציה של התגובה למשך הלילה כדי לאפשר לה להגיב עד להשלמתה. טהר את המוצר באמצעות HPLC פאזה הפוכה ונתח על ידי ספקטרומטריית מסה כמו לפני ליופיליזציה של ה-DF הטהור והשהה ב-200 מיקרוליטר מים כדי למדוד את הריכוז.

ראשית, Resus השעו מנה של ה-DF tat המטוהר ב-149 מיקרוליטר של תמיסת TCEP של 50 מילי-מולרית מאפשרים לדגימה להגיב למשך כ-20 דקות. בשלב זה, DF tat מצטמצם למקבילו המונומר F tat כדי לבטל את מרווה הספיגה המתרחשת עקב הקרבה של קומה 4 TMR ו-DF tat. הוסף את כל הפתרונות ל-CVE קוורץ ומדוד את הספיגה ב-556 ננומטר.

שימוש בחוק בירה. קבע את ריכוז התמיסה. זה תואם את ריכוז ה-fta.

חלקו את ריכוז ה-FTA בשניים כדי לקבל את ריכוז ה-dfta. לגדל את התאים במדיום מתאים עד לשטף של 80 עד 90% באטמוספירה לחה של 37 מעלות צלזיוס המכילה 5% CO2, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBS ופעם אחת עם NRL 15. דגרו על התאים עם חמישה מיקרו-מולרים עם או בלי מטען, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר ושמרו על 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לגרום לדליפה אנדוזומלית לאחר הדגירה.

שטפו את התאים שלוש פעמים עם הפרין במדיום L 15 כדי להסיר DF tat הקשור לקרום הפלזמה של התאים. כתמונת שלב אחרונה, התאים המשתמשים במיקרוסקופ פלואורסצנטי מצלמים DF tat באמצעות חלבון פלואורסצנטי אדום או מסנן RFP כדי להעריך את ההבדל בין F TAT ל-D ftt. תאי העקב מודגרים עם כל פפטיד כדי לקבוע את ההבדל בלוקליזציה התאית שלהם.

כפי שמוצג כאן, FTA מתמקם בהתפלגות מנוקדת. התפלגות זו עולה בקנה אחד עם הפפטיד שנשאר כלוא בתוך אנדוזומים. לעומת זאת, האות הפלואורסצנטי של dfta מציג התפלגות הומוגנית בכל הציטוזול והגרעין.

ההתפלגות הציטוזולית של DF tat נצפית במספר קווי תאים שונים. התמונות של 20 x מראות שאחוז גבוה מאוד בצלחת מציג התפלגות ציטוזולית של DF tat ללא רעילות תאית כפי שניתן לראות ללא צביעה גרעינית כחולה כדי לקבוע אם דליפה אנדוזומלית בתיווך dfta מספקת חלבונים גדולים לציטוזול של התאים. EGFP שימש לאיתור אספקה של חלבון מקופל כהלכה.

EGFP הציג התפלגות פלואורסצנטית ציטוזולית וירוקה גרעינית, בדומה למה שנצפה עבור DF tat ביותר מ-90% מהתאים ללא רעילות נצפית בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהתאים לא צריכים להיות מתלכדים יתר על המידה. בנוסף, יש לשטוף היטב את התאים כדי להסיר FPS לפני הוספת ברז df.