הערכה של הפעלת תא Perigenital רגישות וערמונית תורן במודל עכבר של הפרדה אימהית עובריים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע את ההשפעה של לחץ מוקדם בחיים על המערכת האורוגניטלית על ידי מדידת רגישות מכנית סביב איברי המין והפעלת תאי פיטום בתוך הערמונית בעכברים זכרים C 57 שחורים שעברו הפרדה אימהית יילודים. זה מושג על ידי ביצוע הפרדה אימהית ראשונה על המלטות של שישה גורי עכברים שחורים C 57 כדי לגרום ללחץ מוקדם בחיים במשך 20 ימים רצופים. השלב השני הוא מדידת רגישות מכנית פרי איברי המין על ידי יישום סדרה של מונופילמנטים של פון פרה על אזור איברי המין.

לאחר מכן, צביעה כחולה של טולואידין מחומצת מתבצעת על קטעי קריוסטט של ערמונית העכבר. על מנת לכמת את הפעלת תאי הפיטום. התוצאות מראות כי הפרדת אימהות בילודים מגבירה את הרגישות המכנית סביב איברי המין ואת הפעלת תאי הפיטום התותבים בהתבסס על הניתוחים ההתנהגותיים וההיסטולוגיים שלנו.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו דלקת ערמונית אוטואימונית ניסיונית, הוא שהיא משלבת חשיפה ללחץ במהלך ההתפתחות המוקדמת, המזרזת סימפטומולוגיה בהמשך החיים, בדומה למה שנצפה בחולים עם דלקת ערמונית כרונית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום כאבי האגן הכרוניים, כגון ההשפעה של לחץ מוקדם בחיים על התנהגות, ולספק עדויות היסטולוגיות למצבי כאב משתנים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי דלקת ערמונית כרונית, ניתן ליישם אותה גם על תסמונות כאב תפקודיות אחרות כגון דלקת שלפוחית השתן אינטרסטיציאלית, תסמונת שלפוחית השתן הכואבת, וולוודיניה, פיברומיאלגיה או מיגרנות.

ניתן אפילו ליישם אותו על מחלות נלוות פסיכולוגיות נפוצות אחרות כמו חרדה ודיכאון יום לאחר הלידה, הסר את הסכר מהכלוב הביתי והנח אותה במיכל משני נקי. שפשפו חופן מצעים בין ידיים נקיות בכפפות כדי לשמור על ריח הכלוב הביתי, ולאחר מכן העבירו עומק של סנטימטר עד שני סנטימטרים ממצעי הכלוב הביתי לרמקול זכוכית נקי עם תווית מתאימה של שני ליטר. בנוסף, בכמחצית מכל חומר מצע העשרה נוסף שנמצא בכלוב הביתי כגון קינון או נייר קמטים לרמקול הזכוכית הבא בנפרד, הניחו את כל הגורים מהמלטה אחת לתוך הכוס המוכנה והניחו מיד את הכוס ב-33 מעלות צלזיוס ו-50% לחות למשך 180 דקות.

במהלך תקופת הדגירה המופרדת, הסר את הסכר מהמיכל המשני והחזיר אותה לכלוב הביתי. החזר את כלוב הבית למיקום הדיור המתאים לו בתוך הוויווריום. בתום תקופת ההפרדה, הוציאו את כלוב הבית והוציאו את הסכר, והניחו אותו במיכל משני נקי.

לאחר מכן הוציאו את הכוס מהאינקובטור וזרקו חופן מצעים בין ידיים נקיות עם כפפות כדי לשמור על ריח הכלוב הביתי בזמן הטיפול בגורים. העבירו בעדינות את הגורים בנפרד מהכוס לכלוב הביתי והחזירו את כל ההעשרה והמצעים שנותרו בכוס לכלוב הביתי. לאחר החזרת כל הגורים, העבירו את הסכר מהמיכל המשני לכלוב הביתי והחזירו אותו למיקום הדיור המתאים לו בתוך הוויווריום.

חזור על כל ההליך הזה עבור כל המלטה שעוברת הפרדה אימהית יילודים כל יום עד היום ה-21 שלאחר הלידה. לאחר מכן גומלים את הגורים ומאכלסים אותם באותם תנאים כמו עכברי הביקורת לאורך כל הניסוי. הכן את אזור הבדיקה על ידי הנחת כרית סופגת מתחת לשולחן עליון מוגבה של רשת תיל בגובה 55 סנטימטרים.

השולחן אמור לספק מספיק מקום כדי לאפשר לחוקר להתקרב מהצד התחתון מבלי להבהיל את העכברים. הניחו עד 12 עכברים בני שמונה שבועות בנפרד מתחת לתאי פלסטיק מחוררים שקופים על גבי שולחן רשת התיל. הניחו חפץ כבד על גבי התאים כדי למנוע מהעכברים לברוח.

החזק את הבסיס של מונופילמנט מסגרת שלוש נקודות של 22 גרם פון וחשוף את המונופילמנט הנסוג. מקם את הגשושית כך שהמונופילמנט יהיה מכוון אנכית. כאשר העכבר ערני, חסר תנועה ומשקל גופו מחולק באופן שווה בין הכפות האחוריות.

מרחו אותו על הצד השמאלי או הימני של שק האשכים, הימנעו מקו האמצע עד שנצפתה עיקול קל בחוט. החזק את המונופילמנט במקומו למשך 10 שניות או עד שהחיה מראה תגובה חיובית כגון טלטול מהיר או קפיצה או התנהגות ליקוק או נשיכה המכוונת לעבר המונופילמנט. אם עכבר לא זז, ולא מפגין תגובות חיוביות במהלך יישום המונופילמנט של עשר השניות, רשום בדיקת תגובה שלילית לכל העכברים המשתמשים בחוט באותו גודל, ולאחר מכן עבור למונופילמנט המתאים הבא.

המשך לבדוק כל עכבר באמצעות המונופילמנט הגדול או הקטן הבא בהתאם לארבעה יישומים נוספים. לאחר שנצפתה התגובה החיובית הראשונה, נתחו ולאחר מכן חתכו קריו, קיבעו רקמת ערמונית מעכברים בני תשעה שבועות לקטעי קריו בעובי שבעה מיקרון. לאחר מכן, הכינו תמיסת מלאי כחול טולואידין 1% על ידי הוספת גרם אחד של טולואידין כחול O ל-100 מיליליטר של 70% אתנול ומערבלו את התערובת עד שהיא נכנסת לתמיסה.

אחסן את תמיסת המלאי בטמפרטורת החדר עד שלושה שבועות. בכוס אחרת מוסיפים גרם אחד של נתרן כלורי ל -100 מיליליטר מים המונחים על גבי צלחת ערבוב. התאם את ה-pH של תמיסת המלח באמצעות חומצה הידרוכלורית 12 טוחנת עד להשגת טווח pH של 0.5 עד 1.0.

לאחר מכן הכינו תמיסת עבודה כחולה חומצנית של 0.25% על ידי שילוב של שמונה מיליליטר של תמיסת המלאי הכחול של אודינה ו-32 מיליליטר של תמיסת נתרן כלוריד חומצית 1%. צנרת אותו למעלה ולמטה כדי להבטיח שילוב מוחלט של תמיסת המלאי הכחולה וערבב בעזרת מערבולת, הכינו את תמיסת העבודה טרייה לכל אצווה של שקופיות. שטפו את חלקי הרקמה על ידי טבילה בנפרד של השקופיות למשך כשנייה אחת בצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל נפח מספיק של PBS כדי לטבול את הרקמה לחלוטין.

הניחו לשקופיות להתייבש באוויר על מגבת נייר. לאחר מכן, הניחו שקופיות בצנצנת זכוכית עומדת המכילה מספיק מתמיסת העבודה הכחולה 0.25% טולואידין כדי להבטיח שחלקי הרקמה יהיו שקועים לחלוטין. דגרו את המגלשות למשך 10 עד 15 דקות כשאתם על נדנדה פלטפורמה המכוונת ל-15 סל"ד.

לאחר מכן טבלו שקופיות ב-PBS למשך כשנייה אחת כדי לשטוף את כל הכחול הגבוה העודף ולהניח את השקופיות בקופסת שקופיות כך שהמגלשות יהיו בצדדים. כדי לאפשר ניקוז. יבש את השקופיות בתנור בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות או לילה בטמפרטורת החדר.

לאחר הייבוש טבלו את השקופיות באתנול 95% למשך כשנייה אחת, ולאחר מכן הניחו לחלק להתייבש לחלוטין. חזור על הליך זה פעם עד 10 פעמים עד שהרקמה מתייבשת יותר כחול מסגול. לאחר מכן, טבלו את השקופיות באתנול 100% למשך כשנייה אחת והניחו לחלק להתייבש לחלוטין.

חזור על הליך זה פעם אחת עד 10 פעמים עד שהרקמה כהה עד כחולה בינונית אך לא סגולה. לבסוף, תקן את הכתם על ידי דגירה של השקופיות ב-100% קסילן למשך שלוש דקות. הניחו להם להתייבש ולאחר מכן כסו, החליקו את השקופיות עם גליצרול PPS או אמצעי הרכבה קבוע מבוסס קסילן.

מסננים את כל המדיה העודפת ומאחסנים את השקופיות שהושלמו בטמפרטורת החדר. כאשר נבדקו עם סדרה מדורגת של מונופילמנטים של Von Frame, הפרדה אימהית של יילודים בני שמונה שבועות, עכברים הציגו אלודיניה מכנית פרי גניטלית בהשוואה לעמיתיהם הנאיביים. זה בא לידי ביטוי בהפחתה משמעותית בסף הנסיגה המכנית שעוררה תגובה התנהגותית חיובית.

עדויות נוספות לדלקת כרונית של הערמונית ניתן לראות תסמונת כאב אגן כרוני המוצגות כאן מבחינה היסטולוגית הן קטעי קריוסטט של רקמות הערמונית שנצבעו בכחול או טולואידין מחומצן כדי לצפות בגרגירי טריפטאז השוכנים בתוך תאי פיטום. אחוז גבוה משמעותית של תאי פיטום מגורענים נצפה בקטעי ערמונית מעכברי הפרדת יילודים. בהשוואה לעכברים נאיביים בעת ביצוע הפרדת אימהות יילודים, חשוב לזכור לשמור על ריח הכלוב הביתי כדי למנוע דחייה של הגורים על ידי הסכר בעקבות הליך זה.

ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו בדיקות בשטח פתוח או העדפת נוזלים דו-ברירה כדי להעריך עדויות התנהגותיות להפרעות מצב רוח נלוות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך רגישות מכנית סביב איברי המין והפעלת תאי פיטום בערמונית כעדות התנהגותית והיסטולוגית לדלקת ערמונית כרונית ועכברים לאחר הפרדת האם היילודים.