דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים

כתב יד זה מפרט שיטה המשמשת ליצירת קסנוגרפלים שמקורם בחולי סרטן הערמונית (PDX) מתאי גידול במחזור (CTCs). יצירת מודלים PDX מ-CTCs מספקת מודל ניסיוני חלופי לחקר סרטן הערמונית; הגידול המאובחן השכיח ביותר וסיבת מוות שכיחה מסרטן אצל גברים.

המטרה הכוללת של הפרוטוקול הבא היא ליצור סרטן הערמונית. קסנוגרפט שמקורו במטופל מתאי גידול במחזור הדם. זה מושג על ידי איסוף דם היקפי תחילה מחולים עם סרטן ערמונית מתקדם.

כשלב שני, מבודד תא התאים החד-גרעיניים בדם, המכיל את תאי הגידול המסתובבים. לאחר מכן, התאים החד-גרעיניים מוכתמים בנוגדני CD 45 ZI על מנת לבחור את תאי הגידול במחזור באמצעות ציטומטריית זרימה, התאים מוזרקים לעכברים מדוכאי חיסון. התוצאות מראות יצירת קסנוגרפטים לסרטן הערמונית המבוססים על הזרקת תאי גידול במחזור המבודדים על ידי זרימה ציטומטרית מהדם ההיקפי של חולי סרטן הערמונית.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום סרטן הערמונית על ידי יצירת מודלים ניסיוניים חדשים שיכולים לשמש לאפיון מולקולרי של סרטן הערמונית ולפיתוח סמנים ביולוגיים חדשים. ידגימו את ההליך וויליאמס, סטודנט מהמעבדה ואומדה, חוקר מהמחלקה האונקולוגית כאן בהר סיני להתחיל לאסוף דם מלא מחולים נבחרים עם סרטן ערמונית גרורתי מכיוון שיש להם פוטנציאל למספר גבוה של תאי גידול במחזור הדם ההיקפי שלהם. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר העבירו את כל הדם לתוך שפופרת חרוטית מפוליסטירן בנפח 50 מיליליטר, יחד עם תמיסת מלח האיזון של האנק.

ביחס של אחד לאחד, פיפטה בעדינות את התערובת כדי להפוך אותה להומוגניזציה. לאחר מכן, הוסף 15 מיליליטר של תמיסת חבילת שיחות FI לצינור חרוטי פוליסטירן ריק של 50 מיליליטר. פיפטה בעדינות 20 מיליליטר מהדם המלא המדולל, תוך שימוש בהגדרה הנמוכה ביותר על גבי התמיסה ליצירת שכבה עליונה מובחנת.

לאחר מכן צנטריפוגה את הצינור ב -400 גרם למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר, הגדר את האטת הצנטריפוגה להגדרה הנמוכה ביותר כדי למנוע ערבוב של תמיסות לאחר ההפרדה. לאחר צנטריפוגה, זהה את הפס הדק, הלבן והאפור של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי ותאי גידול במחזור הדחוסים בין השכבה העליונה של הפלזמה לתמיסת ההפרדה.

בתחתית הצינור, אספו בזהירות את התאים מהפס האפור הלבן והעבירו אותם לצינור פוליסטירן של 50 מיליליטר. בעזרת פיפטת העברה מפלסטיק, ואז הוסף את זה של האנק. איזון תמיסת מלח לתאים המבודדים לנפח כולל של 10 מיליליטר.

צנטריפוגה את התערובת שוב בחום של 400 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. על מנת לשטוף את התאים, הסר את הסופרנטנט וחזור על שטיפה זו. צעד שוב.

לאחר הכביסה השנייה, השליכו את הסופרנטנט. השעו את הגלולה הנותרת בחמישה מיליליטר של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות, ודגרו את התמיסה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-400 Gs למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר והסר את מאגר הליזיס על ידי השלכת הסופרנטנט.

לבסוף, יש להשעות את הגלולה במיליליטר אחד של PBS בתוספת סרום בקר עוברי של 10% לפני הצביעה. כמת את מספר התאים ברי הקיימא באמצעות שיטת ההדרה הכחולה הסטנדרטית של טריאן על המו, ציטומטר או מונה תאים אוטומטי. לאחר מכן יש לדלל את התאים למיליון תאים למיליליטר ב-PBS עם 10% FBS, ולהניח אותם על קרח למשך שעה.

כדי לחסום קשירה לא ספציפית, חלק את תרחיף התאים לשני צינורות נפרדים. סמן צינור אחד לתאי בקרה ואחד לתאי כתמים CD 45 בצינור הבקרה. הוסף IgG אחד Kappa Zi בדילול של 1 עד 250 לריכוז סופי של 10 ננוגרם למיליליטר.

בצינור הצביעה CD 45. הוסף נוגדן ראשוני מצומד CD 45 ZI באותו ריכוז של 10 ננוגרם למיליליטר ודגר את תרחיפי התאים על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב-400 Gs למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן השליכו את ה-snat.

שטפו את התאים פעמיים על ידי השעיית כל כדור ב-PBS סטרילי בתוספת 10% FBS ואחריו צנטריפוגה ב-400 גרם למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת החייאה, השעו את התאים בתמיסה של מיליליטר אחד של PBS המכילה 10 מיקרוגרם למיליליטר של כתם מטושטש. סנן את התמיסה הסופית דרך מכסי מסננת של 35 מיקרומטר לצינורות פוליסטירן בגודל 12 מילימטר על 75 מילימטר על מנת לא לכלול גושי תאים או פסולת.

לאחר מכן אל תכלול את התאים החיוביים CD 45 ותאים מתים מהתרחיף באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי כדי להסיר אותם כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. מערבבים את תרחיף תאי הגידול הממוינים של הערמונית עם חלבוני מטריצה חוץ-תאיים ביחס של אחד לאחד ומניחים את התערובת על קרח. לאחר מכן, יש להרדים פה של גבר חסר חיסון בן שמונה עד 10 שבועות בהתאם להנחיות המוסדיות באמצעות איזו פלואור בשאיפה של 5% בליטר אחד לדקה של חמצן.

הקפידו על הרדמה מתאימה על ידי בדיקת אובדן רפלקס הקרנית והבוהן בעכבר. משוך 250 מיקרוליטר ממתלה התאים באמצעות מחט בגודל 25 ומזרק מיליליטר אחד. לאחר מכן הזרקו את כל הנפח של תרחיף תאי המטריצה החוץ-תאית באופן תת עורי לשני הצדדים העליונים של גידולי מוניטור העכבר על ידי ביצוע מישוש שבועי של אתרי הזרקת עכבר לצמיחת צפיפויות נודולריות תת עוריות.

בהתבסס על שיטת הבחירה השלילית המשמשת בפרוטוקול זה, יש צורך לא לכלול תאים מתים באמצעות כתם DAPI. כפי שמוצג כאן, אחוז התאים השליליים CD 45 מהתאים הנותרים משתנה ותלוי בעומס הגידול של המטופל, אך מופרדים בקלות מהתאים החיוביים ל-CD 45. כאשר משתמשים בשער מתאים, לאחר השתלת תרחיף תאי הגידול בערמונית, צפיפויות נודולריות תת עוריות ייראו בשני צידי העכבר.

כל צפיפות נודולרית מייצגת צמיחה של קסנוגרפט וניתן להעריך אותה כנבדלת מרקמה בריאה מכיוון שהיא בולטת משרירי הגב של העכבר והיא מוצקה יותר במרקם. מודלים של קסנוגרפט שמקורם בחולה שנוצרו מתאי גידול במחזור מסכמים גידולי ערמונית אנושיים כפי שניתן לראות על ידי צביעת המט, טואין ואאוזין, ועל ידי אימונוהיסטוכימיה עבור סמנים תאיים ספציפיים לערמונית כגון קולטן אנדרוגן ואנטיגן ממברנה ספציפי לערמונית לאחר יצירת הקסנוגרפטים. ניתן לבצע פרוטוקולים אחרים כמו פרופיל ביטוי גנים או חלבונים כדי לחקור את המנגנונים התאיים והמולקולריים התורמים לאגרסיביות של סרטן הערמונית.