Name: דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: למד ליצור מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים לחקר סרטן הערמונית. השיטה כוללת בידוד תאים מדם, סימון CD45 ZI וזרימה ציטומטרית, והזרקה לעכברים חסרי חיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר ג'ורדי אוצ'נדו מהמשאבים המשותפים של Flow Cytometry במרכז הרפואי הר סיני על עזרתם בניתוח ציטומטריית זרימה. אנו מודים לד"ר רומנה הוק ממתקן המשאבים המשותפים למיקרוסקופיה במרכז הרפואי הר סיני על סיוע ההדמיה. המחברים מודים לקרן TJ Martell על תמיכתה בפרויקט זה.

פרוטוקול זה נערך במוסד שלנו עם אישור מהלוח האתיקה מחקר המוסדי ועומד בכל הנחיות מוסדיות, לאומיות, ובינלאומיות לרווחת אדם. 1. אוסף של דם היקפי מחולים עם סרטן הערמונית מתקדם הערה: בחר בחולים עם סרטן הערמונית גרורתי. לקבל את הסכמת מטופל בכתב ולתעד את המאפיינים קליניים של חולים, כולל גיל בבידוד וכימותרפיה קודמת וטיפולים הורמונליים. חולים עם מחלה גרורתית יהיו פוטנציאל יש ריכוז הגבוה ביותר של CTCs בדם היקפי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות דם לאחר הסכמה מדעת ותחת Institutional Review Board המתאים אושר פרוטוקול. ללבוש כפפות לטקס ומעיל מעבדה לאורך כל ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר מחט 25 G פרפר וצינורות לבעל מחט. השתמש בספוגית אלכוהול כדי לנקות שטח שלוריד antecubital בין שריר הזרוע ואמה, ולאחר מכן להחיל חוסם עורקים לזרועו של המטופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט פרפר לתוך וריד antecubital ולדחוף צינור איסוף דם לבעל מחט להתחיל אוסף. לאסוף כ 10 מיליליטר של דם בצינורות אוסף המכילים חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) כדי למנוע קרישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מחט פרפר מהמטופל ולהפעיל לחץ עם כרית גזה סטרילית על אתר של ניקור וריד דקות 1. אתר מכסה בתחבושת סטרילית. </li></ol> 2. בידוד של תאי mononuclear הערה: הדם שנאסף מהשלב 1 יכיל תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) (לדוגמא, לימפוציטים ומונוציטים) בנוסף לCTCs mononuclear. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל דם טפטפת לתוך צינור חרוטי קלקר 50 מיליליטר עם טפטפת סרולוגיות 5 מ&quot;ל ולהוסיף מלח פתרון מאוזן הנקס (HBSS) ביחס של 1: 1. בעדינות תערובת פיפטה homogenize. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 15 מיליליטר של תמיסה מוכנה מסחרי (Ficoll-Paque) להפריד מרכיבי דם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות מהירות נמוכה לצינור חרוטי 50 מיליליטר קלקר ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה כל דם ותערובת HBSS, מהשלב 2.1, לתוך צינור הקלקר מהשלב 2.2, כדי ליצור שכבה עליונה ברורה. פיפטה סט להגדרה הנמוכה ביותר כדי למזער ערבוב של פתרונות, זה יבטיח הפרדה יעילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 400 XG במשך 30 דקות ב RT (25 מעלות צלזיוס). האטה מוגדרת ההגדרה הנמוכה ביותר כדי למנוע ערבוב של פתרונות לאחר הפרדה. ההאצה ניתן להגדיר לכל מהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לזהות את הפס לבן-אפור הדק של שכבת PBMCs וCTCs דחוק בין הפלזמה על פתרון עליון והפרדה בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים מהפס הלבן-אפור בשלב 2.5 לתוך צינור קלקר 50 מיליליטר בעזרת פיפטה העברה פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף HBSS 50 צינור חרוטי מיליליטר קלקר עם PBMCs וCTCs וגentrifuge שוב ב 400 XG במשך 10 דקות RT לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג גלולה נוזלית וגלולה ב 50 מיליליטר של HBSS ו צנטריפוגות שוב ב 400 XG במשך 3 דקות ב RT לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, resuspend גלולה שנותר עם 5 מיליליטר של תאי דם אדומים תמוגה חיץ דגירה הפתרון למשך 5 דקות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מאגר תמוגה תא דם האדום על ידי צנטריפוגה ב 400 XG במשך 3 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מיליליטר PBS 1x בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) כדי לחסום לפני מכתים נוגדן. </li></ol> 3. תאי מכתים mononuclear עם CD45-FITC נוגדן לסלולרי קרינה המופעל מיון (FACS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את מספר תאי קיימא (trypan הכחולים-שליליים) (מצעד 2.11) באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי. הכן 10 6 תאי השעיה 1 x / מיליליטר (ב PBS 1x עם 10% FBS) ולמקם אותו על קרח עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ לכמתהשעיה תא מהשלב הקודם לשני צינורות. צינורות תווית כשליטה וצביעת CD45. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור השליטה, להוסיף IgG1κ-FITC (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) בדילול של 1: 250. בצינור מכתים CD45, CD45 להוסיף FITC נוגדן ראשוני מצומדת (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) בדילול של 1: 250 ודגירת השעיות תא על קרח למשך 30 דקות. תיוג אנטיגן CD45 משמש להוציא תאי hematopoietic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 3 דקות ב 4 ° C, וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים, על ידי השעיית כל גלולה עם סטרילי 1 x PBS בתוספת 10% FBS ואחריו צנטריפוגה ב 400 XG במשך 3 דקות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי פתרון 1 מיליליטר של 1x PBS המכיל 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון הסופי באמצעות כמוסות מסננת 35 מיקרומטר לצינורות 12 מ&quot;מ x 75 מ&quot;מ פוליסטירן. </li></ol> 4. בידוד של הערמונית CTCs ידיFACS הערה: לנצל cytometer זרימה לאסוף CTCs השלילי CD45 החי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרות שנקבעו פיצוי באמצעות תאים מהצינור שכותרתו, &quot;שליטה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור שערים שלא לכלול פסולת ואשכולות של תאים באמצעות פרמטרים קדימה-פיזור וצד-פיזור מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים את שערי FITC באמצעות השעיות תא מהצינור שכותרתו, &quot;CD45-FITC.&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי שער קיימא (DAPI שלילי) באמצעות כחול-ערוץ האוקיינוס ​​השקט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף אוכלוסייה שלילית CD45 לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר פוליסטירן חרוטי המכיל 2 מיליליטר של רוזוול פרק זיכרון מכון (RPMI) 1,640 בתוספת 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה תא גידול בערמונית מסודרים ב 400 XG במשך 3 דקות, ואז resuspend את כדורים ב200-500 μl של RPMI בתוספת 10% FBS. </li></ol> 5. הזרקה של CTCs לעכברים וניטור של xenograft צמיחה הערה:לנהל את כל הליכי בעלי החיים בעמידה בפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים המוסדית. פרוטוקול זה נערך במוסד שלנו תחת בעלי חיים משתמשים בפרוטוקול ספציפי שאושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים שלנו בהתאם ועמידה בכל סוכנויות, תקנות רגולציה ומוסדיות הרלוונטיות והנחיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ההשעיה תא גידול בערמונית מסודרים עם מטריקס ביחס של 1: 1 ומניחים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר לפני ההשתלה תת עורית בתא אספקת 5% (נ נ /) isoflurane בשאיפה בL 1 / דקה של חמצן. להבטיח הרדמה מתאימה על ידי בדיקה לאובדן של רפלקס קרנית ובוהן בעכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 25 G ומזרק 1 מיליליטר, להזריק 250 μl של תאי גידול ערמונית ותת עורי השעיה תא מטריקס לשני אגפים העליונים של עכבר immunodeficient זכר 8-10 בן שבוע. להזריק 250 μl ללא קשר לריכוז CTC כנפח ההזרקה הוא אניערך mportant. ממשל SQ מרבי בעכבר הוא לא יותר מ 1 מיליליטר. &#160;</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג עכברים על ידי ביצוע מישוש שבועי של אתרי הזרקת עכבר לצמיחה של צפיפות קשרי תת עורי ועל ידי מדידת משקל עכברים פעמיים בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בחנק פחמן דו חמצני ואחריו נקע בצוואר הרחם והסרטן xenografts קציר תת עורית ערמונית אנושית כאשר גודל גידול הוא יותר מ -0.5 סנטימטרים ופחות מ 1 סנטימטר הקוטר הגדול ביותר על מנת להבטיח רקמת גידול מספיק לניתוחים מולקולריים והמעבר סדרתי. להרדים עכברים עם סימנים של מצוקה או ירידה במשקל של 15%, למרות גידול לא מוחשי. </li></ol>

<ol><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+discovery%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer discovery. 4, 998-1013 (2014).</li>
<li>Siolas, D., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumor+xenografts%3A+transforming+clinical+samples+into+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models.</a> Cancer research. 73, 5315-5319 (2013).</li>
<li>Joosse, S. A., Gorges, T. M., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology%2C+detection%2C+and+clinical+implications+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Biology, detection, and clinical implications of circulating tumor cells.</a> EMBO molecular medicine. 1, 1-11 (2014).</li>
<li>Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+enrichment+by+immunomagnetic+nanobeads+for+unbiased+characterization+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Negative enrichment by immunomagnetic nanobeads for unbiased characterization of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients.</a> Journal of translational medicine. 9, 1-9 (2011).</li>
<li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics+%2C+2013%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+a+cancer+journal+for+clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics , 2013.</a> CA: a cancer journal for clinicians. 63, 11-30 (2013).</li>
<li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer cell. 22, 373-388 (2012).</li>
<li>Klein, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+metastatic+human+prostate+cancer+to+androgen+independence+in+immunodeficient+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Progression of metastatic human prostate cancer to androgen independence in immunodeficient SCID mice.</a> Nature Medicine. 3, 402-408 (1997).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy.+Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345, 216-220 (2014).</li>
<li>Hodgkinson, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenicity+and+genetic+profiling+of+circulating+tumor+cells+in+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer.</a> Nature medicine. 20, 897-903 (2014).</li>
<li>Vidal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Targetable+GATA2-IGF2+Axis+Confers+Aggressiveness+in+Lethal+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">A Targetable GATA2-IGF2 Axis Confers Aggressiveness in Lethal Prostate Cancer.</a> Cancer cell. 27, 223-239 (2015).</li>
<li>Quintana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tumour+formation+by+single+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efficient tumour formation by single human melanoma cells.</a> Nature. 456, 593-598 (2008).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature. 17, 1514-1520 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

כתב יד זה מתאר שיטה לייצור המודלים PDX סרטן הערמונית מCTCs. השימוש בCTCs לדור של PDX יש דגמים כמה יתרונות חשובים פוטנציאליים בהשוואה לשיטות קיימות. ראשית, אוסף נגיש של CTCs מהדם היקפי מאפשר את הדור של דגמים ניסיוניים מאותו המטופל בשלבי מחלה שונים. שנית, איסוף דם מייצג שיטה בטוחה יותר וזולה לבודד תאים סרטניים בהשוואה לשיטות קיימות הדורשות הליכים כירורגיים לאוסף של תאים סרטניים. שיטות מרובות של ה...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/53182">Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells</a>. There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from:
Veronica Rodriquez-Bravo
to:
Veronica Rodriguez-Bravo

A correction was made to Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells.

Erratum: Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

xenografts נגזר מטופל הם מודלים ניסיוניים יותר ויותר פופולריים המשמשים לחקר הסרטן. הם יכולים לשמש לאפיון של סמנים ביולוגיים ומסלולים ביולוגיים, הערכה טרום-קלינית של יעילות תרופה, ויצירה של avatars לטיפולים בסרטן אישית 1,2. בעבר, קבוצות מחקר אחרות פיתחו מודלים PDX או על ידי השתלה או הזרקת השעיות תא הסרטני בודדות או explants כל גידול לעכברים דיכוי חיסוני 1. PDX אלה מודלים דורשים אוסף כירורגית של גידול מוצק טרי, מיימת הממארת או תפליט פלאורלי ממטופל עובר הליך כירורגי שהוא גם יקר וחושף את המטופל לסיכון מוגבר לתחלואת iatrogenic. התפתחות האחרונה משמעותית בחקר הסרטן כבר זיהוי, הבידוד ואפיון תאים סרטניים במחזור. תאים הסרטניים אלה לברוח ממסת הגידול הראשונית ולהיכנס במחזורשבו הם משחקים תפקיד קריטי בגרורות ולהרע, הגורם השכיח ביותר של סרטן הקשורים תמותה 3. ההערכה והאפיון של CTCs מכמה סוגים מוצקים גידול סיפקו מידע קליני לאבחון, פרוגנוזה, וניטור מחלת שייר 3. מגוון של גישות המשמשות כיום להסתמך על שני מאפיינים הפיזיים, הביטוי של סמנים ביולוגיים, או מאפיינים פונקציונליים של CTCs יכול לשמש כדי לבודד יעילות 4 CTCs. שיטות בידוד קיימים macroscale CTC כוללות צנטריפוגה צפיפות שיפוע, סינון פיזי עם נקבוביות מסנן והפרדה נגד מולקולות פני השטח. מתודולוגיות בידוד CTC הנפוצות ביותר מבוססות על לכידה מבוססת נוגדן של CTCs. שתי סלקציה חיובית ושלילית של סמנים פני התא יכולה להיות מועסק כדי לבודד CTCs מהדם היקפי. סלקציה חיובית לCTCs במחזור ההיקפי נפוצה משתמשת סמני אפיתל (למשל, EpCAM) שמחדש הביע בCTCs אבל תאים לא hematopoietic. החסרון של שיטה זו הוא שCTCs עם פוטנציאל גרורתי לעתים קרובות עבר אפיתל לmesenchymal מעבר (EMT), שdownregulates סמני משטח אפיתל 3. כדי לבודד CTCs עם פוטנציאל גרורתי, מתודולוגיה סלקציה שלילית המעסיקה את סמן משטח הדם, CD45, לרוקן את אוכלוסיית התאים הנורמלית של כדוריות דם לבנות ניתן להשתמש 5. סרטן הערמונית הוא הסרטן הנפוץ ביותר שאובחן וגורם עיקרי למקרי מוות הקשורים לסרטן בגברים 6. המנגנונים של התקדמות גידול ותוקפנות אינם מובנות לחלוטין, ולכן הדור והאפיון של מודלים ניסיוניים כי לשחזר הטרוגניות המולקולרית של סרטן הערמונית הם עניין משמעותי. המודלים PDX של סרטן הערמונית היו נוצר בעבר על ידי קליטתם של תאי סרטן הערמונית אנושיים לimmunocomעכברים הבטיחו 7,8. עם זאת הדור של מודלים כאלה כבר הקשו על ידי השיעור הנמוך engraftment של סרטן הערמונית בעכברים דיכוי חיסוני, אשר נבע בעיקרו האופי העצל של המחלה. לאחרונה, CTCs כבר השתמש כדי ליצור סרטן השד 9, סרטן סרטן הריאות וערמונית 10 11 דגמי PDX. מחקרי הוכחה של קונספט אלה הציגו את האפשרות של יצירה עצמאי דגמי PDX של הצורך באיסוף דגימה כירורגית. במאמר זה אנו מתארים בפירוט שיטה לייצור מודל ניסיוני הרומן הזה.

<table><tbody><tr><td>מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>Corning Cell Gro</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>35 & micro; m מסננת תאים</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי פוליסטירן</td><td>קריסטלגן</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזינג תאי דם אדומים</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>d3571</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליסטירן 12 מ"מ x 75 מ"מ עם מכסה מסננת תאים</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>352235 BD Vacutainer צינורות איסוף דם לבנדר עם</td> סט איסוף דם מכונף EDTA <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD עם כפתור לחיצה על מחט נסיגה 23 מד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD שואב אבק מחזיק</td><td></td><td></td><td></td>מחט חד</tr><tr><td>פעמי לטקס חוסם</td><td></td><td></td><td></td>עורקים</tr><tr><td>לטקס או כפפות</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>שאינן לטקסספוגיות</td><td></td><td></td><td></td>אלכוהול</tr><tr><td>2 x 2 רפידות</td><td></td><td></td><td></td>גזה כותנה</tr><tr><td>תחבושת</td><td></td><td></td><td></td>דבק</tr><tr><td>25 גרם מחט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

מודלים של קסנוגרפט שמקורם בחולה (PDX) צוברים פופולריות בחקר הסרטן ומשמשים להערכת תרופות פרה-קליניות, זיהוי סמנים ביולוגיים, מחקרים ביולוגיים ואסטרטגיות רפואה מותאמת אישית. תאי גידול במחזור (CTC) ממלאים תפקיד קריטי בגרורות גידול ובודדו מחולים עם מספר סוגי גידולים. לאחרונה נעשה שימוש ב-CTCs ליצירת מודלים ניסיוניים PDX של סרטן השד והערמונית. כתב יד זה מפרט את השיטה ליצירת מודלים PDX של סרטן הערמונית מ-CTCs שפותחו על ידי קבוצתנו. היתרונות של שיטה זו על פני מודלים קונבנציונליים של PDX כוללים עצמאות מאיסוף דגימות כירורגיות ויצירת מודלים ניסיוניים בשלבי מחלה שונים. צנטריפוגה בשיפוע צפיפות ואחריה ליזה של תאי דם אדומים ודלדול ציטומטריית זרימה של תאים חד-גרעיניים חיוביים CD45 משמשת להעשרת CTCs מדגימות דם היקפיות שנאספו מחולים עם מחלה גרורתית. לאחר מכן מוזרקים ה-CTCs לעכברים מדוכאי חיסון; ניתן להשתמש ב-Xenografts שנוצרו לאחר מכן למחקרים פונקציונליים או לקצור לאפיון מולקולרי. המגבלה העיקרית של שיטה זו היא שיטת הברירה השלילית המשמשת להעשרת CTC. למרות מגבלה זו, יצירת מודלים PDX מ-CTCs מספקת מודל ניסיוני חדשני ליישום בחקר סרטן הערמונית.

פרוטוקול זה יוביל לדור של דגמי PDX מCTCs סרטן ערמונית המבודד CD45 שלילי. בהתבסס על שיטת הסלקציה השלילית בשימוש בפרוטוקול שלנו יש צורך להוציא תאים מתים באמצעות כתם DAPI. אחוז התאים השליליים CD45 זוהה על ידי cytometry זרימה משתנה ותלוי בניטל הגידול של המטופל (איור 1 א). מכתים Immunofluorescent של תאים ממוינים באמצעות CD45 וDAPI (לזהות גרעין תא) חושף תאים שליליים CD45, כפי שצוין על ידי החצים הלבנים (איור 1). באיור 1C, ניתן לראות צפיפות קשרי תת-עורי ב...

כתב יד זה מפרט שיטה המשמשת ליצירת קסנוגרפלים שמקורם בחולי סרטן הערמונית (PDX) מתאי גידול במחזור (CTCs). יצירת מודלים PDX מ-CTCs מספקת מודל ניסיוני חלופי לחקר סרטן הערמונית; הגידול המאובחן השכיח ביותר וסיבת מוות שכיחה מסרטן אצל גברים.

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

המטרה הכוללת של הפרוטוקול הבא היא להפיק קסנוגרפט ממקור חולה (Patient derived xenograft) של סרטן ערמונית מתאי גידולים מסתובבים. זאת מושג על ידי איסוף ראשוני של דם פריפריאלי מחולים עם סרטן ערמונית בשלב מתקדם.בשלב השני, מבודל תאית התאים המונונוקלאריים של הדם, המכילה את תאי הגידול במחזור הדם. לאחר מכן, התאים המונונוקלאריים נצבעים עם נוגדן CD 45 ZI. כדי לבחור את תאי הגידול במחזור הדם באמצעות ציטומטריית זרימה, התאים מוזרקים לאחר מכן לעכברים עם מערכת חיסונית לקויה. התוצאות מראות יצירה של קסנוגרפטים של סרטן הערמונית המבוססת על הזרקה של תאי גידול במחזור הדם שבודדו בציטומטריית זרימה מדם היקפי של חולי סרטן ערמונית.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום סרטן הערמונית על ידי יצירת מודלים ניסיוניים חדשים שניתן להשתמש בהם לאפיון מולקולרי של סרטן הערמונית ולפיתוח סמנים ביולוגיים חדשים. את הפרוצדורה יעדימו Williams, סטודנט מהמעבדה, ו-Omada, חוקר מהמחלקה לאונקולוגיה כאן ב-Mount Sinai. כדי להתחיל, אספו דם מלא ממטופלים נבחרים עם סרטן ערמונית גרורתי, שכן יש להם פוטנציאל לרמות גבוהות של תאי גידול במחזור הדם הפריפרי. באמצעות פיפט סרולוגית של 10 milliliters, העבירו את הדם המלא לשפופרת קונית מפוליסטירן של 50 milliliters, יחד עם Hank's balance salt solution.במנה של יחס של אחד לאחד, העבר את התערובת בעדינות בעזרת פיפט כדי להומוגניזציה. לאחר מכן, הוסף 15 milliliters של תמיסת FI call pack לשפופרת קונית ריקה מפסטירן בנפח 50 milliliters. העבר בעדינות 20 milliliters של דם שלם מהול, תוך שימוש בהגדרה הנמוכה ביותר של הפיפט, מעל לתמיסה כדי ליצור שכבה עליונה מובחנת.לאחר מכן, סבבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-400 Gs למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר, הגדירו את הסביבה של הצנטריפוגה להאטה נמוכה ביותר כדי למנוע ערבוב של התמיסות לאחר ההפרדה. עם סיום הסבוב, זהו את הפס הדק בצבע לבן-אפור של תאי מונונוקלאריים של דם פריפריאלי ותאי גידולים מסתובבים, הנמצאים בין השכבה העליונה של הפלזמה לבין תמיסת ההפרדה.בתחתית המבחנה, אסוף בזהירות את התאים מהפס הלבן-אפור והעבר אותם למבחנת פוליסטירן של 50 milliliter. לאחר מכן, בעזרת פיפטת העברה מפלסטיק, הוסף תמיסת Balance salt של Hank's לתאים המבודדים עד לנפח כולל של 10 milliliters.סבבו את התערובת שוב בצנטריפוגה ב-400 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לשטוף את התאים, הסירו את הנוזל העליון וחזרו על שלב שטיפה זה פעם נוספת.לאחר השטיפה השנייה, השליכו את הנוזל העליון. השעו את המשקא שנותרה בחמישה milliliters של בופר לליזת תאי דם אדומים, והדגירו את התמיסה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, סובבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-400 Gs למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר והסירו את בופר הלליזה על ידי השלכת הנוזל העליון.לבסוף, השהו מחדש את המשקע ב-1 mL של PBS מועשר ב-10% fetal bovine serum לפני הצביעה. כמות התאים החיוניים תימדד באמצעות שיטת הדירה של tripan blue במיקרוסקופ, ציטומטר או סופר תאים אוטומטי. לאחר מכן, דללו את התאים לריכוז של 1 מיליון תאים ל-mL ב-PBS עם 10% FBS, והניחו אותם על קרח למשך שעה אחת.כדי לחסום קישור לא ספציפי, חלק את תרחיף התאים לשני מבחנות נפרדות. סמן מבחנה אחת לתאי ביקורת ומבחנה שנייה לתאים לצביעת CD 45. למבחנת הביקורת, הוסף IgG one Kappa Zi בדילול של 1:250 לריכוז סופי של 10 nanograms per milliliter.למבחנה לצביעת CD 45, הוסף נוגדן ראשוני המשוייך ל-CD 45 ZI בריכוז זהה של 10 nanograms per milliliter והדגר את תרחיפי התאים על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, סבב את התאים בצנטריפוגה במהירות של 400 Gs למשך שלוש דקות בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius, ולאחר מכן השליך את העלייה.שטפו את התאים פעמיים על ידי השעיה של כל משקע ב-PBS סטרילי המועשר ב-10% FBS, ולאחר מכן ביצוע סרסוגציה ב-400 Gs למשך שלוש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר השטיפה, השעו את התאים בתמיסה של מיליליטר אחד של PBS המכילה 10 micrograms per milliliter של צבע dappy. סננו את התמיסה הסופית דרך פקקי מסננת של 35 micrometer לתוך מבחנות פוליסטירן של 12 millimeter על 75 millimeter, על מנת להסיר גושי תאים או שרידים.לאחר מכן, הסירו מהתמיה תאים חיוביים ל-CD 45 ותאים מתים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. ערבבו את תמיחת תאי גידול הפרוסטטה הממוינים עם חלבוני מטריקס חוץ-תאי ביחס של אחד לאחד והניחו את התערובת על קרח. לאחר מכן, הרדימו עכבר זכר אימונו-דפיציינט בן שמונה עד 10 שבועות בהתאם להנחיות המוסדיות, באמצעות שאיפה של 5% iso fluorine בליטר אחד של חמצן לדקה.יש לוודא הרדמה נאותה על ידי בדיקת היעדר רפלקס קרנית ורפלקס בהונות בעכבר. שאבו 250 µL של תגלי התאים באמצעות מחט בכיל 25 ומזרק של 1 mL. לאחר מכן, מזריקו את כל נפח תגלי התאים של המטריקס החוץ-תאי תת-עורית לשני הצדדים העליונים של העכבר. יש לעקוב אחר הגידולים על ידי מישוש שבועי של אתרי ההזרקה בעכבר כדי לזהות צמיחה של צפיפויות קשריות תת-עוריות.בהתבסס על שיטת הבחירה השלילית (negative selection) המשמשת בפרוטוקול זה, יש צורך להסיר תאים מתים באמצעות צביעת DAPI. כפי שמוצג כאן, אחוז התאים השליליים ל-CD 45 מבין התאים החיוניים שנותרו הוא משתנה ותלוי בעומס הגידול של המטופל, אך הם מופרדים בקלות מהתאים החיוביים ל-CD 45. כאשר נעשה שימוש ב-gating נכון, לאחר השתלת תרחיף תאי גידול של ערמונית, יופיעו צפיפויות קשריות תת-עוריות בשני צדי הגב של העכבר.כל צפיפות קשרית מייצגת צמיחה של קסנוגרפט וניתן להבחין בה כנפרדת מרקמה בריאה, שכן היא בולטת מהשרירות הגבנויות של העכבר ומרקמה במיהה יותר. מודלים של קסנוגרפטים המופקים מחולי (Patient derived xenograft) שנוצרו מתאי גידול במחזור הדם משחזרים גידולי פרוסטטה אנושיים, כפי שניתן לראות בצביעת hematoxylin and eosin ובבדיקת אימונוהיסטוכימיה לסממנים תאיים ספציפיים לפרוסטטה, כגון androgen receptor ו-prostate specific membrane antigen. לאחר יצירת הקסנוגרפטים, ניתן לבצע פרוטוקולים אחרים, כגון פרופיל ביטוי של גנים או חלבונים, כדי לחקור את המנגנונים התאיים והמולקולריים התורמים לאגרסיביות של סרטן הפרוסטטה.

generation-prostate-cancer-patient-derived-xenograft-models-from

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

אנו מתארים את הייצור של הורמון כדורים דחוסים, כמו גם השתלה כירורגית תת עורית לעכברים. אסטרטגיה זו יכולה להיות משולבת עם הצמיחה של xenografts תא והרקמה תחת הקפסולה הכליות של עכברים בעירום athymic להעריך היווצרות סרטן ורגולציה של צמיחת ערמונית שפירה הורמונלי.

כליות קפסולת Xenografting ותת עור מכבישי השרשה להערכת הערמונית Carcinogenesis והיפרפלזיה שפירה של הערמונית

סרטן הערמונית הוא הגורם השני בשכיחותו למקרי מוות הקשורים לסרטן בארצות הברית. מודל סרטן אורתוטופי מספק גישה שימושית להבנת הביולוגיה של סרטן הערמונית ולהערכת היעילות של משטרי טיפול. פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים הדרושים להקמת מודל עכבר אורתוטופי לסרטן הערמונית.

דגם Murine Orthotopic פרה-קליני של סרטן ערמונית האדם

אנו מתארים שיטת תיוג יציב של xenografts נגזרות החולות (PDXs) עם חלקיקי lentiviral להביע כתבי חלבון בלוציפראז ירוקים-ניאון. שיטה זו מאפשרת מעקב צמיחת PDXs המצוי באתר הראשי, כמו גם באיתור גרורות ספונטניות ניסיון באמצעות במערכות הדמית vivo.

תיוג של xenografts הנגזר חולה סרטן השד עם כתבים לעקיבים עבור צמיחת גידולים וגרורים מחקרים

המטרה של פרוטוקול זה היא להפגין אינטרה-הערמונית הזרקה של תאי סרטן הערמונית, עם סירוס עוקבות. Orthotopic מודלים קליניים של סירוס עמידים ו אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית הם קריטיים כדי לחקור את המחלה בהקשר של microenvironment של הגידול הרלוונטית קלינית, מארח immunocompetent.

דגם Syngeneic Orthotopic זוהרים, פלורסנט מאתר של סירוס עמידים ו אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית

פרוטוקול זה מתאר את הדור של החולה הנגזר הנושא מודלים מבע על ידי פנים-ומבחינה משפטית הקניית תאים קרצינומה של תא ברמה גבוהה urothelial או פנים-rectally הזרקת תאים סרטניים המעי הגס לתוך סוכרת שמנים/חמור משולב כשל חיסוני (הנהון/SCID) עכברים לגידול הגידול הראשוני גרורות מתחת להשפעה של תאים סטרומה בצומת הלימפה, אשר מחקה את ההתקדמות של מחלות גרורתית האדם.

מטופל-נגזר אורתוטופית מודלים של תאים האדם Urothelial קרצינומה של סרטן המעי הגס ואת הגידול גרורות ספונטנית

אנו מראים שיטה של נקרופסי וניתוח של מודלים של סרטן הערמונית העכבר, התמקדות בניתוח גידול בערמונית. פרוטוקול צעד אחר צעד עבור דור של גידול בבלוטת הערמונית העכבר מוצג גם.

הדור של אורגנואידים גידול מ מהונדסים גנטית עכבר מודלים של סרטן הערמונית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השיטות כדי ליצור מודלים של מטופלים שנגזר על המטופל (PDX) ושורות של תאים סרטניים העיקרי מדגימות סרטן הקיבה כירורגית. השיטות מספקות כלי שימושי לפיתוח סמים וחקר ביולוגיה של הסרטן.

הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבדוק את היעילות של טיפולים ייעודיים שנבחרו על בסיס האיפור גנומית של הגידול. הפרוטוקול מתאר זיהוי ואימות של הסדרים מבניים של ה-DNA, חרט גידולים של חולים לתוך עכברים והתגובות בדיקה לתרופות המתאימות.

בדיקת טיפולים ייעודיים בסרטן באמצעות ניתוח שינוי DNA מבנית והמטופל נגזר Xenografts

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מודל סרטן לבלב אורתוטופי זעיר פולשני על ידי הזרקה מונחית אולטרסאונד של תאי סרטן הלבלב האנושיים וניטור לאחר מכן של צמיחת הגידול in vivo על ידי הדמיית אולטרסאונד.

יצירת קסנוגראפט אורתוטופי של תאים סרטניים בלבלב על ידי הזרקה מונחית אולטרסאונד

הטרוגניות של סרטן הערמונית ועמידות לטיפול נותרו אתגרים. אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) המשמרים את מאפייני הגידול ההורי המרכזיים. מודל סטנדרטי זה תומך בבדיקת תרופות ובהתקדמות ברפואה מדויקת.

הקמה ותחזוקה של אורגנואידים של סרטן הערמונית שמקורם בחולה: פרוטוקול ניסיוני מפורט

למד ליצור מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים לחקר סרטן הערמונית. השיטה כוללת בידוד תאים מדם, סימון CD45 ZI וזרימה ציטומטרית, והזרקה לעכברים חסרי חיסון.

דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים

גלה סרטונים נוספים