ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

המטרה הכוללת של הזרקה נפוצה לווריד הקרדינל של צבע Evans Blue ו-Fitzy Dextrin היא לבחון את שלמות ממברנת השריר השלדי בדגי זברה חיים, כדי לסייע באפיון מנגנונים הגורמים למחלה הקשורים לסוגים שונים של דיסטרופיה שרירית. הזרקת צבע Evans Blue יכולה לסייע בחשיפת מנגנונים ביולוגיים התורמים לפתולוגיה של המחלה בעת אפיון מודלים של בעלי חיים לדיסטרופיה שרירית, והיא יכולה גם לתרום להבנתנו לגבי מנגנונים טיפוליים פוטנציאליים לטיפול במחלה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבצעה ולנתח אותה באמצעות דגי זברה חיים.

בנוסף, הזרקה משותפת של Fitz Dextran מהווה בקרת איכות להזרקה מוצלחת, דבר המשפר את הדיוק והכימות. להשלכות של טכניקה זו יש חשיבות עבור התיקוף של מודלים של דגי זברה למחלות שרירים. הן גם מעמיקות את ההבנה לגבי האופן שבו מוטציות מסוימות מובילות לפנוטיפים של מחלות שרירים, כגון דיסטרופיה שרירית, דבר שהוא קריטי למציאת טיפולים ותרופות.

להכנת פלטות הזרקה עם אגר, הרתיחו 2% עד 3% אגר בתווך E3 ואפשרו לתמיסה להצטנן מעט על השולחן. מזגו כ-35 milliliters של האגר שהצטנן לתוך כל צלחת של 100 millimeter. לאחר מכן, הניחו קצה אחד של תבנית הזרקה מועדפת לתוך התמיסה לפני הנחת שאר התבנית על תמיסת האגר.

המתינו עד שתמיסת האגרו תתקשה, בטמפרטורת החדר או ב-4 °C, למשך כ-30 דקות. לאחר מכן, השתמשו בשפכטל כדי להפריד קצה אחד של התבנית מהאגרו המוצק והסִירו באיטיות את שאר התבנית. הכינו תמיסת מלאי (stock) בריכוז של 1% של צבע Evan's Blue Dye או EBD בתמיסת ringer 1x.

לאחר מכן, הכין תמיסת סטוק של Fitzy Dextrin בתמיסת one x ringer ואחסן בטמפרטורה של negative 20 degree Celsius. להכנת תערובת להזרקה, דלל EBD לריכוז של 0.1% ישירות לתוך תמיסת הסטוק של Fitz Dextrin, ערבב את תערובת ההזרקה היטב באמצעות וורטקס ושמור אותה הרחק מאור ישיר על ידי עטיפת המבחנה בנייר אלומיניום לפני ההזרקה. חמם מראש את פלטת ההזרקה לטמפרטורת החדר.

סדרו את המיקרו-מניפולטור על פלטת מתכת והציבו אותו לצד מיקרוסקופ ההזרקה. הפעילו את בקר ההזרקה המיקרוסקופית המונע על ידי אוויר. לאחר מכן, מלאו את מחט ההזרקה מהסוף (backfill) עם כ-2 עד 4 µL של תערובת EBD.

בשלב הבא, כיילו את נפח ההזרקה עם כ-5 nanoliters של תערובת EBD. לאחר מכן, השתמשו בפתרון ringer בריכוז one x כדי להרטיב את לוח ההזרקה והסירו עודפי תמיסה מהבארות. טפלו את הזחלים מראש ב-0.04% trica המדולל בפתרון ringer בריכוז one x כדי לשתק את הזחלים לחלוטין לפני ההזרקה באמצעות פיפטה מזכוכית. הניחו את הזחלים המורדמים בבארות של לוחי ההזרקה (auger injection plates), תוך וידוא שהזחלים נמצאים באופן מלא בבארות ושוכבים על צדם.

הסר את עודפי תמיסת ה-trica כדי לצמצם את תנועת הזחלים בתוך הבאר, אך השאר כמות מספקת כדי למנוע התייבשות. הנח את פלטת ההזרקה של הזחלים תחת מיקרוסקופ dissector ומיקם את מחט פיפטת ההזרקה המכילה את ה-EBD. בצע ערבוב מעל זחל דג זברה, סמוך ללב ובזווית של כ-45 מעלות מציר ה-anterior posterior.

החדירו את מחט ההזרקה לווריד הקרדינלי המשותף (common cardinal vein או CCV) ליד החלק הקדמי של החלמון, במקום שבו הווריד פונה תחילה לכיוון הגבי. לאחר מכן, הזריקו 5 nanoliters של תערובת EBD והשאירו את מחט ההזרקה במקומה למשך חמש עד שמונה שניות. כדי למזער דליפה מיידית של תערובת ה-EBD, הזרקה תקינה תראה צבע בתאי הלב, ובמידת הצורך ניתן לחזור על הפעולה.

אם לא נצפה EB DMX בלב מיד לאחר הזרקה מוצלחת, העובר יצבור Fitz Dextrin בכלי הדם כפי שמוצג כאן. לאחר שהוזרק המספר הרצוי של זחלים, החזירו את הזחלים לתמיסת 1x ringer ללא trica בצלחות של 100 מילימטר כדי להגביר את שיעור ההישרדות ולשמור על עוצמת האות. השאירו את הצלחות עטופות בנייר אלומיניום.

דגרו את הלרואות בטמפרטורה של 28.5 degrees Celsius למשך ארבע עד שש שעות כדי להבטיח ספיגה יעילה של EBD. כדי להדמיות את ה-EBD בשריר, השתמשו ב-0.04%trica להרדמת הלרואות לפני צפייה בהן תחת פלואורסצנציה אדומה. EBD הוזרק ל-CCV של מוטנטים הומוגניים של Sapia ואחים מסוג wild type ב-3D PF; הזרקות שמילאו את חללי הלב כפי שמוצג כאן, ולאחר מכן נותחו לבדיקת פרפוזיה מוצלחת של הצבע על ידי הדמיה של fitzy dextrin בכלי הדם תחת פלואורסצנציה ירוקה.

לאחר תקופת דגירה של ארבע שעות, נבחנה הספיגה של EBD ברמת הסומיט כפי שמוצג בדמות זו. אחים מסוג פרא (Wild type) לא הראו פלואורסצנציית EBD באף אחד מסיבי השריר הנראים, בעוד שבמוטנטים הומוזיגוטים של sapia נצפתה ספיגת EBD המעידה על נזק לממברנת השריר. לאחר רכישת מיומנות בהזרקת צבע Evans blue לווריד הקרדינלי המשותף של דגי זברה, ניתן להשלים את הזרקת הזחלים בתוך 30 עד 60 דקות, תלוי במספר הזחלים המוזרקים.

בנוסף, ניתן להשיג תוצאות ניסיוניות ביום אחד כדי להבטיח מיומנות. חשוב לזכור לכוון בזהירות לווריד הקרדינלי (cardinal vein) כדי להפיק תוצאות עקביות וניתנות לפירוש. פעולה זו עשויה להיות מאתגרת וככל הנראה תדרוש תרגול לאחר ביצוע פרוצדורה זו.

ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון סריקות כימיות וגנטיות, כדי לקבוע את המנגנונים המולקולריים האחראים לנזק לממברנה הקשור לדיסטרופיות שרירים. ניסויים אלה עשויים לסייע בביסוס אסטרטגיות טיפוליות חדשות למחלות שרירים לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מחקר מחלות השרירים לבחון את שלמות הממברנה במודלים של דגי זברה לדיסטרופיה של השרירים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה מעמיקה באופן הזרקת צבע Evan's blue לתוך הווריד הקרדינלי המשותף של זחלי דגי זברה. כמו כן, תבינו כיצד לזהות סיבי שריר עם נזק לממברנה על סמך נוכחותו של צבע Evan's blue בתוך הסיבים.