לומד את ההרכב של עוריות Growth Factor Receptor בתאים השלמים באמצעות מתאם מיקרוסקופית
11 בספטמבר 2015
פרוטוקול זה מתאר את התיוג של קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR) על תאי פיברובלסטים COS7, ולאחר מכן מיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאם של תאים שלמים במצב לחות. התווית הכילה נקודות קוונטיות פלואורסצנטיות. ניתן להשתמש בפרוטוקול כדי לחקור את הסטויכיומטריה של EGFR ברמת המולקולה הבודדת.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדמיות של ההתפלגות והסטוכיומטריה של קולטני גורם גדילה אפידרמלי או EGFRs בממברנה הפלזמית של תאים שלמים ומגובשים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ואלקטרונית. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול תאים המבטאים EGFR, כגון cos seven, על שבבים עם ממברנת סיליקון ניטריד בעובי 50 nanometer המשתרעת מעל אזור חלון מרכזי. לאחר מכן, התאים מדוגרים עם גרסה ביוטינילית של גורם הגדילה האפידרמלי, הנקשרת לקולטן ומשנה את הקונפורמציה של EGFR, מה שמוביל لديמריזציה ולהפעלה.
בשלב הבא, התאים מקובעים כדי להגביל את תנועת הקולטנים ומודגנים עם נקודות קוונטיות מצומדות ל-Hagen מנוקות (stripped) הנקשרות לקולטני EGF מופעלים, ולאחר מכן התאים מדויקים. לבסוף, קיבוע שני באמצעות גלוטראלדהיד יוצר קשרי צלבה בין הנקודות הקוונטיות המצומדות ל-stripped habit לבין ה-EGFR ומייצב את הדגימה לצורך מיקרוסקופיה אלקטרונית. התוצאות מראות פליטה של פלואורסצנציה אדומה באמצעות דימוי נקודות קוונטיות פלואורסצנטיות, ואת התפלגות ה-EGFR, המצב הסטוכיומטרי או הקיבץ (clustering) שלו באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים חודרת עם סריקה (STEM).
שיטה זו מספקת מידע ייחודי על גאומטריית המלאי וההפצה של רספטורים ממברנליים בתאים שלמים, ויש להשתמש בה כדי לקבל תובנות לגבי הפעלת הרספטור לגורם גדילה אפידרמלי בתאים נורמליים ובתאי סרטן. ניתן ליישמה גם לחקר רספטורים ממברנליים אחרים, כגון תעלות יונים. כדי להתחיל, יש לעבוד תחת מbigcup כימי. עבור שלבי ההכנה הראשונים של מיקרוצ'יפים עם ממברנת סיליקון ניטריד, ולאחר טבילה באצטון בהתאם לפרוטוקול הכתוב, העבירו את המיקרוצ'יפים ישירות לכלי כימי עם אתנול והמתינו שתי דקות; הוציאו את השבבים מהאתנול והניחו אותם על נייר ניגוב של חדר נקי.
לאחר שהשבבים התייבשו, העבירו אותם למשטח זכוכית שהונח מראש בתוך צלחת פטרי. לאחר מכן, הניחו את המכסה על הצלחת. בשלב הבא, הכניסו את משטח הזכוכית עם השבבים המיקרוסקופיים למנקה פלזמה.
הפעילו תוכנית ניקוי סטנדרטית למשך חמש דקות כדי להפוך את פני השטח של ממбраסת הסיליקון ניטריד להידרופיליים. לאחר מכן, תחת מנדף זרימה למינרית, העבירו את השבבים המיקרוסקופיים מהזכוכית. החליקו אותם על נייר ניגוב לחדר נקי לפני הנחתם בתוך באר של פלטת 24 בארות המלאה בתמיסת poly L lysine או PLL, והדגירו למשך חמש דקות.
לאחר מכן, העבירו את השבבים המיקרוסקופיים אחד אחד לבאר שנייה המכילה מים בדרגת HPLC לפני השטיפה בבאר מים שנייה. לבסוף, מקמו את השבבים המיקרוסקופיים באופן פרטני בבארים של פלטת 96 בארות הממולאות ב-DM, והניחו את הפלטה באינקובטור פחמן דו-חמצני תוך שימוש בתרבית משנה של שבע תאים של COS. הכינו תרחיף תאים בפיזור מונו-דיספרסי בריכוז של כמעט חמש פעמים 10th.
חמשת התאים למילליטר. הוסף טיפה אחת של תרחיף תאים לכל מיקרוצ'יפ בלוחית ה-96 בארות והדגר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות תחת מיקרוסקופ הפוך. התחל לבחון את אזורי המיקרוצ'יפים כדי להגיע לצפיפות מקורבת של 20 עד 30 תאי cos seven לחלון של 150 על 400 מיקרומטר.
כאשר התאים נצמדו באופן מספיק, העבירו בזהירות את השבבים המיקרוסקופיים כשהצד עם התאים פונה כלפי מעלה לבארות חדשות המכילות dm. כאשר נותרו תאים צמודים במספר מספיק, העבירו את השבבים המיקרוסקופיים כשהתאים פונים כלפי מעלה לבארות חדשות המכילות serum free dmm. לאחר מכן, דגרו את השבבים המיקרוסקופיים בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור פחמן דו-חמצני למשך מספר שעות ועד ללילה לקראת השלבים הבאים.
מלאו את בארות פלטת 96 בארות בתמיסות הדרושות והשתמשו בשורה או עמודה אחת עבור כל מיקרוצ'יפ. שטפו את המיקרוצ'יפים על ידי הנחתם בבאר עם B-S-A-G-E-L-P-B-S טרי והדגירו ב-37 °C למשך חמש דקות. העבירו את המיקרוצ'יפים לתמיסת EGF biotin בריכוז 300 nM והחזירו אותם לאינקובטור למשך שלוש דקות, שכן התאים יתחילו לבצע אנדוציטוזה של ה-egfr המסומן ב-EGF.
שטפו במהירות את השבבים המיקרוסקופיים שלוש פעמים באמצעות PBS. לאחר מכן, שטפו את הדגימות באמצעות בופר cate בריכוז 0.1 molar או CB. בשלב הבא, העבירו את השבבים המיקרוסקופיים ל-3% PFA והדגירו למשך 10 דקות.
לאחר שטיפה אחת עם CB ושלוש שטיפות עם PBS, העבירו את השבבים ל-G-L-Y-P-B-S והדגירו למשך שתי דקות. לאחר מכן, שטפו פעמיים באמצעות PBS. כעת, הניחו את המיקרושבבים ב-10 NANOMOLAR S-T-R-Q-D למשך 10 דקות לפני שטיפה ארבע פעמים עם B-S-A-P-B-S.
לאחר מכן, טבולו מיקרוצ'יפ אחד בצלחת בעלת תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר הממולא מראש ב-B-S-A-P-B-S בטמפרטורת החדר, כדי לדמות את התאים באמצעות מיקרוסקופיית DIC ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה. השתמשו בעדשה אובייקטיבית 40x באוויר לצילומי סקירה של תאים המסומנים ב-QD 6 55. השתמשו בקוביה של פילטר המעוררת את הנקודות הקוונטיות בין 340 ל-380 ננומטר עם פליטה מעל 420 ננומטר.
יש להפחית את עוצמת האור כדי למנוע חשיפה חזקה מדי שעלולה לפגוע בדגימה. הגדירו את זמן החשיפה ל-300 מילישניות לפחות, כדי שניתן יהיה ללכוד את האותות של כל ה-qds בזמן שפלואורסצנציית ה-QD מהבהבת. כוונו את עוצמת האור ואת ההגברה כדי להשיג תמונות בהירות ללא רעש תמונה נראה, תוך מזעור עוצמת האור. לאחר הצילום, החזירו את המיקרוצ'יפ לפלטת 96 באריות עם B-S-A-P-B-S.
שטוף פעם אחת ב-cb, לאחר מכן העבר ל-2% glutaraldehyde והדגש למשך 10 דקות לאחר מכן. שטוף ו-CB השתמש ב-B-S-A-P-B-S כדי לשטוף את השבב המיקרוסקופי שלוש פעמים ואחסן בבארות הממולאות מראש ב-B-S-A-P-B-S של פלטת 96 בארות חדשה עבור כל שבב מיקרוסקופי. מלא שורה של ארבע בארות במים בדרגת HPLC.
לאחר הגדרת ה-ESEM בהתאם לפרוטוקול הכתוב, טענו דגימה לבמה של ה-pre-COOL ESEM STEM על ידי הוצאת פלטת ה-96 WAT ממכל הקירור והנחתה בקרבת במת ה-ESEM הפתוחה. הניחו נייר ניגוב לחדר נקי לצדה. שטפו במהירות מיקרוצ'יפ על ידי טבילה ארבע פעמים למשך שנייה אחת בכל פעם בבאר ממולאת במים בדרגת HPLC.
ייבשו קלות את גבו של השבב (microchip) על נייר סופג והניחו אותו על הבמה שהקוררה מראש עם 3 µL של מים בדרגת HPLC שקוררו. הרטיבו את פני הדגימה וקבעו את הדגימה על הבמה. לאחר מכן, הניחו שלוש טיפות מים נוספות של 3 µL כל אחת על הבמה בסמיכות לדגימה וסגרו את תא הדגימה.
לאחר זיהוי תא רלוונטי, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הקליטו תמונת סקירה של התא ב-STEM, עברו לאזור פריפריאלי של התא שבו גבול התא נראה, והגדילו להגדלה של 50,000 X. הקליטו תמונות המראות qds בודדים והשתמשו בזמני שהייה של פיקסל (pixel dwell times) של 20 עד 30 מיקרו-שניות; מוצגים כאן EGFR קשורי ממברנה המסומנים ב-QD 6 55 בתאי COS seven שלמים ומחוהים באופן מלא. תמונת ה-DIC כאן ממחישה את טופוגרפיית הממברנה של התאים, ותמונת הפלואורסצנציה התואמת מראה את התפלגות ה-EGFR על פני כל שטח הפנים של התא לאחר שלוש דקות של דגירה עם EGF biotin.
תמונות ESEM STEM אלו בהגדלה נמוכה חושפות מבנים עדינים כגון פילופודיה (filopodia) הנמתחים מהתא לעבר תאים שכנים, ומבנים מסוימים בתוך אזורי התא הדקים יותר. אזורי תא מרכזיים עבים, כולל הגרעין, נראים לבנים מכיוון שמעבר של אלקטרונים באנרגיה שבה נעשה שימוש אינו אפשרי דרך הדגימה. רזולוציה גבוהה.
תמונות ESEM STEM של האזורים ההיקפיים הדקים יותר מראות תוויות QD על קיפול ממברנה החוצה את התמונה באלכסון. למבנה ממברנה זה יש צפיפות EGFR גבוהה יותר מאשר באזורי הממברנה הסובבים במספר מיקומים, כאשר שתי תוויות היו בקרבה רבה. שתי דוגמאות עם מרחקים של 20 ו-24 nanometers מסומנות בחצי חצים.
זוגות תיוגים אלו מפורשים כשייכים ל-EGF Fers. תמונה זו הוקלטה מאזור עם צפיפות EGFR ואות פלואורסצנטי נמוכים יותר. למרות זאת, EGFR נמצא כאן גם בצורת דימרים, ונצפו שני אשכולות של 10 או 11 EEG.
לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את הכנת הדגימה בתוך שעתיים, מהר בהרבה מטכניקות הנפוצות במיקרוסקופיה אלקטרונית. דימויי essem STEM שלאחכך יכולים לספק עד 100 תמונות ברזולוציה גבוהה בתוך חצי יום.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את הוויזואליזציה של קולטני הגורם השומשומני לצמיחה אפיתליאלית (EGFRs) בתאי פיברובלסט COS7 באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ואלקטרונית. השיטה משתמשת בנקודות קוונטיות פלואורסצנטיות כדי לחקור את ההפצה והסטוכיומטריה של EGFR ברמת המולקולה הבודדת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- קולטני גורם הגדילה האפידרמליים (EGFRs) ממלאים תפקיד מכריע באיתות תאי.
- הבנת התפוצה של EGFR יכולה לספק תובנות לגבי תהליכים תאיים בתאים נורמליים ובתאי סרטן.
- נקודות קוונטיות פלואורסצנטיות מהוות כלי רב עוצמה לדימוי של מולקולה בודדת.
- מיקרוסקופיה משולבת של אור ואלקטרונים (CLEM) מאפשרת ניתוח מבני מפורט.
מטרת המחקר
- להדמיית הפריסה של EGFRs בממברנה הפלזמית של תאים שלמים.
- להערכת הסטוכיומטריה של EGFRs באמצעות טכניקות דימוג מתקדמות.
- לספק תובנות לגבי הפעלת EGFR בהקשרים תאיים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול תאי COS7 המבטאים EGFR על מיקרוצ'יפים של ממברנת סיליקון ניטריד.
- דגירה של התאים עם EGF ביוטינילי למטרת הפעלה וסימון של EGFRs.
- שימוש בנקודות קוונטיות (quantum dots) לצילום פלואורסצנציה של EGFRs.
- שימוש במיקרוסקופיית אלקטרונים בשידור סורק (STEM) לניתוח מבני.
תוצאות עיקריות
- הושגה סימון מוצלח של EGFRs באמצעות נקודות קוונטיות.
- דימות פלואורסצנטי חשף את ההפצה וההצטברות של EGFRs.
- מיקרוסקופיה אלקטרונית סיפקה תובנות מבניות מפורטות לגבי ארגון הרצפטורים.
- השיטה הדגימה יישומים פוטנציאליים לחקר רצפטורים אחרים של הממברנה.
מסקנות
- פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה מפורטת של EGFRs בתאים חיים.
- הוא מציע גישה ייחודית לחקר הפעלת רצפטורים והצטברותם (clustering).
- הממצאים עשויים לתרום להבנת הדינמיקה של רצפטורים במצב בריאותי ובמצב מחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה ישירה של הסטוכיומטריה והארגון המרחבי של EGFR בתאים שלמים ומסוגננים, ובכך מספק תובנות מכניסטיות לגבי מצבי הפעלת הקולטן הרלוונטיים לתיקוף מטרות אונקולוגיות. באמצעות קורלציה בין מיקרוסקופיה פלואורסצנטית למיקרוסקופיה אלקטרונית, הוא תומך בהפחתת סיכונים בהיפותזות טיפוליות המכוונות ל-EGFR באמצעות נתונים כמותיים ברזולוציית מולקולה בודדת בתנאים קרובים למצב הטבעי. גישה זו מסייעת בקבלת החלטות בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הבהרת הדינמיקה של דימריזציה והצטברות (clustering) של הקולטן, המשפיעות על יעילות האיתות ועל יכולת הניבוי של התגובה לתרופות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של הומו-דימריזציה של EGFR והיווצרות צברים מסדר גבוה כמצבים תפקודיים הקשורים להפעלה.
- ערך מדעי: מספק ראיות ישירות לאוכלוסיות EGFR מונומריות, דימריות ובצברים קטנים בסביבות רלוונטיות פיזיולוגית.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים של המטרה על ידי הבחנה בין מקבצי קולטנים זמניים ויציבים שעשויים להפעיל מסלולים במורד הזרם באופן שונה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: יצירת מפות מרחביות כמותיות בקנה מידה ננומטרי של התפלגות רצפטורים לצורך כיול של בדיקות קישור של נוגדנים או ליגנדים.
- ערך תפעולי: קביעת תקן של דימוי קורלטיבי לתיקוף בדיקות אוליגומריזציה מבוססות פלואורסצנציה עם אישור מבני אורתוגונלי.
- ערך תפעולי: מאפשר נורמליזציה של הבדיקה לספירות של מולקולות EGFR בודדות, מה שמשפר את השחזוריות לאורך קמפיינים של סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין הארגון של EGFR בקנה מידה ננומטרי למצבים תפקודיים במודלים של מחלות, ובכך תומך ברלוונטיות של ממשקי הדימריזציה כסממנים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מאפשר השוואה של ארגון EGFR בין הקשרים של סוג בר (wild-type) לבין הקשרים מוטנטיים (למשל, וריאנטים של סרטן) כדי לסייע בבחירת מודל פרה-קליני.
- ערך אסטרטגי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרה על ידי אספקת מתאמים מבניים ישירים של מצב ההפעלה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מסקירת מעורבות המטרה ועד לאופטימיזציה של תרכובות מובילות, כאשר הבנת האוליגומריזציה של הקולטן מספקת מידע לתכנון מבוסס מבנה ולפירוש של בדיקות תפקודיות.
- ביולוגיה של גילוי: בחינת היפותזות לגבי מנגנוני הפעלה של EGFR באמצעות ויזואליזציה של מצבים סטוכיומטריים בהקשרי תאים חיים.
- סריקה: אספקת תוצאות כמותיות לתיקוף בדיקות (assay validation), להבטחת אותות פלואורסצנציה המשקפים תפיסות קולטן (receptor occupancy) וצבירה (clustering) אמיתיות.
- אנליטיקה: אספקת סטטיסטיקה מרחבית בקנה מידה ננומטרי (למשל, מרחקים בין תיוגים, גודל צביר) המאפשרים השוואה אובייקטיבית של מצבי קולטן בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: קישור נתוני קישור (binding) in vitro לארגון קולטנים טבעי, לתמיכה בהסברה (extrapolation) לפתופיזיולוגיה ברמת הרקמה.
- שימוש חוזר ארגוני: ביסוס שיטה תואמת-פלטפורמה לחקר קולטני ממברנה אחרים (למשל, תעלות יונים, GPCRs) באמצעות אסטרטגיות תיוג דומות של נקודות קוונטיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בהיפותזות המכוונות ל-EGFR על ידי הפחתת אי-הוודאות לגבי הרכבה מוקדמת של רצפטורים ושינויים קונפורמציוניים המושרים על ידי ליגנדים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הערכת הסטוכיומטריה של הרצפטור בין צוותים באמצעות דימוי קורלטיבי עם בקרות פנימיות מובנות (סימון dual-QD).
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי אספקת תיקוף מבני מוקדם של מנגנוני מעורבות המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מודולטורים של EGFR בהתבסס על יכולתם לווסת מצבים אוליגומריים ספציפיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה אלקטרונית ואורית קורלטיבית (CLEM), בביו-קונג'וגציה של נקודות קוונטיות ובסימון תאים חיים בתנאים פיזיולוגיים.
- תלוי בגישה למיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת סביבתית (ESEM) עם גילוי STEM ויכולות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי קיבוע וסימון כדי לשמר את הדינמיקה הטבעית של הרצפטורים ולמנוע הצטברות (clustering) מלאכותית.
- כולל שיקולי התאמה עבור שורות תאים שונות או רמות ביטוי שונות של רצפטורים כדי להבטיח יחס אות-רעש אופטימלי בגילוי STEM.
- מוגבל על ידי הצורך במצעי מיקרוצ'יפ ייעודיים ובשמירה על הידרציה תואמת ואקום במהלך הדמיית ESEM.
שאלות נפוצות בביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:45
Preparation of Silicon Nitride Membrane Microchips
2:56
Preparation of Cells on Microchips
3:52
EGFR Labeling, Fixation, and Fluorescence Microscopy
6:12
Wet Environmental Scanning Electron Microscopy-Scanning Transmission Electron Microscopy of Whole Cells (ESEM-STEM)
7:20
Results: EGFR Stoichiometry in Labeled COS7 Cells
8:45
Conclusion
