Name: עבודה עם רקמות אנושיות לחקר סרטן Translational (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: למד שיטות עיבוד רקמות אנושיות למחקר סרטן תרגומי. הטכניקות ממקסמות איכות וכמות נתונים מדגימות מוגבלות, ומאפשרות זיהוי מוטציות ותתי-סוגי תאי חיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי התרומות הפילנתרופיות של ג&#39;ון ג &#39;וקרן מארי סטלה Kenedy זיכרון (גרנט # 0,727,033) והברית המחקר מלנומה. המחברים מבקשים להודות לאוניברסיטה של ​​רקמות טקסס MD Anderson Cancer Center מוסדיות בנק (ITB) על תיאום הפצה וגביית רקמות והקלת מחקר translational, כמו גם ד&quot;ר איגנסיו Wistuba, ד&quot;ר ויקטור פרייטו, מחלקת מרכז סרטן MD Anderson ב פתולוגיה ולנומה ירח Shot התכנית. לבסוף, המחברים מבקשים להודות לכל החולים ומשפחות שנפגעו על ידי מלנומה.

הצהרת אתיקה: פרוטוקול זה אושר על ידי אוניברסיטת טקסס מרכז סרטן MD Anderson. 1. רכש דגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות רקמה מגידול עודף מחקר ורקמות נורמליות קשורות 10-12. דגימות חנות על קרח רטוב כדי למנוע autolysis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח את כל הרקמות, מכשירים רפואיים וגופים זרים הוסרו במהלך ניתוח למחלקה לפתולוגיה לבדיקה הכרחית על מנת להקל על אבחנה פתולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידית רקמה שהוקצתה למחקר בהתאם למחקר רלוונטי ומדיניות בנקאות רקמות ונהלים. הערה: אוסף Biospecimen כרוך בתיאום של הפתולוגים, &#39;פתולוגים עוזרים, histotechnologists ומומחי רכש רקמות. </li></ol> 2. פתולוגיה אבטחת איכות (QA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם ולאמת רשומות מטופל כאמצעי QA מוקדם ולהתייעץ פתולוג לסקור רשות אבחוןרשומות tient (דוחות פתולוגיה, שקופיות רקמה, וכו &#39;) ודגימות רקמה. דגימות רקמת שופט על מאפיינים מורפולוגיים של עניין, כגון אחוז הגידול, נמק, ממשק רקמת גידול, וכו &#39;זה הוא בהתאם לשיטות עבודה מומלצות biorepository 10-12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סקירה ראשונית, לערוך בדיקות תקופתיות של נתונים biorepository ודגימות מחקר במהלך כל משך שהות של biospecimen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות קישור וביאורים מההיסטופתולוגיים ואחרות חקירות לדגימות ולספק את הנתונים לחוקרים באמצעות מערכת תוכנת קניינית biorepository. הערה: תהליכי QA להבטיח את השלמות של שני היבטים הקליניים וטכניים של פעולות biorepository. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בדיקות גנטיות ומולקולריות כדי לאמת ולאפיין את הדגימות לשימוש קליני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ולנתח נתונים המבוססים על משוב מחוקרים שכבר משתמשים דוגמאות לניסויי מעבדה. מַסלוּלדגימות באמצעות טכנולוגית הברקוד. מערכת מעקב אלקטרונית זה גם דגלה בשיטות עבודה המומלצות biorespository 10-12. </li></ol> 3. דגימה / עיבוד רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד לאחסן דגימות רקמה טריות על קרח רטוב, ותהליך מהר ככל האפשר, על מנת להגביל את השינויים הנגרמים על ידי מיצוי של דגימת הרקמה מסביבתו הטבעית. נורמלי תהליך גידול בהתאמה ודגימות רקמת גידול בנפרד, כדי למנוע זיהום צולב. הערה: מבוסס על פרוטוקולי מחקר, עיבוד biospecimen יכול לערב אוסף של הדגימות בסוג אחד או יותר של תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת התהליך, להכין צלחת פטרי סטרילית תרבות, אזמל, כמו גם מחט או מלקחיים לעיבוד רקמות. ודא שצינורות ערוכים, שכותרתו, והניחו את כדי להגביל את הזמן של עיבוד מדגם (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל המידע רלוונטי הרקמה, כגון שם החולה, מספר, טיפול, תאריךניתוח, ומידע רלוונטי אחר כפי שיהיה מתאים למחקר, צריך להיעשות נגישים בבסיס נתוני רקמות מוסדיים. מידע על חולה מוגבל צריך להתקיים במעבדה בנייר או בצורת גיליון אלקטרוני. הערה:. לאסוף מידע biospecimen רלוונטי לאופי של דהינו המחקר רק, מחקר בסיסי ביו-רפואי, מחקר קליני, מחקר translational, וכו &#39;לקבלת מידע ספציפית למחלה, צוות biorepository צריך לאסוף נתונים ההכרחיים בספרות הנוכחית וארגונים המסדירים ל להבטיח אבחון נכון ומחקר משמעותי. זה כולל אך אינו מוגבל לציוני גידול ומידע בימוי סרטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנן את כל הניסויים הבאים הרצויים מראש, כדי להחליט על הגודל של חלקי רקמות הנדרשים לכל סוג של ניתוח, כמו גם את המיקום של חתכים. באופן אידיאלי, אם כי בלתי אפשרי, כל הניתוחים צריכים להיות נציג של סעיף הרקמה כל כדי להסביר heterogenei הרקמהטאי והטית מגבלה של ניתוחים במורד הזרם. הנח את כל פריטים הנדרשים מראש כמתואר באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את דגימת הרקמה בצלחת פטרי התרבות הפתוחה, שטוחה על המשטח. הערה: אפשר מורשה בלבד צוות biorepository לטפל דגימות מזוהות ולסקור נתונים בריאות זיהו. חוקרים צריכים לגשת רק מי מזהה מטופל כפי שמתיר נחתמו ההסכמות הודיעו וכפי שמוסדר על ידי IRB. כל הדגימות חייבת להיות מסומנות כראוי וצריכה לכלול במינימום, סוג מספר זיהוי רקמות ורקמות ייחודי. אינו כולל כל אובדן כושר עבודה בתוויות, בהתאם לתקנות HIPAA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק מדגם מכל הזוויות, כדי להשיג הבנה טובה יותר של המבנה וממדיו. הצמד את המדגם לתחתית הצלחת עם המחט, ולהמשיך לחצות את הרקמות לאורך הציר הגדול ונציג הטוב ביותר שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור פיסה קטנה של רקמה ולמקם אותו בMICR 1.5 מיליליטר סטריליצינור ocentrifuge מכיל 1ml של פתרון הייצוב-רנ&quot;א. מדגם זה יכול להיות ממוקם על קרח למשך שארית התהליך ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד צורך. הערה: כאשר עובד עם RNA, תמיד צריכה להיות משוחק כפפות, ויש להשתמש בי טיפים מסנן RNAse ללא להגביל את הסיכויים של השפלה וזיהום RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קלטת ביופסיה פתוחה ושכותרתו מראש במכסה של צלחת פטרי התרבות. לגזור פרוסה של רקמה לא עבה יותר 3 עד 5 מ&quot;מ ולהעביר אותו לקלטת. מניחים את הקלטת ב 10% שנאגרו פורמלין ניטרלי (NBF) למינימום של 72 שעות. העבר את קלטת אתנול 70% לאחסון לטווח ארוך לפני פרפין-הטבעה. הערה: תיוג של קלטות צריכה להתבצע בעיפרון או עם סמנים מומלצים כשימוש בקסילן במהלך העיבוד יהיה אחרת למחוק תוויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור פיסת הרקמה ולמקם אותו בתבנית רקמה. מכסה את קטע הרקמה בטמפרטורה אופטימלית חיתוך מתחם (אוקטובר), ולהקפיא אותו באופן מיידיב -20 ° C לcryosectioning. סעיף רקמה זו עשויה להיות מאוחסן ב -20 ° C עד מוכן לcryosectioning. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור אחד או חלקים רבים של רקמות ולהעביר אותם לצינור 50 מיליליטר מכיל מאגר MACS (1x ופר פוספט (PBS), 0.5% בסרום שור עוברי (FBS), 2 מ&quot;מ חומצת Ethylenediaminetetraacetic (EDTA)) לזרימה לאחר ניתוח cytometry . לcytometry זרימה, דגימות גדולות יותר עשויות להיות עדיפות כתאים עלולים ללכת לאיבוד בהתנערות גידול, קיבוע התא וpermeabilization בעת צורך. בדרך כלל, סעיף זה עשוי להילקח בסוף, לאחר שכל החלקים האחרים כבר מעובד. שאריות מדגם גידול נציג עשוי לשמש לcytometry זרימה. לחלופין, צינור זה ניתן לאחסן על 4 מעלות CO / N או המשמש לעיכול מייד לאחר צביעת הזרימה cytometric להשעית תא (ראה שלב 4 - זרימת Cytometric מכתים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך שארית הרקמה לחתיכות לא גדולות יותר מגודל מרבי של 0.5 מ&quot;מ x 0.5 מ&quot;מ ולהעביר אותם לקירורבקבוקונים להקפאה מיידית בחנקן נוזלי. דגימות Snap-קפוא אלה עשויות לשמש לעתיד ניתוחים ומטרות משותפות. הערה: טיפול נוסף יש לנקוט בעת עבודה עם חנקן נוזלי כקשר ישיר יכול לגרום לפציעה חמורה. עיניים צריכה להיות מוגנות עם משקפיים בטיחות עם מגיני צד או עם מגן פנים. צריכים גם להיות משוחק כפפות קריוגני כדי להגן מפני כוויות חנקן נוזליים הנגרמות על ידי תזה ומגע ישיר. כפפות צריכים להתאים כראוי אבל להיות משוחרר מספיק כדי להסיר במהירות צריך להתיז חנקן הנוזלי לתוכם. </li></ol> 4. זרימה Cytometric מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenization רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני עיכול עם DMEM (40 מיליליטר), DNase אני (50 U / ml) וCollagenase אני (2 מ&quot;ג / מיליליטר). מניחים גידול טרי או O / מאוחסן-N במאגר MACS במכסה של צלחת פטרי, ולצלול עם מדיום עיכול. הערה:. שיטות עיכול שונות קיימות, כל אחד עם יתרונות כלומר, לשעבר חלבון פני תא (pression, כדאיות). ודא שיש לך את השיטה המתאימה ליישום במורד הזרם הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידול צמד לתחתית הצלחת עם מחט, ולחתוך ממחוץ למרכז עם אזמל, עד הגידול בעל מרקם כמו דבק. העבר את תערובת גידול לשפופרת 50 מיליליטר, חותם ומקום בשקית פלסטיק, כדי למנוע הדלפות. העבר את הצינור לחממה, ולסובב ב 225 סל&quot;ד, 37 ° C, 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן השעיה תא סרטנית דרך מסננת תא 70μm. השעיה תא צנטריפוגה ב 250 XG, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות. גלולה תא גלולה במאגר 1 מיליליטר FACS (500 מיליליטר PBS, 1 מיליליטר 0.5 M המניה EDTA, FCS 10 מיליליטר או FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer מחדש להשעות בריכוז של 1x10 מיליליטר / 7 תאים. העברה לכל גם 100 μl (10 6 תאים) בצלחת תחתונה גם עגולה 96 לצביעה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדאיות ונוגדן מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של פתרון כתם כדאיות היטב כל אחד ולערבב. Incuבייט במשך 30 דקות, בשעת 4 מעלות צלזיוס, בחושך. ספין למטה תאים ב 250 XG, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות, ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תערובת נוגדנים בריכוז מומלץ / טיטרציה (לפי יצרן) לאנטיגנים משטח ב200 μl של חיץ FACS. דגירה תאים ב 4 מעלות צלזיוס, 30 דקות, בחושך. ספין למטה תאים ב 250 XG, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות, ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 200 μl של חיץ FACS, ספין למטה תאים ב 250 XG, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות, ולשאוב supernatant. Resuspend תאים ב200 μl של חיץ FACS ולהמשיך לזרום cytometer לרכישה וניתוח. הערה: אם ביצוע צביעת cytometry זרימה תאית, לבצע קיבוע וצעדי permeabilization וצביעה תאית בין צעדי 4.2.2 ו4.2.3. אם ביצוע מכתים ציטוקינים, תאים צריכים להיות הכתמה קודמת הופעל מראש מומלצים, ומעכב של תחבורה תאית חלבון והפרשה כגון monensin יש להשתמש בעת הפעלה ללהבטיח שמירה על גורמים מסיסים. תאים קבועים ניתן לאחסן לטווח קצר (שבוע) על 4 מעלות צלזיוס בלפני הרכישה הכהה על cytometer זרימה. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Biology.+Fixing+problems+with+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell Biology. Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346, 1452-1453 (2014).</li>
<li>van der Worp, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+animal+models+of+disease+reliably+inform+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Can animal models of disease reliably inform human studies.</a> , PLoS Med. 7, e1000245 (2010).</li>
<li>McCabe, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Animal models of disease.</a> Physiol. Behav. 68, 501-507 (2000).</li>
<li>Woolf, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meaning+of+translational+research+and+why+it+matters%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The meaning of translational research and why it matters.</a> JAMA. 299, 211-213 (2008).</li>
<li>Brockbank, K. G., Taylor, M. J. Tissue Preservation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrockbank%2C+KG+%22Advances+in+Biopreservation%22">Advances in Biopreservation</a>. , 157-159 (2006).</li>
<li>Bulmer, M. The ethics of social research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBulmer%2C+M+%22Researching+social+life%22">Researching social life</a>. Gilbert, N. , Sage. London. 45-57 (2001).</li>
<li>Penslar, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPenslar%2C+RL+%22IRB+guidebook%22">IRB guidebook</a>. , US Government Printing Office. (1993).</li>
<li>Protection of human subjects. CFR Title 21 Section 50.25. , Food and Drug Administration. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?FR=50.25">http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?FR=50.25</a> (2011).</li>
<li>HIPAA privacy rule and public health. Guidance from CDC and the US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su5201a1.htm">http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su5201a1.htm</a> (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MD+Anderson+Cancer+Center+Institutional+Tissue+Bank+Standard+Operating+Procedures%22">MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures</a>. 3, Institutional Tissue Bank. (2009).</li>
<li>Collection, Storage, Retrieval and Distribution of Biological Materials for Research. , 3rd ed., International Society for Biological and Environmental Repositories. Available from:
 <a target="_blank" href="http://biorepository.uic.edu/Contact_Us_files/ISBERBestPractices3rdedition.pdf">http://biorepository.uic.edu/Contact_Us_files/ISBERBestPractices3rdedition.pdf</a> (2011).</li>
<li>NCI Best Practices for Biospecimen Resources. , 2nd ed., Office of Biorepositories and Biospecimen Research. Available from:
 <a target="_blank" href="http://biospecimens.cancer.gov/bestpractices/2011-NCIbestpractices.pdf">http://biospecimens.cancer.gov/bestpractices/2011-NCIbestpractices.pdf</a> (2011).</li>
<li>Ruffell, B., et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+HM+%22Practical+flow+cytometry%22">Practical flow cytometry</a>. , John Wiley & Sons. (2005).</li>
<li>Baker, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+phosphoprotein+as+a+biological+marker+of+tumor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling.</a> Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).</li>
<li>Jacobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+processing+considerations+for+detecting+copy+number+changes+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).</li>
<li>Chung, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+in+tissue+handling+and+processing+that+impact+RNA+obtained+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+procedure+for+protein+extraction+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+for+reverse+phase+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays.</a> Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).</li>
<li>Feldman, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+mRNA+amplification+for+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Advantages of mRNA amplification for microarray analysis.</a> Biotechniques. 33, 906-914 (2002).</li>
<li>Francino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+real-time+PCR+assay+for+diagnosis+and+monitoring+of+canine+leishmaniosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis.</a> Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).</li>
<li>Grunberg-Manago, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Messenger+RNA+stability+and+its+role+in+control+of+gene+expression+in+bacteria+and+phages%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages.</a> Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).</li>
<li>Lesnik, E. A., Freier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+thermodynamic+stability+of+DNA%2C+RNA%2C+and+DNA%3ARNA+hybrid+duplexes%3A+relationship+with+base+composition+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure.</a> Biochemistry. 34, 10807-10815 (1995).</li>
<li>MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays and proteomics.</a> Nat Genet. 32, 526-532 (2002).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

סופו של דבר, שיטות העיבוד חייבים להיות מוכתבות על ידי ההשערה הרצויה וצפויות מבחני טכניים שיש לבצע (איור 1). הסעיף הבא משמש כסקירה לתאר מבחני פוטנציאליים שעלולות להתבצע על סעיפי רקמות כזה. זה בשום פנים וסקירה ממצה, אבל הוא נועד לסייע לשיטות עיבוד מדגם מדריך ובחירה של מבחני במורד הזרם בתיאור טכניקות ורישום נקודות החוזק והחולשה שלהם. Cytometry זרימה מכתים עשויה להתבצע על סעיפי רקמות טריות-גזור, או ש...

מחקר רפואי נהנה מאוד מהמחקר של שני שורות תאים אנושיות ומודלים של בעלי חיים. שורות תאים מאפשרות שליטה טובה יותר של רכיבים במערכת, כמו גם שימוש בתאים מאורגניזם הנכון. עבודה עם תאים אנושיים, ואילו יותר נציג, מציג תמונת מצב פשוטה באופן דרסטי של מנגנונים שעשויות להיות אחראי לבריאות ומחלה, משום ששורות תאים עשויות שלא לשחזר את ההשפעה של תאים אחרים, רכיבי סטרומה, ואיברים אשר עשוי להשפיע 1 תגובות. מצד השני, מודלים של בעלי החיים, אם כי לא לגמרי מדויק בשחזור מחלה אנושית וההטרוגניות גנטית, להציע תובנה נוספת על ידי מתן אפשרות להזנה של מערכות חיות שלמות ברוב הדגמים 2,3. חסרונות בצד, יש לי שתי השיטות היתרונות שלהם והם משלימים. עם זאת, המטרה העיקרית נשארה ללמוד בתאים אנושיים ואיברים, בגוף מלא, מערכת רב-איבר. בהתאם לכך, יש מחקר translational taken צעדים גדולים בקידום המחקר של איברים ורקמות שחולצו מחולים אנושיים, על מנת להבין טוב יותר את מנגנוני מחלה בסיסית. מחקר translational מציע את היתרון של לימוד התוצאה מטיפולים ומחלות בכל הגוף ובתאים מתאימים, ובכך לספק את המיטב משני העולמות בין תא ובעלי חי עבודה 4. מחקר translational הוא גם לא בלי פגמים. דגימות שנקטפו מחולים אנושיים, עם ההסרה מהמארח, חשופות באופן מיידי לאיסכמיה וגורמים חיצוניים אחרים שממנו הם יהיו מוגנים אחרים. זה עלול לגרום לשינויים מולקולריים וגנטיים שנגרם עקב מתח, ולגרום להטיה במחקרים שלאחר מכן. לכן, הרבה מאמץ כבר הכניס לתוך חילוץ ועיבוד רקמות באמצעות שיטות קפדניות לשמירה הטובה ביותר איבר ושלמות תא ללימודים במורד הזרם 5. חשוב לציין, יישומים עתידיים יש לקחת בחשבון בעת ​​בחירה מקרוב שיטות oו עיבוד דגימות אנושיות, כמו שיטות מסוימות עלולות לפגוע במרכיבים תאיים ומסלולי איתות תוך חוסך אחרים. לכל מחקר מעורב רקמות אנושיות, נושאי רגולטורים יש לטפל. לאחר דיווחי Tuskegee ולמונט, היה הולכים וגדל בעובדה שהמחקר ביו-רפואי היה קשור בסיכונים הגלומים לעתים קרובות וכתוצאה מכך דילמות אתיות בלתי נמנעות 6. הצורך בסטנדרטים לאומיים הוכר והממשלה הפדרלית יצרה לוחות סקירה מוסדיים (IRBs) כאמצעי לשמירה על עקרונות הדו&quot;ח בלמונט (כבוד לאנשים, חסד, המשפטים). IRB כל מוסד הוא ועדה של רופאים, חוקרים וחברי קהילה שהם אחראים להגנת משתתפי מחקר. זה דורש כי הסכמה מרצון לקבל מכל משתתפי מחקרים ביו-רפואיים, וכי הסכמה זו תתועד בהסכמה מהדעת FO<html> rm. תהליך ההסכמה מהדעת שמטרתו לספק מידע הולם למשתתף, כך שהחלטה מושכלת עשויה להיות על האם או לא להירשם ללימודים, או להמשיך השתתפות. בהקשר זה, מסמך ההסכמה מהדעת חייב להיות קריאה טובה וצריך להיות כתוב בשפה שיכול להיות מובנת בקלות (רמת קריאת הכיתה ה -6 עד 8 ​​ה) על ידי אוכלוסיית היעד. האפשרות של כפייה או השפעה בלתי הוגנת חייבת להיות ממוזערת, והנושא יש לתת מספיק זמן לשקול השתתפות. המשתתף חייב להיות גם תוכל לממש את זכותם ללבטל את ההסכמה בכל שלב במהלך המחקר ללא קנס. הסכמה מדעת מרצון היא תנאי מוקדם הכרחי להשתתפותו של נושא במחקר והוא גם יעיל 7 באופן חוקי. בהתאם לתקנות להגנה על האדם מכפיף 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html&quot;&gt;http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), יש ליידע משתתפי מחקר של מטרת המחקר, נהלים מעורבים במחקר, חלופות להשתתפות, כל סיכונים הנראה לעין ואי נוחות (כולל פגיעה לא רק פיזית אלא גם נזק פסיכולוגי, חברתי, כלכלי או אפשרי, אי נוחות, או אי נוחות), יתרונות של המחקר לחברה ואולי לאדם, משך זמן הנושא צפוי להשתתף, האדם ליצור קשר לקבלת תשובות לשאלות או במקרה של פגיעה הקשורות למחקר או לשעת חירום, הודעה, כי ההשתתפות היא בהתנדבות והסירוב שלהשתתף לא יגרום לכל השלכות או כל אובדן של הטבות כגון פשרה בטיפול קליני רגיל כי המשתתף זכאי אחר לקבל כתוצאה מ/ אבחנותיו, ובסופו הצהרה בדבר זכותו של הכפופים לסודיות וזכות לסגת מהמחקר בכל עת ללא כל השלכות. דגימות רקמה ממשתתפים שלבטל את ההסכמה במהלך המחקר לא צריכים להיות הפקידה ויש למצות באופן מיידי. ויתור של אחד או יותר אלמנטים של הסכמה מדעת ניתן לקבל מIRB לכמה פרויקטי מחקר שלא יכל כמעט להיעשות ללא שינוי לאלמנטים הנדרשים או ללימודים שבו אלמנטים הנדרשים אינם ישימים. יש לנקוט בזהירות רבה על מנת להבטיח סודיות הנתונים. ביטוח בריאות הטלטלות הדין והחשבון Act (HIPAA) הוא חוק פדרלי שמונע את שימוש באו גילוי &quot;מידע מוגן בריאות&quot; (PHI) ללא הסכמה בכתב מהמשתתפים. אובדן כושר עבודה כוללת אך לא מוגבל למידע המועבר בבריאות או נשמר בכל צורה או בינוני וכולל תחומים שיכולים לשמש לזיהוי 9 בודדים. דרך עבודה זו, אנו שואפים להתוות את הפרוטוקול שיש אחריו במהלך tissuעיבוד דואר - כוללים רכש, ואחסון ומדגישים את החשיבות של ביצוע הנחיות הקפדניות אלה כדי למזער את ההטיות שעלולות לגרום בשל לחצי רקמת נתונה על חילוץ. גם אנחנו נשתדל לספק סקירה קצרה של מבחני או ניתוחים (איור 1) שיכול להתבצע על דגימות כאלה במורד הזרם, כך שקוראים יכולים לעשות שיפוט מוסמך על מה assay (ים) המתאימים ביותר לצרכיהם.

<table><tbody><tr><td>מחטים</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>נירוסטה אזמלים חד פעמיים</td><td>Miltex</td><td>4-410</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות</td><td>קורנינג</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>קלטות ביופסיה</td><td>תרמו פישר</td><td>58931</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה מייצבת RNA</td><td>אמביון</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות אפנדורף</td><td>פניקס</td><td>MAX-815</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 50 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>10% ניטרלי חוצץ פורמלין</td><td>StatLab מוצרים רפואיים</td><td>28600-5</td><td></td></tr><tr><td>מיכלי פורמלין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-032-059</td><td></td></tr><tr><td>פתרון טמפרטורת חיתוך אופטימלי (OCT)</td> <td>סאקורה פינטק</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>רקמה-טק קריומולד</td><td>סאקורה פינטק</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>70&mu; מסנני תאים m</td><td>BD Bioscience</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחות תחתונות עגולות היטב</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת כתמים חיים/מתים</td><td>Life</td><td>Technologies L34957</td><td></td></tr></tbody></table>

עבודה עם רקמות אנושיות לחקר סרטן translational

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

מחקר רפואי לתועלת האדם נפגע מאוד על ידי הצורך ברקמות אנושיות ובנבדקים. עם זאת, עם קבלת הסכמה לדגימות אנושיות, יש לטפל בדגימות יקרות ערך בזהירות המרבית על מנת להבטיח את שלמות האיברים, הרקמות והתאים ברמה הגבוהה ביותר. למרבה הצער, עיבוד רקמות מעצם הגדרתו דורש מיצוי רקמות מהמארח, שינוי שעלול לגרום ללחץ תאי רב ויש לו השלכות משמעותיות על ניתוחים עוקבים. לחצים אלה עלולים לגרום לכך שהדגימה לא תייצג עוד את האתר ממנו היא נלקחה. לכן, יש להקפיד על פרוטוקול קפדני בעת עיבוד דגימות אלו כדי להבטיח ייצוגיות. יש לקחת בחשבון גם את הבדיקות הרצויות על מנת להבטיח שימוש בטכניקה אופטימלית לעיבוד דגימות. להלן פרוטוקול לאחזור רקמות, עיבוד וניתוחים שונים שניתן לבצע על רקמות מעובדות על מנת למקסם את הייצור במורד הזרם מדגימות רקמה מוגבלות.

<html> התוצאות מוצגות להלן מתארות אסטרטגית gating cytometry זרימה לphenotyping חיסוני רחב על גידול מלנומה מעובד. היום של צביעה, דגימת רקמה הייתה מתעכל והומוגני עם אני collagenase וDNase אני דגירה של 60 דקות, על 37 מעלות צלזיוס מתחת 225 סל&quot;ד סיבוב. בעקבות עיכול, השעיה תא הייתה מסוננת דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לחסל פסולת ותאים היו מוכתמים זרימת כותרת הקרינה cytometry נוגדנים לphenotyping תא חיסון. מוצגים להלן (איור 3) הוא אסטרטגית gating וצביעה לסמנים מרובים על O...

מחקר סרטן תרגומי תלוי במיצוי רקמות אנושיות. עבודה רבה הושקעה באופטימיזציה של שיטות מיצוי לניתוח ex vivo. כאן, אנו מתארים שיטות עיבוד רקמות המאפשרות פלט נתונים מקסימלי מדגימות מוגבלות.

עבודה עם רקמות אנושיות לחקר סרטן Translational

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

המטרה הכללית של הליך זה היא למקסם את האיכות והכמות של הנתונים המופקים מדגימות רקמה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום מחקר הסרטן התרגומי, כגון אילו מוטציות קיימות, אילו מסלולים מופעלים, ואילו תתי-סוגים של תאי מערכת החיסון חודרים לגידולים אנושיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להפיק כמות גדולה של נתונים מכריתה כירורגית בודדת של רקמה אנושית.אחד השלבים הקריטיים ביותר לפני עיבוד הדגימה הוא הבטחת איכות הדגימה ותיקוף נוכחותו של גידול חי באמצעות הערכה פתולוגית כפי שמתואר בטקסט הפרוטוקול. כל המידע הרלוונטי עבור הדגימה או הרקמה, כגון שם המטופל, מספר, טיפול ותאריך הניתוח, צריך להיות נגיש בקלות במאגר הרקמות המוסדי. דגימות רקמה טריות צריכות להישמר תמיד על קרח רטוב ולהיעבד במהירות האפשרית כדי להגביל שינויים הנגרמים מהוצאת דגימת הרקמה מסביבתה הטבעית. יש לעבד בנפרד דגימות רקמה של גידול ודגימות רקמה נורמלית תואמות.כדי למנוע זיהום צולב, הכינו צלחת פטרי סטרילית, סכין מנתחים (scalpel), וכן מחט או פינצטה לעיבוד הרקמה. כדי לקצר את זמן עיבוד הדגימה, סדרו מראש את כל הפריטים הדרושים כפי שמוצג כאן. הניחו את דגימת הרקמה בצלחת הפטרי הפתוחה בצורה שטוחה כנגד פני השטח.בחנו את הדגימה מכל הזוויות כדי להבין טוב יותר את המבנה והמימדים שלה. 고בעו את הדגימה לתחתית הצלחת באמצעות המחט והמשיכו לחצוק את הרקמה לאורח הציר הגדול והמייצג ביותר שלה. גזרו חתיכה קטנה של רקמה והניחו אותה בתוך פרועת מיקרו-צנטריפוגה סטרילית בנפח 1.5 milliliter המכילה מיליליטר אחד של תמיסה לייצוב RNA.הנח דגימה זו על קרח למשך שאר התהליך ואחסן אותה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. הנח קסאת ביופסיה פתוחה ומסומנת מראש על מכסה של צלחת פטרי לתרבית. חתוך פרוסת רקמה בעובי של לא יותר משלושה עד חמישה מילימטרים והעבר אותה לקסאת.הנח את הקסטה בפורמלין ניטרלי במעטפת בופר בריכוז 10% למשך 72 שעות לפחות. בטמפרטורת החדר, גזור חתיכה של רקמה והנח אותה בתבנית רקמה. כסה את נתח הרקמה בתרכובת OCT (optimal cutting temperature compound) והקפא אותו מיד בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד למועד הפריסה בקריוסטט.גזרו פיסה אחת או מספר פיסות של רקמה והעבירו אותן למבחנה של 50 milliliter המכילה max buffer. ניתן להשתמש ברקמות באופן טרי או לאחסנן למשך לילה בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius לצורך אנליזת flow cytometry. גזרו את שאר הרקמה לפיסות שגודלן אינו עולה על 0.5 millimeters על 0.5 millimeters והעבירו אותן למבחנות קריוגניות.הקפיאו מיד את הרקמות בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תמיסת עיכול עם DM EMD NS one וקולגנאז. הניחו גידול טרי או כזה שאוחסן למשך לילה ב-max buffer במכסה של צלחת פטרי והטביעו אותו בתמיסת העיכול.הדביקו את הגידול לתחתית הכלי באמצעות מחט וחתכו מהחוץ אל המרכז בעזרת סכין מנתחים עד שהגידול יקבל מרקם דבקי. העבירו את תערובת הגידול לשפופרת של 50 milliliter ואטמו את השפופרת כדי למנוע דליפות. העבירו את השפופרת לאינקובטור וערבבו במהירות של 225 RPM בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת.לאחר שעה, סננו את תרחיף תאי הגידול דרך מסננת תאים של 70 µm וסובבו את תרחיף התאים בצנטריפוגה במהירות של 250 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות. השעיקו מחדש את משקע התאים ב-1 mL של FACS buffer. לאחר ספירת התאים באמצעות המוציטומטר, השעיקו את התאים בריכוז של 1×10⁷ תאים למל'.העבירו 100 µL או 10⁶ תאים לכל באר של פלטה בעלת תחתית עגולה עם 96 בארות. הוסיפו 200 µL של תמיסת צביעת חיות לכל באר, ערבבו והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C בחשיכה. לאחר 30 דקות, סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-250 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות.שאבו את העילאי. הוסיפו את תערובת הנוגדנים בריכוז התוחם המומלץ לאנטיגנים של פני השטח ב-200 µL של תמיסת fax. הדגרו את התאים בטמפרטורה של 4 °C בחשיכה למשך 30 דקות.סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-250 Gs ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות ושאבו את העלייה, שטפו עם 200 µL של תמיסת FACS וסבבו את התאים שוב בצנטריפוגה, שאבו את העלייה ותלו את התאים מחדש ב-200 µL של תמיסת FACS. התאים מוכנים כעת לניתוח באמצעות ציטומטריה של זרימה. תוצאות מייצגות אלו מציגות את אסטרטגיית ה-gating בציטומטריה של זרימה עבור פנוטיפוינג חיסוני רחב של דגימות גידולים של מלנומה שעובדו כפי שהודגם ואוחסנו למשך לילה בתמיסת FACS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, אשר מראות תמותה מוגבלת ביותר.בנוסף, מוצג תהליך עיבוד הרקמה. לאחר השליטה בטכניקה, היא מאפשרת פנוטיפיות רחבה רב-צבעונית של תתי-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון במלנומה, כגון תאי B, תאי CD4 T, תאי CD8 T, תאי gamma delta T, תאי NK, תאים דנדריטיים, מקרופאגים, תאי מאסט, בזופילים, נויטרופילים ואאוזינופילים. ניתן להשלים טכניקה זו בארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי.

working-with-human-tissues-for-translational-cancer-research

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

לטווח ארוך של תרבות האדם סרטן השד דוגמאות וניתוח שלהם באמצעות טומוגרפיה הקרנה אופטית

שיטות ליצירת רקמות גידול 3D אדם כמערכות בדיקה מתוארות. טכנולוגיות אלה מבוססות על ביולוגי vascularized פיגום decellularized (BioVaSc), תאים אנושיים יסודיים ושורת תאים סרטניים, אשר יכול להיות מתורבת תחת סטטי, כמו גם בתנאים דינאמיים בזרימת bioreactor.

הנדסת רקמות של 3D אדם<em&gt; במבחנה</emמערכת מבחן גידול&gt;

ניתוחים מעמיקים של פרוטאומים של תאים סרטניים מקלים על זיהוי מטרות תרופות חדשות וסמנים ביולוגיים אבחוניים. אנו מתארים זרימת עבודה ניסויית לניתוח כמותי של פרוטאומים (פוספו-) בתת-אוכלוסיות של תאים סרטניים שמקורם בגידולים נוזליים ומוצקים. זה מושג על ידי שילוב של אסטרטגיות העשרה תאיות עם ספקטרומטריית מסה כמותית מבוססת Super-SILAC.

Mass כמותי spectrometric פרופיל של Proteomes סרטן התאים נגזרים מנוזלים וגידולים מוצקים

פרוטוקולים מתוארים ללימוד הגירה של תאי סרטן השד, התפשטות והתנחלות במערכת מודל explant רקמת עצם אנושית.

שיטות לExplants רקמות Culturing עצם ירך האדם ללמוד התיישבות תאי סרטן השד גרורתי של הנישה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנצל מונחה אולטרה סאונד הזרקה של נוירובלסטומה (NB) ותאים של יואינג סרקומה (ES) (שהוקמה שורות תאים ותאים סרטניים נגזר החולה) באתרים הרלוונטיים ביולוגית ליצירת במודלים פרה אמין עבור סרטן מחקר.

ניצול של אולטרסאונד מודרכת מכוון רקמות השרשה הסלולר להקמתה של גידול גרורתי רלוונטי מבחינה ביולוגית Xenografts

ביובנקים הם משאבים חיוניים למחקר ביו-רפואי והיחידה לרפואה תרגומית ודיגיטלית במכון האירופי לאונקולוגיה היא מודל בתחום זה. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של נהלי ההפעלה הסטנדרטיים של ביו-בנקים לניהול סוגים שונים של דגימות ביולוגיות אנושיות.

ביובנק לרפואה תרגומית: נהלי הפעלה סטנדרטיים לניהול דגימות אופטימלי

פרוטוקול זה מתאר את הדור של עכברי מערכת החיסון האנושית (HIS) עבור מחקרים אימונו-אונקולוגיים. הוראות ושיקולים בשימוש במודל זה לבדיקת אימונותרפיה אנושית על גידולים אנושיים המושתלים במודל זה מוצגים בדגש על אפיון התגובה של מערכת החיסון האנושית לגידול.

בדיקת אימונותרפיה לסרטן במודל עכבר אנושי הנושא גידולים אנושיים

אורגנואידים סרטניים חוללו מהפכה בחקר הסרטן ובגישה לרפואה מותאמת אישית. הם מייצגים מודל גידול רלוונטי מבחינה קלינית המאפשר לחוקרים להישאר צעד אחד לפני הגידול במרפאה. פרוטוקול זה מבסס אורגנואידים סרטניים מדגימות טריות של רקמת גידול בלבלב וקסנוגרפטים שמקורם באדנוקרצינומה של הלבלב.

הקמת אורגנואידים ופיברובלסטים מגידולים שמקורם בסרטן הלבלב מרקמה טרייה

פרוטוקול זה מציג מודל גידול-על-שבב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לביצוע מחקר סרטן אנושי בסיסי ותרגומי בתפוקה גבוהה, קידום בדיקות סקר לתרופות, מידול מחלות וגישות רפואה מותאמת אישית עם תיאור של נהלי העמסה, תחזוקה והערכה.

הקמת מודל פיזיולוגי למיקרו-גידולים וסקולריים אנושיים לחקר הסרטן

פרוטוקול זה מתאר את ההליך לניתוק מהיר של דגימות גידולים אנושיים ועכברים לצורך ריצוף RNA חד-תאי.

דיסוציאציה של דגימות רקמת גידול בבני אדם ובעכברים לצורך ריצוף RNA חד-תאי

שיטה ייחודית לכריתה כירורגית של גידולי קרצינומה של תאי קשקש אוראליים שנוצרו בחלל הפה מוצגת כאן.

מודל כריתת גידול רלוונטי לתרגום עבור מודלים פרה-קליניים של עכברים של קרצינומה של תאי קשקש בפה

למד שיטות עיבוד רקמות אנושיות למחקר סרטן תרגומי. הטכניקות ממקסמות איכות וכמות נתונים מדגימות מוגבלות, ומאפשרות זיהוי מוטציות ותתי-סוגי תאי חיסון.

עבודה עם רקמות אנושיות לחקר סרטן Translational

גלה סרטונים נוספים