דוגמנות אנצפלופתיה של פגות שימוש בהריון היפוקסיה-איסכמיה עם lipopolysaccharide Intra-השפיר בחולדות
20 בנובמבר 2015
אנצפלופתיה של פגות מקיפה את ההפרעות במערכת העצבים המרכזית הקשורות לפגיעה מלידה מוקדמת. דוח זה מתאר מודל חולדה רלוונטי מבחינה קלינית של איסכמיה מערכתית חולפת ברחם ומתן ליפופוליסכריד תוך מי שפיר (LPS) המחקה כוריואמניוניטיס, ואת ההשפעה הקשורה של גירויים זיהומיים ותת-עירוי שליה על התפתחות מערכת העצבים המרכזית.
המטרה הכוללת של הליך כירורגי זה היא לספק מודל ניתן לשחזור של פגיעה מוחית הקשורה ללידה מוקדמת במיוחד, באמצעות אינדוקציה של היפוקסיה מערכתית חולפת, איסכמיה ודלקת תוך מי שפיר לסיכום, אי ספיקת שליה ודלקת כוריו-מי שפיר בחולדות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי הפתוגנזה של פגיעה מוחית סביב הלידה הנובעות מתהליכים תוך רחמיים המאפשרים פיתוח אסטרטגיות טיפוליות מכוונות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא גורמת לפגיעה מערכתית המחקה עלבונות תוך רחמיים הן מזיהום והן מהיפוקסיה, איסכמיה המייצרת ליקויים נוירולוגיים תפקודיים בחולדה הבוגרת.
מודל זה מתאים במיוחד לניתוח מנגנוני הפגיעה הקשורים לדלקת. מכיוון שניתן לבדוק את ההיפוקסיה, האיסכמיה והגירויים הזיהומיים בנפרד או כפציעה משולבת, תדגים את ההליך לינדזי צ'אן, טכנאית מהמעבדה שלנו. לפני תחילת ההליך, השתמש בקוצץ בעלי חיים קטנים כדי להסיר את כל השיער מאזור הבטן התחתונה של יום עוברי.
18 חולדה בהריון בתבנית מלבנית, מקפידה לא לחתוך את הפטמות או ליצור פריחה בסכין גילוח. לאחר מכן, בעזרת צמר גפן סטרילי, שפשפו את העור בשלוש מריחות לסירוגין של יוד פובידון ואתנול 70%. כאשר העור יבש, אשר את עומק ההרדמה המתאים על ידי הבוהן, צבט ועטוף את החיה.
לאחר מכן השתמש באזמל כדי לבצע חתך בקו האמצע של שלושה סנטימטרים בבטן החיה, ואחריו דיסקציה קהה של שכבת העור מהפאשיה הבטנית בעזרת מספריים. שימוש במלקחיים ומספריים כירורגיים. הרם את שכבת הפאשיה הבטנית ובצע חתך דרך המרפק הליניארי של כלי הדם.
כאשר חלל הצפק נחשף, הניחו גזה כירורגית על החלק החיצוני של החתך והרטיבו את הגזה במי מלח סטריליים. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים קהים ולחץ חיצוני על הבטן, הסר בעדינות את קרני הרחם מחלל הצפק וסדר את הקרניים על הגזה הרטובה. הקפידו להימנע מהסתבכות ומגע עם המעיים, השתמשו רק ברקמת השריר בין שקי מי השפיר הבודדים כדי לסדר את העוברים.
לאחר מכן באמצעות דיסקציה קהה, חשוף ובודד את ארבעת עורקי הרחם. הקפדה לא לפגוע בכלי הדם האימהיים כאשר העורקים מבודדים. הנח קליפ מפרצת חולדה בגודל 30 על כל כלי לפני מריחת הקליפים, חשוב לוודא שכל הרקמה שמסביב נקייה לחלוטין.
בעת הנחת הקליפים, אבטח אותם עם המלקחיים הבוטים ולאחר מכן הנח אותם במקביל. התבוננות בהפסקת הדופק היא קריטית כדי להבטיח איסכמיה היפוקסיה מלאה כאשר כל הקליפים הוצבו. אשר את הפסקת הפולסים הפרוקסימליים והדיסטליים ואת התכהות כלי הרחם, כולל בשליה הבודדת.
לאחר מכן מכסים את כל השדה הניתוחי בגזה ומשקים את הרקמה במי מלח סטריליים. כל 10 דקות למשך שעה לאחר 60 דקות, הסר את הגזה והשקה שוב את השדה. כאשר קרני הרחם וכלי הדם לחים כראוי, השתמש במלקחיים כדי להסיר בעדינות כל קליפ מפרצת, הקפד לא לגרום לטראומה לכלי הדם ולשמור על שלמות הרקמה.
ואז להשקות היטב את הקרניים והשדה. פעם אחרונה, תוך הקפדה על הסרת חוטי גזה תועים משקי מי השפיר. כדי לטפל בעוברים עם LPS, השתמש במלקחיים קהים כדי לייצב ולסובב כל שק מי שפיר כך שהבסיס של כל שק מי שפיר בודד יהיה גלוי.
לאחר מכן טען מזרק אינסולין דק במיוחד של 0.3 מיליליטר עם מחט מחוברת של שמונה מילימטר 31 עם תמיסת LPS והזריק 100 מיקרוליטר מהתמיסה ממש לפני כל לוחית שליה. עם הסרת המחט, הפעל לחץ ישיר על שק מי השפיר כדי לעצור כל דליפת נוזלים. החדרת מחט עדינה במיוחד בגודל 31 בבסיס שק מי השפיר היא קריטית לאספקת LPS תקינה מבלי לאפשר למי שפיר לברוח.
לאחר השקיית קרני הרחם שלוש פעמים במי מלח סטריליים, השתמש במלקחיים כדי להחזיר את הקרניים לחלל הצפק. לאחר מכן השתמש בתפר משי 3 oh רץ כדי להעריך מחדש את קצוות שכבת השרירים מבלי לתפור לתוך שק או דרכו, ולאחר מכן סגירת העור עם תפר משי נוסף 3.0. לאחר מכן, השתמש במחט בגודל 26 לתת-עורית.
יש להזריק מיליליטר אחד של 0.125% בופיבקאין סביב קצוות הפצע. יש לייבש את החולדה במגבת לפי הצורך, להזריק 0.1 מיליגרם לק"ג בופרנורפין בעורף. הניחו את בעל החיים בכלוב ביתי נקי עם ניטור עד להחלמה מלאה.
לאחר איסכמיה היפוקסיה מערכתית חולפת ומתן LPS ביום העוברי 18, כפי שהוכח זה עתה, צביעת het ו-eosin מגלה חריגות היסטופתולוגיות משמעותיות הן בשליה והן במוח. ואכן, שליה שנבדקה בימים העובריים 19 ו-21 פולטת באופן גס עם מיקרו דימום ונמק לאורך הדצידואה והמבוך. נצפתה גם חדירה דלקתית משמעותית וכלי דם מוגברים.
מוחות נוספים שנבדקו ביום השני לאחר הלידה מגלים מגליה חדרית, כמו גם אובדן נוירונים של חומר לבן ותת-צלחת בהשוואה להיפוקסיה מערכתית חולפת, איסכמיה ו-LPS גם הפחיתו משמעותית את הביטוי של אשלגן כלורי קוטרנספורטר שני חלבון, קוטרנספורטר כלוריד מרכזי להתפתחות עיכוב GABAergic בקליפת המוח ביום 15 לאחר הלידה, מה שעולה בקנה אחד עם הוויסות ההתפתחותי הלקוי שנצפה במהלך התקופה הקריטית שלאחר הלידה של הבשלת המעגל. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לך הבנה מוצקה כיצד לבצע ניתוח זה בחולדות בהריון וכיצד לגרום לאיסכמיה היפוקסיה חולפת לפני הלידה באמצעות חסימת עורק הרחם עם דלקת ברחם באמצעות הזרקה תוך מי שפיר של תמיסת ליפופוליסכריד. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 90 דקות אם היא מבוצעת כראוי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג מודל בחולדות המדמה פגיעה מוחית הקשורה ללידה מוקדמת ביותר, באמצעות היפוקסיה-איסכמיה סיסטמית זמנית ברחם ודלקת בתוך מי השפיר. מטרת המודל היא להסביר את המנגנוים של פגיעה מוחית פרינטלית הקשורה לזיהום ולאי-ספיקת שליה.
רכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- רפואה פרינטלית
רקע
- אנצפלופתיה של פגות כוללת הפרעות במערכת העצבים המרכזית (CNS) הנובעות מלידה מוקדמת.
- כוריואמניוניטיס ותת-פרפוזיה של השיליה הם גורמים משמעותיים בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית.
- הבנת גורמים אלו חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.
- תהליכים תוך-רחמיים עלולים להוביל לליקויים נוירולוגיים תפקודיים.
מטרת המחקר
- ליצירת מודל הניתן לשחזור של פגיעה מוחית בחולדות בטרם עת קיצוניות.
- לבדיקת ההשפעות של פגיעה סיסטמית המדמה פגיעות תוך-רחמיות.
- לחקר הפתוגנזה של פגיעה מוחית פרינטלית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השראה של היפוקסיה מערכתית זמנית ברחם (in utero).
- השראה של איסכמיה ודלקת תוך-מינית.
- שימוש במודל חולדה לבדיקת ההשפעות של פגיעות משולבות.
- הערכה של גרעונות נוירולוגיים תפקודיים בחולדות בוגרות.
תוצאות עיקריות
- המודל מחקה בהצלחה את ההשפעות של זיהום והיפוקסיה-איסכמיה.
- הודגמה היכולת לבחון השפעות של פגיעות בודדות ומשולבות.
- סופקו תובנות לגבי מנגנוני הפגיעה הקשורים לדלקת.
- סייע לפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות.
מסקנות
- מודל זה בעל ערך לחקר מנגנוני פגיעה מוחית פרינטלית.
- הוא יכול לסייע בהבנת ההשפעה של תנאים תוך-רחמיים על התפתחות ה-CNS.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש במודל זה כדי לבחון התערבויות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
מודל חולדה טרום-לידתי זה נותן מענה לפער קריטי במחקרי אנצפלופתיה של פגות, על ידי שילוב של היפוקסיה-איסכמיה מערכתית חולפת עם דלקת תוך-מי שפיר (intra-amniotic inflammation) כדי לדמות תת-בישורי של השילייה וכוריואמניוניטיס בבני אדם. הוא מאפשר ניתוח מכניסטי של סוגי פגיעות שונים – איסכמיים לעומת זיהומיים – ובכך תומך בתיקוף יעדים ובגילוי סמנים ביולוגיים להגנה עצבית פרינטלית. יכולתו של המודל להוביל לגירעונות תפקודיים בחולדות בוגרות המשקפים פנוטיפים קליניים מגבירה את הביטחון החזוי עבור סריקת טיפולים פרה-קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי בידוד של מסלולי היפוקסיה-איסכמיה ומסלולי דלקת במודל של פגיעה משולבת.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות נזק בר-כימות למערכת העצבים המרכזית (CNS), כולל אובדן של חומר לבן, נוירוני תת-שכבה (subplate neurons) ואוליגודנדרוציטים.
- ערך ניבוי: מסייע במיון פורטפוליו באמצעות מידול של פתולוגיות נתיב מתכנסות הנצפות בתינוקות שנולדו פגים מאוד.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מדדים נוירו-אנטומיים ופונקציונליים הרלוונטיים למחלה (הפרעות בהליכה, מורפולוגיה של חדרי המוח, ביטוי חסר של KCC2) לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מספק תוצאות שחזירות וקוונטיביליות במדרי המשלייה והעובר כדי לאפשר סריקת תרכובות ברמת דיוק גבוהה.
- תועלת הפלטפורמה: מאפשרת בדיקה רצפית של פגיעות בודדות או משולבות להפחתת העמימות המכניסטית בזיהוי מובילים (leads).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: משחזר מספר קריטריונים של EoP— אובדן נוירונלי/אקסונלי, דגנרציה של הסאבפלט (subplate) וליקויי תפקוד מתמשכים— ובכך מחזק את התקפיות התרגומית.
- ערך תפעולי: מאפשר רציפות מהפגיעה prenatal ועד לפנוטיפ postnatal, ובכך תומך במעקב ארוך טווח אחר ביומרקרים.
- מזעור סיכונים: מספק מידע לקבלת החלטות על קידום מותאם סיכון, על ידי מידול של שילוב בין אי-ספיקה של השליה לגורמים דלקתיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
המודל משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות של מטרות, דרך סריקה פנוטיפית ועד לתיקוף פרה-קליני, ובמיוחד עבור חומרים נוירופרוטקטיביים המכוונים למסלולים דלקתיים או היפוקסיים-איסכמיים.
- ביולוגיה גילויית: תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות להפרדה של תהליכי דלקת מסוגי פגיעה שונים (איסכמיים לעומת זיהומיים) ברחם.
- סריקה: מספקת תוצרי היסטופתולוגיה והתנהגות כמותיים וסטנדרטיים, החיוניים לשחזור הבדיקה ולהערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה של חומרת הפגיעה באמצעות היסטופתולוגיה של השילייה, היסטולוגיה של המוח העוברי ובדיקות תפקוד עצבי פוסטנטאליות.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה one עם הפתופיזיולוגיה הקלינית של EoP, ובכך תומכת בסנכרון של סמנים ביולוגיים וברציפות מהשלב הפרה-קלניקי לשלב הקליני.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר להערכת מונו-תרפיה והתערבויות משולבות על פני מודלי פגיעה שונים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בפגיעות מוחיות פרינטאליות באמצעות מידול של פגיעות סינרגטיות של השיליה והעובר.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות תזמון ניתוחי סטנדרטי (E18), מיקום תסמיכים ופרוטוקולי מינון של LPS.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go באמצעות מידול של אתיולוגיות רב-גורמיות המניעות כשל קליני בשלבים מאוחרים בנוירופרוטקציה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מבוסס סיכון, בהתבסס על יעילות במודלים של פגיעה איסכמית, דלקתית או משולבת.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה של מכרסמים, בידוד עורקי הרחם ומניפולציה של שק השערים.
- תלוי בשימוש במכשור מדויק: תליבכי מנבכי מפתעות (aneurysm clips) בכייח 30, מזרקי אינסולין בכייח 31 ושמירה על שדה סטרילי.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית בין צוותי הניתוח, ההיסטולוגיה והניתוח ההתנהגותי לצורך פנוטיפויזציה עקבית.
- התאמה למודלים אחרים דורשת תיקוף של דינמיקת הפרפוזיה השילייתית ותגובת המינון הדלקתית.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות כירורגית במיקום התליבכים ובדיפוזיית LPS, אשר יש לשלוט בהן באמצעות אימות הפסקת הדופק ושטיפה במי מלח.
