Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב
30 בספטמבר 2015
פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, ניסוי לתפעל וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. תרבויות explant הן שימושיות כאשר שיעור הצלחה גבוהה, יעילות ושחזור יש צורך לבדוק את ההשפעות של פלסמידים לelectroporation ו / או חומרים מגיב, כלומר, מעכבים האנזימטית.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבצע דיסקציה ניסיונית, מניפולציה וגידול של שתלי רשתית שלמים מעוברים של תרנגולת. זאת על ידי איסוף ראשוני של שתי העיניים מעובר של תרנגולת והנחתן בצלחת פטרי. השלב השני הוא הסרת הסקלרה והאפיתל הפיגמנטי באמצעות פינצטה עדינה.
בשלב הבא, גלשן הרשתina השלם עובר אלקטרופורציה של DNA פלסמי באמצעות אלקטרודות מעגליות שטוחות. השלב הסופי הוא דגירה של גלשן הרשתina במצע תרבית, בתוך פלטה בעלת 24 בארות בתוך אינקובטור.
בסופו של דבר, השתבחים הרשתיתים השלמים מקובעים, נחתכים בשיטת קריו-סקשן (cryo sectioning) וננותחים באמצעות מיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה כדי להדגים את נוירוני הרשתית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניתוחים חשמליים in OVO, הוא שהיא מהירה, קלה לביצוע ומבטיחה תוצאות הדירות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום התפתחות מערכת העצבים המרכזית, כגון כיצד מושפעת הנוירוגנזה מרכיבים כימיים ספציפיים, כגון מעכבי אנזימים או תוצרי גנים המכוונים למחזור התא לאחר הדגירה.
הניחו ביצים בגיל העוברי הרצוי בתוך מCב המערכת לזרימה למינרית, ונגבו את קליפות הביצים ב-70% ethanol כדי למנוע זיהום של העובר. הקישו בחוזקה את צד הביצה על משטח קשיח כדי לסדוק אותה, ולאחר מכן העבירו את התכולה לצלחת פטרי של 100 millimeter. השתמשו בכף קטנה כדי להעביר את העובר לצלחת פטרי של 35 millimeter המכילה PBS שחומם מראש ל-37 degrees Celsius כדי למנוע התייבשות של הרקמה.
בשלב הבא, בצעו דה-קפיטציה לעובר והניחו את צלחת הפטרי בנפח 35 מילימטר המכילה את רקמת העובר תחת מיקרוסקופ סטריאו בינוקולרי בתוך מבתר זרימה למינרית. השתמשו בפינצטה עדינה כדי לבצע חתך דרך הפה, ונטרלית לעין. החל מנקודת החתך, קרעו את הרקמה המקיפה את העין כולה.
לאחר מכן, צבטו את העצב האופטי והוציאו את העין השלמה מחלול העין. אספו את שתי העיניים, השמאלית והימנית, מאותו עובר לשימוש כעין הביקורת או כעין המטופלת. השתמשו בכף קטנה כדי להעביר את העיניים לצנצנת פטרי חדשה בקוטר 35 מילימטר המכילה PBS שחומם מראש, בעזרת פינצטה עדינה.
הסר את כל הרקמה שסביב העין, כולל את ה-scleral on laga. לאחר מכן, בצע חתך קטן באפיתל הפיגמנט בחלק הגבי (dorsal) של העין, תוך הקפדה לא לפגוע ברשתית העצבית. לאחר מכן, קרע בעדינות את אפיתל הפיגמנט החל ממקום החתך.
השאירו את העדשה ואת הרשתית כולה מחוברות לגוף הזגוגית. הסירו את אפיתל הפיגמנט, תוך נקיטת זהירות לאורך הגוף הריסני מסביב לאישון באזור הקדמי של העין, ולאורך חריץ הכורויה, שכן קשה להסירו מאזורים אלו. הפעילו את המכשיר החשמלי והגדירו את המתח ל-15 volts עבור רשתית בשלב 20 עד 25 (hamburger and Hamilton), או ל-20 volts עבור רשתית בשלב 26 עד 27.
בשלב הבא, הגדירו את חזרות הפולס לחמישה פולסים של 50 milliseconds, כאשר אורך הפולס הוא במרווחים של שניה אחת. השתמשו במחולל פולסים שניתן לשלוט בו באמצעות דוושה על הרצפה, שכן שני ידיים יידרשו כדי להחזיק את האלקטרודות במקומן. חברו שתי אלקטרודות פלטינה בצורת מחתה (paddle) שהוכנו בהתאמה לשקע הפלט במחולל הפולסים.
האלקטורודות המוצגות כאן יוצרו מלוחות פלטינה בעובי 0.1 מילימטר, וחוט החיבור בעובי 0.8 מילימטר היה מבודד. בעזרת צינורית פלסטיק, העבירו בזהירות את כל השתל הרשתית לכלי קיבול באמצעות פסטור-פיפט פוליאתילן שקצתו נגזרה. הימנעו משימוש בטיפים של פיפט, מכיוון שהרשתית נוטה להיצמד לפלסטיק ולהיקרע.
בשלב הבא, השתמשו בפיפט של 100 מיקרוליטר כדי להסיר בעדינות את כל ה-PBS שסביב נגזרת הרשתית. היזהרו לא לגעת ברשתית כדי למנוע את קריעתה. הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת הפלסמיד המדוללת ל-QVE וודאו שכל נגזרת הרשתית מכוסה בתמיסה.
דחפו בעדינות למטה את רשתית העין (retinal explan) בעזרת פינצטה אם היא צפה למעלה. השתמשו באלקטרודות פינצטה כדי למקם את העדשה כך שתפנה לאחד מצדי ה-vete, והפנו את העצב האופטי לתחתית ה-vete. לאחר מכן, מקמו את האלקטרודה החיובית לפני העדשה ואת האלקטרודה השלילית מאחורי הרשתית, ללא מגע ברקמה.
הפעילו את הזרם על ידי לחיצה על דוושת הרגל ובדקו אם נוצרו בועות באלקטרודות, המעידות על פריקה מוצלחת. השתמשו בפיפט של 100 µL כדי להוציא את כל תערובת הפלסמיד מה-qve מבלי לפגוע ברשתית. ניתן להשתמש בתערובת הפלסמיד שוב בין שלושה לחמישה פעמים לאחר הוצאת הפלסמיד.
מלאו את ה-vete ב-PBS שחומם מראש. השתמשו בפינצטה כדי להסיר בעדינות את נתח הרשתית (retinal explan) מדופן ה-vete. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה עם קצה פוליאתילן כדי להעביר את נתח הרשתית השלם אל פלטה בעלת 24 בארות המכילה מיליליטר אחד של מצע גידול שחומם מראש.
דגרו רק דגימה אחת של רשתית (retinal explan) בכל באר. דגרו את דגימת הרשתית בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 על שייקר מסובב במהירות קבועה של 50 RPM. הסיבוב מבטיח חשיפה מקסימלית למדיום ומונע הידבקות של הרשתית לתחתית פלטת ה-24 באר.
לאחר 24 שעות של תרבית, תאים חיוביים ל-GFP נראו בחלק גדול מהרשתית השלמה, שכן האלקטרופורציה הובילה לספיגת הפלסמיד והבעת הגן המדווח בשטח רשתית נרחב. לאחר ביצוע חיתוכים, ניתן היה לזהות בקלות תאים בודדים חיוביים ל-GFP לאורך הציר הבסיסלי של ה-ACO ברשתית. ניתן לתרבת את כל דגימת הרשתית למשך כ-24 שעות נוספות.
זמני דגירה עלולים להוביל לעיכוב התפתחותי, למלפורמציות מורפולוגיות, לאפופטוזה ובסופו של דבר להתפרקות הרשתית. חתך מתוך רשתית שלמה שגודלה במשתבץ למשך 24 שעות נצבע בשיטת אימונו-היסטוכימיה עבור phospho histone three, המופיע כאן בערוץ האדום; phospho histone three מסמן תאים בשלב G2/M מאוחר. תאים חיוביים ל-pH three נמצאו בצד האפיקלי של הרשתית, ממצא העולה בקנה אחד עם התפתחות רשתית תקינה.
כפי שמוצג כאן, ניתן לחסום התפתחות זו על ידי הוספת מעכב CDK1/2; דגירה עם המעכב למשך ארבע שעות לפני הדימיג' הפחיתה באופן משמעותי את מספר תאי ה-pH3 החיוביים ברשתית לאחר התפתחותה. טכניקה זו שימשה בהצלחה לחקר ביטוי גנים מדווח מפלסמיד DNA חדש ולהטיפול בנתחים של רשתית (retinal explants) עם ריאגנטים כימיים, כולל רגולטורים של מסלול נזקי ה-DNA ומחזור התא. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אלקטרופורציה in ovo כדי לאשש את התוצאות באופן נוסף.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה לדיסקציה, מניפולציה ניסויית וגידול של תרביות רשתית (retinal explants) שלמות מעוברים של תרנגולות. ההליך כולל איסוף של העיניים, הסרה של הלובנה (sclera) והאפיתל הפיגמנטי, ביצוע אלקטרופורציה של DNA פלסמי, ודגירה של הרקמות בתרבית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי העצב
- ביולוגיה התפתחותית
- טכניקות לתרבית תאים
רקע
- שתלים רשתיתיים הם בעלי ערך רב לחקר התפתחות הרשתית.
- אלקטרופורציה היא טכניקה המשמשת להחדרת DNA לתאים.
- עוברי תרנגולת נמצאים בשימוש נרחב במחקרי התפתחות.
- שיעורי הצלחה גבוהים ויכולת שחזור הן קריטיים לתקינות הניסוי.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה אמינה לגידול של נתחים (explants) רשתית.
- בחינת השפעותיהם של פלסמידים וריאגנטים על רקמות הרשתית.
- העמקת ההבנה של הביולוגיה של הרשתית באמצעות מניפולציה ניסויית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ה disection של עיניו של עוברי עוף.
- הסרה של הסקלרה (קשתית העין) ואפיתל הפיגמנט.
- אלקטורפורציה של DNA פלסמי באמצעות אלקטרודות מעגליות שטוחות.
- אינקובציה של השתולי רשתית (retinal explants) במצע תרבית.
תוצאות עיקריות
- גידול מוצלח של השתלות רשתית שלמות.
- אלקטרופורציה יעילה של DNA פלסמידי.
- שחזוריות גבוהה של תוצאות הניסוי.
- פוטנציאל לבדיקה של ריאגנטים שונים על רקמות רשתית.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה חסונה לתרבית של נתחי רשתית.
- אלקטרפורציה היא טכניקה יעילה להחדרת גנים במחקרי רשתית.
- גישה זו עשויה לסייע למחקרים נוספים בביולוגיה של הרשתית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מניפולציה מבוקרת ex vivo של השתלות רשתית שלמות מעוברים של תרנגולות מאפשרת בחינה מדויקת של מסלולים נוירו-התפתחותיים הרלוונטיים לגילויים במערכת העצבים המרכזית. גישה זו נותנת מענה לאתגרים מרכזיים בהגשת ריאגנטים, הדירות ותקינה ניסיונית, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים. שיעור ההצלחה הגבוה והיכולת להרחבה (scalability) של השיטה הופכים אותה לנכס בעל ערך למיון תיקי פיתוח ולהפחתת סיכונים מכניסטיים במחקר ופיתוח (R&D) המתמקד בנוירוביולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של תפקוד גנים ושל מודולטורים כימיים בהקשר מבוקר של רקמה עצבית.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד השפעותיהם של ריאגנטים ספציפיים על נוירוגנזה ובקרה על מחזור התא.
- מסייע בתיקוף תפקודי של יעדים באמצעות הערכה כמותית של ביטוי סממנים עצביים.
- משפר את רמת הביטחון בתוצאות החזויות על ידי מזעור השונות הנובעת מהגשה in vivo ומשיעורי הישרדות של עוברים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת פלטפורמה הניתנת לשחזור להערכת יעילות העברה של גנים והשפעות של ריאגנטים כימיים.
- מנורמלת תנאי חשיפה, ובכך תומכת בפיתוח בדיקות עם פלטים כמותיים וניתנים להרחבה.
- מאפשרת איטרציה מהירה ואופטימיזציה של ריכוזי ריאגנטים עבור תהליכי סריקה המשכיים.
- מכינה מערכות אקספלנט (explant) מתוקפות עבור דימות בעל תוכן גבוה (high-content imaging) ואנליזה מולקולרית.
מחקר תרגומי ופרה-קלמיני
- מתיישב עם מסלולים נוירו-התפתחותיים הרלוונטיים למחלה לצורך חקירת סממנים ביולוגיים תרגומיים.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי אפשור מחקרים מכניסטיים ברקע עצבי שלם.
- מספק נתונים מותאמי סיכונים כדי להנחות החלטות קידום עבור תוכניות טיפול נוירו-תרפיוטיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו להוצאת רסס רשתית (retinal explant) ex vivo מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר פרה-קליני, בכך שהיא מאפשרת בדיקה מבוקרת של היפותזות, בחינה של מסלולים ביולוגיים ואנליזה כמותית של התפתחות עצבית. היא מיועדת לשילוב בתהליכי העבודה של נוירוביולוגיה, החל מאימות מטרה ועד לזיהוי מובילים (lead identification).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקה מונחית-השערה של הפרעות גנטיות וכימיות ברקע עצבי.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של סממנים עצביים ומדדי מחזור תא לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מסייעת בהתאמה לסממנים ביולוגיים של התפתחות עצבית ולמדלי מחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להרחבה, הניתנת להתאמה בתוכניות מחקר ופיתוח בתחום הנוירוביולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי התפתחות נוירולוגית.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות, הסטנדרטיזציה והתפוקה של בדיקות רקמות עצביות.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות של go/no-go ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים חסונים בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד עדיפויות מותאם סיכונים וקידום של מועמדים לטיפולים נוירולוגיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה של עובריים, טיפול ברקמות ובטכניקות אלקטרופורציה.
- נדרשת גישה למכשור ייעודי כגון מחוללי פולסים ופלטפורמות דימוי.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת ריאגנטים ופרוטוקולי חשיפה.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה לשלבי התפתחות שונים או למינים שונים.
- משך התרבית מוגבל לכ-24 שעות כדי למנוע התדרדרות של הרקמה וארטיפקטים התפתחותיים.
