Name: תרבות דגם חדשני לpluripotent אדם תאי גזע רביה בטין במדיה מזגן שליה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: למד שיטה פשוטה וחסכונית לגידול תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים תוך שימוש במצע מותנה משליה אנושית וציפוי ג'לטין. השיטה מבטלת את הצורך בתוספים סינתטיים ומספקת חלופה יעילה לפרוטוקולים מסורתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות לזמן קצר-Cheol הונג (MD, Ph.D., פרופסור חבר במחלקה למיילדות וגניקולוגיה, אוניברסיטת קוריאה ספר לרפואה) למתן רקמת שליה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות (R1211902) מקרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF), הרפובליקה של קוריאה.

הצהרת אתיקה: מחקר השליה האנושי נערך מכאן ולהבא, באישור דירקטוריון הסקירה המוסדית למחקר אנושי של אוניברסיטת קוריאה (AN09085-001). כל הניסויים בוצעו במתקן חדר נקי נבט-חינם במרכז הרפואי של אוניברסיטת קוריאה. העיצוב ונהלים באמצעות hPSCs הניסוי אושרו על ידי מועצת המנהלים המוסדית הסקירה של המרכז הרפואי של אוניברסיטת קוריאה (AN12277-003). 1. הכנה של מכשירים, תרבות מדיה, ומנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל מנות תרבות מעיל עם ג&#39;לטין 0.1%. מלוח החיטוי שנאגרו פוספט (PBS) ומלקחיים. לעקר מספריים כירורגיות, צינורות microcentrifuge, וגזה ב 121 מעלות צלזיוס מתחת psi £ 15 ליותר מ -15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.25% חומצה מוכנה מראש חימם אמין טריפסין-אתילן טטרה-אצטית (טריפסין-EDTA) ותקשורת מראש חימם תרבות המסוננת (DMEM) המכיל 20% בסרום שור עוברי (FBS), 100 U / פניצילין מיליליטר, 100 ג &#39;/ מיליליטר streptomycבלפני תחילת הליכים. </li></ol> 2. בידוד תא משלית האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג רקמת שליה, לאחר לידה בניתוח קיסרית, מהנשים בהריון בריאה עוברת הפלה רגילה או טיפולית ב7-32 שבועות של הריון לאחר קבלת כתב הסכמה מדעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לי מומחה יילוד צלחות כוריוני אנושי שליה בניתוח נפרדת (HPCs) מהשליה; דגירה אלה ב0.25% טריפסין- EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם 5 מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד villi כוריוני מHPCs באמצעות מספריים; ברר villi ולשטוף אותם שלוש פעמים עם 1ml PBS. לאחר מיותר, למקם את villi כוריוני לתוך צינור microfuge באמצעות קצה פיפטה; לשטוף את הדגימות עם 500 μl PBS על ידי pipetting למעלה ולמטה, וצנטריפוגה צינורות עבור 120 XG במשך 3 דקות. לשטוף רקמות פעמיים עם 500 μl של מדיום התרבות המחומם מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים במדיום על צלחות מצופים ג&#39;לטין על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 </&gt;, ותחת 95% לחות משנה. טרום מעיל כל הצלחות עם ג&#39;לטין 0.1% עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. מושבות של תאים כמו פיברובלסטים-יהוו וצמיחה חסיד כ 5-7 ימים לאחר תחילת תרבות באותו המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף הבינוני כל 2-3 ימים עד למעבר השלישי. במהלך התרבות, הסרת פסולת תא צף במדיום התרבות; fibroblasts השליה גדל יצרף לצלחת. תרבות התאים כמו פיברובלסטים הנגזרים מHPC עד מעבר -10 ולאחר מכן לקצור אותם לתרבויות hESC לאחר טיפול trypsinization וmitomycin-C (10 מיקרוגרם / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הקפאת HPCs כדגימות מניות, להשתמש תגובת שרשרת השעתוק-פולימראז הפוך (RT-PCR) כדי לאשר שHPCs אינם מזוהמים עם פתוגנים שנפוצים להדביק את השליה, כולל mycoplasma (fermentans מ &#39;, hyorhinis מ&#39;, מ &#39;ארגינין, M . Orale, salivarium מ &#39;, מ&#39; hominis, pulmonis מ &#39;, arthritidis מ&#39;, neurolyticum מ &#39;, מ&#39; hyopneumoniae,ומ &#39; capricolum) ומיני חיידקים, urealyticum Ureaplasma, על ידי שימוש בערכה לגילוי mycoplasma. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר ההוראות של היצרן לבצע RT-PCR, להשתמש בכל צבעי יסוד ותערובות המסופקים בערכה. השתמש בsupernatants של התאים שכבר טיפחו במשך 36 ימים לגילוי mycoplasma. הוסף 3 μl של דגימות אלה לתערובות PCR ולבצע את הליך 1 st PCR במשך 35 מחזורים, כל אחת בהיקף של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ו -72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 0.5 μl של מוצר st PCR 1 לתערובת PCR ולבצע את הליך 2 nd PCR במשך 30 מחזורי שימוש באותם תנאים כמו קודם. נתח את המוצרים מוגברים על ידי 1% ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose; להחיל 10 μl של כל אחד ממוצרי ה- PCR -1 ו -2 nd לג&#39;לי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם HPCs נמצא להיות מזוהם עם פתוגנים, לחסל אלהבאמצעות שילוב של אנטיביוטיקה (BM-Cyclin), הבא להוראות היצרן. להוסיף מדיום חדש המכיל 10 מיקרוגרם / מיליליטר של BM-Cyclin 1 במשך 3 ימים, ולאחר מכן לטפל בתאים עם 5 מיקרוגרם / BM-Cyclin מיליליטר 2 לעוד 4 ימים. חזור על מחזור זה פעמיים ולאחר מכן לבדוק זיהום mycoplasma שוב. </li></ol> 3. תאים נגזר שלית קציר אדם אוויר בינוני (hPCCM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר נטרול זיהום, טיפול בתאים המצורפים (מפגש 85-90%; (1.5 × 10 7 תאים / בקבוק) עם mitomycin-C (10 מיקרוגרם / מיליליטר) עבור 2 שעות ו -30 דקות, ושטף את התאים שלוש פעמים עם 10 מיליליטר PBS. דגירה התאים עם מדיום מראש התחמם ללא mitomycin-צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לאחר הטיפול, דגירה תאים ב 10 מיליליטר בינוני (DMEM-F12 בתוספת 20% החלפת סרום נוק-אאוט [KOSR], 0.1 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, NEAA 1%, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין). לאחר 24 שעות של דגירה, CM קציר בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל ולסנן את CM באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף עוד 10 מיליליטר של מדיום ודגירה חדשים. לאסוף את כל supernatants מהתרבויות בכל יום במשך שבוע 1 ולהקפיא את המדיום שנקטפו ב -80 ° C. הימנע להקפיא להפשיר מחזורים חוזרים ונשנים. </li></ol> 4. תאי התרבות של גזע עובריים אנושית (hESCs) ואינדוקציה של תאי גזע pluripotent (iPSCs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג שורות תאי גזע עובריות אנושיות, תאי H1 וH9 (רשומים במרשם NIH hESC תחת השם WA01 וWA09, בהתאמה) ומושרה pluripotent בתאי גזע iPSC-1: iPS (עורלה) -1 וiPSC-2 (IISH1i- BM) מWiCell מכון המחקר (מדיסון, ויסקונסין, ארה&quot;ב). צריכים להיות מופשרים תאים בתרבית הבא הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוצת הביקורת, תאי תרבות במנות מצופות מטריקס הקרום במרתף במדיום תרבות בשימוש נרחב בסרום ללא-מזין חופשי ומוגדרת על 37 מעלות צלזיוס וב 5% CO 2. בתחילה, זרע 80-100 גושים של hPSCs אנימנות 35 מ&quot;מ n. לגדל תאים בכלים האלה עד תאי מעבר מפגש ואופן שיגרתי 70-80% לאחת 5-6 ימים, תוך שימוש בשיטות מכאניות או אנזימטי (Dispase) culturing-משנה. לשטוף את התאים פעמיים עם מדיום וצלחת אותם ביחס של 1: 4. החלף את המדיום עם מדיום חדש כל יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוצות ניסוי, תאי התרבות בhPCCM על מנות מראש מצופים עם 0.1% ג&#39;לטין ולבצע passaging השגרתי אחת ל5 ימים, או מכאני או אנזימים. תאי פלייט ביחסים בטווח של 1: 6-1: 10. hPSCs לצרף את הג&#39;לטין בתוך 2 ימים לאחר העברה. החלף את המדיום עם מדיום חדש מדי יום. </li></ol> 5. אפיון של תאי גזע pluripotent האדם הערה: אפיון hPSCs באמצעות מספר שיטות, כגון צביעת אלקליין phosphatase, immunocytochemistry, בזמן אמת PCR (qRT-PCR), ומערבי סופג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לimmunofluorescencהצביעה, hPSCs תרבות הדואר ולתקן את התאים בתאי שקופית 8-היטב עם 4% (w / v) paraformaldehyde במשך 10 דקות; לאחר מכן, permeabilized את התאים עם 0.1% (V / V) טריטון-X100 במשך 15 דקות, ולחסום את התאים עבור שעה 1 עם 3% (V / V) בסרום סוס הרגיל בPBS המכילים 0.1% (V / V) Tween- 20. לשטוף PBS פעמיים במשך 5 דקות בין כל צעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם הנוגדן הראשוני (אוקטובר-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, דילול של 1: 1,000) O / N ב 4 ° C ועם הנוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההתקנה, דגירה תאים עם 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) במשך 5 דקות בחושך. לשטוף את תאי קפדנות שלוש פעמים לכל 5 דקות ויבשות תאים לחלוטין, בחושך. לשמר תאים בינוני הרכבה הקרינה ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> qRT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד RNA המוחלט מהתאים באמצעות ערכת RNeasy מיני פי המפרט של היצרן ולכמת את RNA חילוץ באמצעות ננו גלילת ספקטרופוטומטר. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז cDNA על ידי הוספת 2 מיקרוגרם של RNA הכולל לאוליגו המכיל 20-μl תערובת תגובת פריימרים (DT) והכתב עילי השני הפוכים transcriptase; בצע את ההוראות של היצרן בהליך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את cDNA מסונתז עם מערכת iQ Bio-Rad iCycler, באמצעות iQ SYBR ירוק qPCR מיקס מאסטר ורצפי פריימר המתואר במכתב לוח S1. לנרמל את ערכי סף מחזור של גנים של עניין לאלה של דהידרוגנז glyceraldehyde-3-פוספט (GAPDH). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> phosphatase אלקליין מכתים (AP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי פעילות AP באמצעות סלולארי ES אפיון ערכה, על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 5, לשאוב התקשורת ולתקן את hPSCs עם paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS עבור 12 דקות. אל overfix; תיקון תאים ליותר מ 2 דקות יגרום איון של phosphatase אלקליין. לשאוב מקבע ולשטוף עם 1x לשטוף מאגר. אללאפשר בארות לייבוש בין צעדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף פתרון מכתים מספיק כדי לכסות את כל טוב (1 מיליליטר לכל גם צלחת 35 מ&quot;מ). דגירה צלחות בחושך ב RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לשטוף כלים עם 1x לשטוף מאגר. תאי כיסוי עם 1x PBS כדי למנוע התייבשות ולבחון ותמונת התאים המוכתמים באמצעות מיקרוסקופ אולימפוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבי כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח כתם מערבי כפי שתוארו לעיל ב9. בקצרה, לקבוע ריכוזי חלבון בlysates תא. לפתור כמויות שווה של חלבון על ג&#39;ל אלקטרופורזה סולפט polyacrylamide ג&#39;ל dodecyl נתרן (SDS-עמוד) ולהעביר את החלבונים על הממברנה פלואוריד polyvinylidene (PVDF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את הכתם ולחקור אותו O / N עם נוגדנים עיקריים שונים ב 4 ° C; לאחר מכן דגירה הכתם עם נוגדנים משני HRP-מצומדות עבור שעה 1. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם בין incubations. לזהות אותות באמצעות מגיב ECL. </li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על טנדם קצר ניתוח (STR) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hPSCs נקצרו מהשליטה וקבוצות ניסוי באותו הקטע. הדנ&quot;א הגנומי הופק באמצעות ערכת DNA מיקרו, על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את הדנ&quot;א הגנומי במשך 16 לוקוסים גנטיים שונים באמצעות ערכת AmpF / STR PCR הגברה, על פי המפרט של היצרן ואלקטרופורזה נימים בוצע באמצעות מנתח גנטי. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).</li>
<li>Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itskovitz-Eldor+Feeder+layer+and+serum-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells.</a> Biol Reprod. 70 (3), 837-845 (2004).</li>
<li>Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+pluripotent+stem+cells+using+completely+defined+conditions+on+a+recombinant+E-cadherin+substratum%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum.</a> BMC Dev Biol. 10, 60(2010).</li>
<li>Jin, S., Yao, H., Weber, J. L., Melkoumian, Z. K., Ye, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic%2C+xeno-free+peptide+surface+for+expansion+and+directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A synthetic, xeno-free peptide surface for expansion and directed differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 7 (11), e50880(2012).</li>
<li>Xu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+supports+undifferentiated+human+embryonic+stem+cell+growth+without+conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium.</a> Stem Cells. 23 (3), 315-323 (2005).</li>
<li>Levenstein, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+support+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeder+cells+can+support+the+undifferentiated+growth+of+human+and+mouse+embryonic+stem+cells+using+their+own+basic+fibroblast+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human feeder cells can support the undifferentiated growth of human and mouse embryonic stem cells using their own basic fibroblast growth factors.</a> Stem Cells Dev. 20 (11), 1901-1910 (2011).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+human+placenta+as+a+source+of+the+universal+feeder+in+human+and+mouse+pluripotent+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">The efficacy of human placenta as a source of the universal feeder in human and mouse pluripotent stem cell culture.</a> Cell Reprogram. 12 (3), 315-328 (2010).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undifferentiated+propagation+of+the+human+embryonic+stem+cell+lines%2C+H1+and+HSF6%2C+on+human+placenta-derived+feeder+cells+without+basic+fibroblast+growth+factor+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines, H1 and HSF6, on human placenta-derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation.</a> Stem Cells Dev. 19 (11), 1713-1722 (2010).</li>
<li>Seok, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+placenta-derived+feeders+support+prolonged+undifferentiated+propagation+of+a+human+embryonic+stem+cell+line%2C+SNUhES3%3A+comparison+with+human+bone+marrow-derived+feeders%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human placenta-derived feeders support prolonged undifferentiated propagation of a human embryonic stem cell line, SNUhES3: comparison with human bone marrow-derived feeders.</a> Stem Cells Dev. 16 (3), 421-428 (2007).</li>
<li>Levenstein, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+support+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).</li>
<li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).</li>
<li>Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+differentiation+of+stem+cells+mesenchymal+progenitors+by+inhibition+of+TGF-beta%2Factivin%2Fnodal+using+SB-431542%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542.</a> J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).</li>
</ol>

המחברים מציינים אין ניגודי אינטרסים.

מודל זה פותח כדי להפיץ בהצלחה hPSCs, תוך שמירה על המאפיינים שלהם, בתנאי תרבות חופשי מזין אנושי ללא התוספת של גורמי גדילת רקומביננטי אקסוגניים כגון bFGF או אינסולין, המאפשר המניפולציה של hPSCs במייקרו-סביבה אנושית. תוספי bFGF אקסוגני הוא נפוצים והיישום של substrata כגון Matrigel או laminin הוא חיוני עבור culturing ללא מזין של 14 hPSCs. פרוטוקול זה הוא פשוט וקל ליישום. עם זאת, כמה צעדים הם קריטיים להצלחה...

מטרת פרוטוקול זה היא התפשטות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) כולל תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSCs) בתנאים אנושיים לחלוטין ללא הזנה ex vivo ללא צורך בתוספים אקסוגניים נוספים ומצעים סינתטיים. עד כה, הפיתוח של מודלים של תרביות hPSC ex vivo, המאפשרים הכנסת מוצרי תרבית למרפאה, היה דאגה מרכזית במחקר תאי גזע. באופן ספציפי, יש לטפל בשתי בעיות קריטיות. ראשית, יש צורך במערכת תרבית ex vivo אנושית להפצת hPSCs המונעת את הסיכון לזיהום על ידי מוצרי תאים מן החי. שנית, יש צורך במודל תרבית ללא הזנה כדי לאפשר ייצור המוני קל וחסכוני של hPSCs. עבור יישומים טיפוליים של hPSCs, יש צורך לזהות את הגורמים המווסתים את ההתחדשות העצמית והבידול שלהם.
מאז ש-Xu ואחרים דיווחו לראשונה על היתכנות השימוש במדיה מותנית (CM) שמקורה בפיברובלסטים עובריים של עכברים (MEF) לגידול hESCs על Matrigel1, מחקרים רבים בחנו שיטות התפשטות ex vivo אופטימליות עבור hPSCs2-4. עם זאת, מערכת התפשטות hPSC אידיאלית ללא מזין ex vivo לא פותחה מכיוון שהשיטות הנוכחיות דורשות מצעים אקסוגניים נוספים כולל bFGF ואינסולין, גורמים ידועים המקיימים hPSC, במצע תרבית5-7. יתר על כן, שכבות סינתטיות כמו מטריג'ל או למינין משמשות בכל התרבויות ללא מזין.
הרציונל מאחורי הפיתוח והשימוש בפרוטוקול זה מבוסס על מחקרים קודמים שלנו המראים שתאי כוריון שליה אנושית תומכים בצורה מצוינת בהתפשטות של hPSCs ללא תוסף bFGF8-11. לפרוטוקול זה מספר יתרונות כולל פשטותו ביחס לטיפול וחסכוניותו, וזוהי תרבית אנושית כמעט מושלמת המאפשרת התפשטות hPSC ללא מצעים סינתטיים אקסוגניים. היישום של CM שמקורו בשליה אנושית (hPCCM) עבור hPSCs כולל 3 שלבים. ראשית, תאי כוריון מבודדים מהשליה האנושית ומתורבתים. שנית, hPCCM מיוצר מתאים מתורבתים. שלישית, hPSCs מתורבתים באמצעות hPCCM והמאפיינים שלהם מאושרים. 
פרוטוקול זה יקל על יישומים קליניים של hPSCs ומחקרים על מנגנוני התפשטות והתקשרות hPSC. במאמר זה מוצג הפרוטוקול להתפשטות מוצלחת של hPSCs ב-hPCCM על צלחת מצופה ג'לטין.

<table><tbody><tr><td>מיטומיצין-C</td><td>סיגמא-אולדריץ' תאגיד</td><td>M4287</td><td>10 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>ערכת זיהוי מיקופלזמה</td><td>TaKaRa Bio Inc.</td><td>#6601</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>#354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies Inc.</td><td>#05850</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS02100</td><td>1 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>G2500</td><td>0.10%</td></tr> <tr><td>BM-Cyclin</td><td>Roche</td><td>799 050</td><td>10 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>ערכת מיני RNeasy&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר ננו טיפה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR ירוק qPCR מאסטר מיקס&nbsp;</td><td>מעבדות Bio-Rad</td> <td>#170-8882AP</td><td></td></tr><tr><td>ערכת אפיון תאי ES</td><td>Chemicon International, Inc.,</td> <td>SCR001</td><td></td></tr><tr><td>ערכת סינתזת cDNA כוח&nbsp;</td><td>iNtRON ביוטכנולוגיה</td><td>25011</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp&reg; ערכת מיקרו DNA</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>AmpF/STR&reg; Identifiler&reg; ערכת הגברת PCR</td><td>אפלייד ביוסיסטמס בע"מ</td><td></td><td></td>4322288</tr><tr><td>אפלייד ביוסיסטמס&reg; מנתח גנטי 3130XL&nbsp;</td><td>אפלייד ביוסיסטמס בע"מ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

תרבות דגם חדשני לpluripotent אדם תאי גזע רביה בטין במדיה מזגן שליה

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

התפשטות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) במדיום מותנה שמקורו בתאים אנושיים בתנאי תרבית ללא מזין הייתה מעניינת. עם זאת, לא פותחה שיטת ריבוי אידיאלית ללא מזין ex vivo עבור hPSCs; נכון לעכשיו, מצעים אקסוגניים נוספים כולל גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF), גורם מקיים hPSC ראשי, מתווספים לכל אמצעי התרבות ותשתית סינתטית כגון מטריג'ל או למינין משמשות בכל התרביות ללא מזין. לאחרונה, הקבוצה שלנו פיתחה פרוטוקול פשוט ויעיל להפצת hPSCs באמצעות מדיה מותנית בלבד שמקורה בשליה האנושית על צלחת מצופה ג'לטין ללא תוספת אקסוגנית נוספת או שכבות סינתטיות ספציפיות ל-hPSCs. פרוטוקול זה לא דווח בעבר ועשוי לאפשר לחוקרים להפיץ hPSCs ביעילות בתנאי תרבית אנושיים. בנוסף, מודל זה מונע סיכוני זיהום hPSC על ידי מוצרים מן החי כגון וירוסים או חלבונים לא ידועים. יתר על כן, מערכת זו מאפשרת ייצור המוני קל של hPSCs באמצעות ציפוי הג'לטין, שהוא פשוט לטיפול, מפחית באופן דרמטי את העלויות הכוללות של תחזוקת hPSC ex vivo.

אחד יתרונות של שיטת הפצת hPSC הזה הוא שהוא משתמש ברכיבים מופרשים מהתאים אנושיים. צעד ciritical ביותר בפרוטוקול הוא הבידוד והתרבות של תאי שמקורם בשליית אדם. זה דורש נתיחה ומדויקת מחלק מדויק של villi צלחת HPC. איור 1 מציג את הליך בידוד תא הנגזר שליה אנושית. תהליך זה הוא פשוט ונוח לבידוד של תאים, ויכול בקלות להתבצע בתוך שעה 1. כפי שמתואר באיור 2, רקמות מחוברת לתאי הצלחת וכמו פיברובלסטים-ג&#39;לטין המצופה צמחו וחסונה. סילוק פסולת ורקמות רקובים במעברים...

פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה ויעילה להפצת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באמצעות מדיה מותנית בלבד שמקורה בשליה האנושית בצלחת מצופה ג'לטין ללא תוספת אקסוגנית נוספת או שכבות סינתטיות ספציפיות ל-hPSC.

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לתאר כיצד לייצר באופן המוני תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות ציפוי ג'לטין פשוט וחסכוני. הדבר מושג תחילה על ידי בידוד של chorionic villi מרקמות של שליה אנושית, ולאחר מכן קיצוץ של ה-villi לחתיכות רקמה קטנות כשלב שני. חתיכות הרקמה נתרבמות על פלטות מצופות ג'לטין שבהן הן יוצרות מושבות של תאים דמויי פיברובלסטים נצמדים תוך חמישה עד שבעה ימים, ולאחר מכן משמשות להכנת מדיום מותנה (conditioned media) לתרבית של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.בשלב הבא, זורעים 80 עד 100 צבירים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים תחת מצע גידול המועשר בתרשומות של תאים המופקים משליה אנושית, ומבצעים תת-תרבית פעם ב-4 עד 5 ימים. התוצאות מראות дифרנציאציה והיצמדות תאים דומות בין תאים שגודלו בתנאי "תו התקן" (gold standard) לבין השיטה המתוארת כאן, שבה התאים גודלו על פלטות מצופות ג'לטין במצע מועשר בתרשומות של שליה אנושית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות גישה אחרות הוא השימוש ברכיבים המופרשים מתאים אנושיים, ללא צורך בתוספות חיצוניות נוספות או בתמיכות סינתטיות.כדי להתחיל, יש לצפות צלחות תרבית T 25 בחמישה מיליליטרים של תמיסת gelatin בריכוז 0.1% למשך שעה אחת ב-37 degrees Celsius, ולאחר מכן לעקר 500 מיליליטרים של phosphate buffered saline, פינצטה, מספריים כירורגיים, מבחנות מיקרו-צנטריפוג

a-novel-culture-model-for-human-pluripotent-stem-cell-propagation-on

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מסורתית, שני ממדי התרבות טכניקות תא לעיתים לגרום מאפיינים שינו לגבי סמנים בידול, ציטוקינים וגורמי גדילה. תלת ממדי התרבות תאים במערכת מסתובבת תרבית תאים (RCCS) reestablishes הביטוי של רבים מהגורמים הללו כפי שמוצג כאן עם קו trophoblast extravillous התא.

סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים Trophoblast האדם כמודל

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC), המבוססים על גידול חד-שכבתי (NCM) שאינו מסוג מושבה של תאים בודדים מנותקים. שיטה חדשה זו, המשתמשת במעכבי קינאז הקשורים ל-Rho או באיזופורם הלמינין 521 (LN-521), מתאימה לייצור כמויות גדולות של hPSCs הומוגניים, מניפולציה גנטית וגילוי תרופות.

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

שיטה פשוטה להקים השליה אדם מן המעלה הראשונה (villous) ותרבויות איבר decidual מתואר. תרבויות איבר Villous ו decidual הם כלי שלא יסולא בפז ללימוד בפתוגנזה בממשק האם והעובר האדם. זיהום עם חיידקים ליסטריה חיידק תאי פקולטטיבי מודגם.

שלית Decidual אדם תרבויות איברים ללמוד זיהומים בבית הממשק האם והעובר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של תאים טרופובלסטיים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות חלבון מורפוגני בעצם 4 ומעכבים של מסלולי האקטיבין/צמתים. שיטה זו מתאימה להתמיינות יעילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ויכולה לייצר כמויות גדולות של תאים למניפולציה גנטית.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

פרוטוקול מוצג להכין hydrogels אסיד פוליוויניל אלכוהול-co-itaconic עם נוקשות בדרגות שונות, אשר היו הושתל עם ובלי oligopeptides, לחקור את השפעת הנוקשות של biomaterials על בידול והתפשטות תאי גזע. הנוקשות של hydrogels היה בשליטת הזמן crosslinking.

התרבות תאי גזע Pluripotent אנושי על פוליויניל אלכוהול-Co-Itaconic Hydrogels חומצה עם קשיות שונות בתנאים קסנו-חופשית

כאן, אנו מתארים שיטה לחימום בלסטוציטים אנושיים זגוגיים, איסוף אותם דרך תקופת ההשתלה במבחנה, לעכל אותם לתאים בודדים ואיסוף תאי trophoblast מוקדם לחקירה נוספת.

אוסף תאים בודדים של תאי טרופוביסט בעוברים אנושיים שלב השתלה פרי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למערכת תרבית תאים אוטומטית. מערכת תרבית אוטומטית זו מפחיתה את העבודה ומועילה למשתמשים, כולל חוקרים שאינם בקיאים בטיפול בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS), החל מתחזוקה של תאי iPS ועד התמיינות לסוגים שונים של תאים.

מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

אורגנואידים הפכו לכלים רבי ערך למידול מחלות. המטריצה החוץ תאית (ECM) מנחה את גורל התא במהלך יצירת אורגנואידים, ושימוש במערכת הדומה לרקמה הטבעית יכול לשפר את דיוק המודל. מחקר זה משווה את הדור של אורגנואידי מעיים אנושיים המושרים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע אנושיים ב- ECM שמקורו בבעלי חיים ובהידרוג'לים נטולי קסנו.

מחקר השוואתי של מטריצות קרום מרתף לתחזוקת תאי גזע אנושיים ויצירת אורגנואידים במעי

הפרוטוקול מציג מודל ניסוי חדש במבחנה שיכול לסכם את הביולוגיה של שני סוגים של קווי תאים דבקים עם פיגום מודפס תלת מימדי (תלת מימד). מתוארים בניית מודל זה ונהלי הפעלה, מהכנת תאים ותרבית תאים ועד לניתוח והערכה.

מודל תרבית משותפת באמצעות שני סוגים של קווי תאים דבקים

הקמנו שיטה לעטיפת תאי גזע פלוריפוטנטיים (תאי PS) לכמוסות הידרוג'ל אלגינט באמצעות זרבובית קו-אקסיאלית.  זה מונע מהתאים להצטבר יתר על המידה ומגביל את מתח הגזירה שחווים התאים בתרבית השעיה.  הטכניקה ישימה לייצור המוני של תאי PS כמו גם למחקר על נישת תאי גזע.

Encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר Co-הצירית

למד שיטה פשוטה וחסכונית לגידול תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים תוך שימוש במצע מותנה משליה אנושית וציפוי ג'לטין. השיטה מבטלת את הצורך בתוספים סינתטיים ומספקת חלופה יעילה לפרוטוקולים מסורתיים.

תרבות דגם חדשני לpluripotent אדם תאי גזע רביה בטין במדיה מזגן שליה

גלה סרטונים נוספים