איתור רגיש של פעילות זריעת Proteopathic עם סריג cytometry הזרימה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות פעילות זריעה פרוטיו פתית ממקורות רקומביננטיים או ביולוגיים, מה שמאפשר זיהוי רגיש של חלבון, אגרגטים ודגימה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הניוון העצבי. לדוגמה, כיצד נוכל להעריך כמותית שינויים בפעילות הזריעה בעקבות התערבות טיפולית במודלים של מחלות בבעלי חיים?

היתרונות של טכניקה זו כוללים את הספציפיות הגבוהה שלה לרמות נמוכות של אגרגטים חלבונים. הספציפיות המעודנת שלו, קלות השימוש בו והתפוקה הגבוהה שלו. מי שמדגים את ההליך הזה היום יהיה אני, יחד עם המחבר השותף ברנדון הולמס.

כדי להכין את חומר הזרע הביולוגי, התחל בשקילת רקמת מוח קפואה בסירת מי גבינה חד פעמית. לאחר מכן העבירו את הרקמה לצינור חרוטי, הוסיפו מאגר הומוגניזציה קר כקרח, כך שהפתרון הסופי הוא 10%להמתין לנפח ולהעביר את הדגימות לחדר קר על קרח. לאחר מכן, התאם את מחוון הבדיקה כך להגדרות המתאימות ושטוף הצידה ואת תחתית הבדיקה.

אז קצה המחוון שלוש פעמים כפי שצוין, מנגב את הגשושית בין כל תמיסה. כאשר הגשושית מוכנה, טבלו את הקצה במאגר ההומוגניזציה של דגימה אחת והפעל את הסוניקט המספק 25 פולסים בסך הכל. כאשר הרקמה נמצאת בתרחיף לחלוטין, סובב את ההומוגנאט והעביר את הסופינט לצינור נקי.

הקפידו לא להפריע לחיך. בעוד שקיימות טכניקות הומוגניזציה רבות אחרות, מבחן עדיף לבידוד כמויות קטנות של זרעי פרוטיו פתיים מדגימות ביולוגיות. הדיסוציאציה המכנית מאפשרת פירוק עקבי ויעיל של הרקמה והפקת זרעים לאחר מכן.

לאחר מכן יש להצמיד את השכיבה ולאחסן את הליזטים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. כדי להפעיל מחדש את תאי החיישן הביולוגי בתנאים סטריליים, שטפו כל קו תאים עם PBS חם ואחריו דגירה של שלוש דקות עם טריפסין EDTA. כאשר התאים התנתקו, עצרו את התגובה בעזרת מדיום תרבית חם והעבירו מיד את התאים לצינור חרוטי.

צנטריפוגה של התאים מחיית, ותליית הכדור במדיום טרי. לאחר מכן ספרו את התאים ובצעו דילול תאי תערובת מאסטר של 3, 500, 000 תאים לכל 13 מיליליטר מדיום. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, העבירו לאט 130 מיקרוליטר מהתאים לכל באר של תרבית רקמה תחתונה שטוחה שטופלה בצלחת 96 בארות תוך הקפדה על הנחת קצות הפיפטה במרכז הבארות מבלי לגעת בתחתית הצלחת.

לאחר שהתאים הוקלטו, אפשרו להם להתיישב ללא הפרעה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן דגרו על הצלחת למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ויותר או שווה ל-80% לחות יחסית. למחרת, כאשר תאי החיישן הביולוגי הם 60 עד 65% מתלכדים, משלבים מגיב ליפוזום בינוני מופחת בסרום, ומקור זרעים ביולוגי ליצירת קומפלקסים של התמרה. לאחר מכן יש לזרוק 20 מיקרוליטר של קומפלקס התמרה בצד של כל חיישן ביולוגי בודד ולהחזיר את התאים המטופלים לחממה למשך 24 עד 48 שעות נוספות לפני הקטיף.

תאים לא מטופלים יראו רק פלואורסצנטיות מפוזרת. עם זאת, תאים שטופלו בחומר זרעי טאו יראו אגרגטים בהירים לאחר יום עד יומיים לקצירת התאים, החלף את מדיום תרבית התאים ב-50 מיקרוליטר של טריין EDTA, ועצור את התגובה. לאחר חמש דקות עם 150 מיקרוליטר של תרבית צוננת, מדיום, העבירו מיד את התאים לצלחת תחתונה עגולה של 96 באר וגלו את התאים, שאפו את הסופרנטנטים של S מבלי להפריע לכדורים, ולאחר מכן החייאה בעדינות אך ביסודיות, השעו את התאים ב-50 מיקרוליטר של 2% פרלדהיד למשך 10 דקות.

לאחר מכן סובב שוב את התאים והשהה מחדש את הכדורים ב -200 מיקרוליטר של מאגר ציטומטריה זרימה צונן בהקדם האפשרי. לאחר הקיבוע, טען את הצלחת על ציטומטר זרימה תואם שריג וצור אזור פיזור צדדי לעומת אזור פיזור קדימה לפי חלקת גרסה. לאחר מכן, כאשר קו התא הראשון פועל, כוונן פיזור צדדי ומתחי פיזור קדימה עד שאוכלוסיית התאים נמצאת ברבע השמאלי התחתון.

לאחר מכן באמצעות כלי המצולע, הגדר את אוכלוסיית התאים כהליכה P אחת. כעת צור גובה פיזור קדימה לעומת שטח פיזור קדימה לפי תרשים וריאנט והחל את השער P אחד. לאחר מכן, הגדר את התאים הבודדים כהליכה P שתיים וצור היסטוגרמה אחת כל אחד.

עבור מסנני C-F-P-Y-F-P ו-FRET, החילו שער P שניים עד שלוש היסטוגרמות שונות, אחת כל אחת עבור מסנני C-F-P-Y-F-P ומסנני FRET לפיצוי. ספייק ב -30 מיקרוליטר מקו התא מתלה אחד ל -200 מיקרוליטר של קו התא שני מתלה. לאחר מכן לחץ על סמל הגדרות המכשיר ואחריו לשונית הפיצוי ומטריצת הסימון כדי לפתוח את טבלת הפיצוי.

צור אזור פריט לעומת אזור CFP על ידי תרשים משתנה והחל את שער P שתיים. לאחר מכן, כאשר שורת התא הראשונה ושורת התא השנייה פועלות, לחץ על סמל הרביע וצייר רבעים כגון האוכלוסיות השליליות והחיוביות הפלואורסצנטיות מופרדות על ידי שני הרבעים התחתונים. כעת צור טבלת סטטיסטיקה המציגה את עוצמת הקרינה החציונית או MFI של שריג עבור שערי LL שלוש ו-LR שלושה והתאם את פרמטר השריג במטריצת הפיצוי עד שה-MFI של אות השריג שווה בערך בין LL שלוש ל-LR שלוש.

לאחר מכן, צור אזור YFP לעומת אזור CFP לפי תרשים משתנה עם רבעים. התאם את פרמטר ה- YFP במטריצת הפיצוי עד שה- MFI של אות ה- YFP יהיה שווה בערך בין הרבעים. בדומה לזה שהוצג קודם לכן עבור ציטומטריית זרימת פריט.

הזליגה הפלואורסצנטית העיקרית מתרחשת מ-CFP הנפלט לתוך תעלת זיהוי השריגים, אותה ניתן לתקן באמצעות פיצוי פלואורסצנטי באמצעות תאי הבקרה החיוביים בצבע יחיד כאשר כל השערים הוגדרו ואות ה-CFP פוצה. הדגש את הבארות המעניינות והפעל את שארית הצלחת כדי לנתח את הנתונים. ראשית, הגדר את התאים והתאים הבודדים באמצעות אותם פרמטרים שבהם אנו מגדירים את ניתוח הזרימה.

לאחר מכן, באמצעות קו תא שלוש, התווה את התאים החיוביים הבודדים של YFP לשריג לעומת YFP לפי תרשים וריאנט. צייר שער מצולע שעובר לאורך והרחק מהשיפוע של אוכלוסיית התאים החיוביים כדי להגדיר הליכה כוזבת, שאינה כוללת זליגת YFP לתוך מסנן השריגים. לאחר החלת ההליכה הכוזבת על כל הדגימות, שרטט את תאי ה-C-F-P-Y-F-P הריקים שטופלו בליפוזום על שריג לעומת CFP על ידי תרשים משתנה והכנס GA מצולע לאורך שיפוע האוכלוסייה המשתרע כלפי מעלה ושמאלה הרחק מהאוכלוסייה.

כל אירוע שעובר לשער זה נחשב חיובי לעצב ואחוז התאים יתאים לטיטר הזרע המשמש במהלך הטיפול. לבסוף, רשום את פרמטרי הניתוח המעניינים, כולל אחוז החיובי של הפריט ועוצמת הקרינה החציונית של התאים החיוביים לפריט. לאחר מכן מדוד את המכפלה של אחוז החיוביות וה-MFI כדי לחשב ידנית את צפיפות השריגים המשולבת.

בהיעדר אגרגטים או זרעי טאו, טאו נשמר במצב מונומרי מסיס כפי שמיוצג על ידי אות פלואורסצנטי שלילי מפוזר ושלילי עקבי. לאחר החדרת זרעי טאו לתאי החיישן הביולוגי, טאו אנדוגני מומר לכימות מצב חיובי מצטבר ועצבני. ניתוח ציטומטריית זרימה לאחר מכן מאשר כי ריכוזי פמטו טוחנת של טאו רקומביננטי מספיקים לזיהוי. הנה.

רקמת גזע המוח מעכברי טאואופתיה שהוקרבו בגילאים שונים, משמשת כאזור מוח מייצג המדגים זיהוי עקבי של פעילות הזריעה בקרב בעלי החיים כבר בגיל 1.5 חודשים. בניסוי זה, מוח הומוגני מנבדקי מחלת אלצהיימר הפגין פעילות זריעה חזקה, בעוד שנבדקי בקרת הגיל ומחלת הנטינגטון לא הדגימו את ספציפיות הבדיקה לאגרגטים של טאו תרביות עצביות ראשוניות לא מטופלות שהומרו עם טאו, CFP וטאו. מבנים לנטי-ויראלים של YFP הפגינו אות פלואורסצנטי מפוזר בטיפול בזרעי טאו רקומביננטיים.

עם זאת, טאו אנדוגני יוצר אגרגטים גדולים הניתנים לזיהוי על ידי ציטומטריית זרימת פריט גם בהיעדר התמרה מתווכת ליפוזום. כאשר מקורות זרעים מודגרים מראש עם תרופות המעכבות את ספיגת הטאו כמו הפרין ומטופלים בהיעדר ליפוזומים, ניתן לחסום את פעילות הזריעה הכלולה הן בדגימות מוח של עכברי fis רקומביננטיים והן בדגימות מוח של עכברי טאואופתיה. ברגע ששולטים.

ניתן להשלים טכניקה זו תוך שלושה ימים כאשר בכל יום רק שעה עד שעתיים של עבודת ספסל. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור כי תידרש אופטימיזציה פנימית עבור שלבים מסוימים. לדוגמא, בעת קביעת טיטרים יעילים מזרעים פרוטיו פתיים ממקורות ביולוגיים שונים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להגדיר, להריץ ולנתח ניסויים בציטומטריית זרימת פריט למטרות זיהוי פעילות זריעה פרוטיו פתית ממקורות רקומביננטיים וביולוגיים.