Name: איתור רגיש של פעילות זריעת Proteopathic עם סריג cytometry הזרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: למד לזהות פעילות זריעה פרוטאופתית באמצעות שיטת FRET cytometry זרימה. שיטה זו מאפשרת גילוי רגיש של צבירי חלבון בדגימות ביולוגיות ורקומביננטיות לחקר מחלות נוירודגנרטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קונסורציום טאו (M.I.D); מענק 1R01NS071835 (M.I.D.), מענק של משרד ההגנה PT110816 (ל-M.I.D.), 1F32NS087805 (ל-J.L.F.), ו-1F31NS079039 (ל-B.B.H).

<ol><li>Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+diseases+target+large-scale+human+brain+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks.</a> Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+Regional+Neurodegeneration+from+the+Healthy+Brain+Functional+Connectome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome.</a> Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).</li>
<li>Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Network+Diffusion+Model+of+Disease+Progression+in+Dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia.</a> Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+of+Alzheimer%27s+disease-related+neurofibrillary+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes.</a> Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).</li>
<li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).</li>
<li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+protein+aggregate+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of protein aggregate propagation.</a> Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).</li>
<li>Kaufman, S. K., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+propagation+of+protein+aggregation+and+related+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies.</a> Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).</li>
<li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+properties+of+Tau+protein%3A+the+importance+of+extracellular+Tau+as+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target.</a> J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).</li>
<li>Guo, J. L., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+transmission+of+pathogenic+proteins+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases.</a> Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).</li>
<li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).</li>
<li>Guo, J. L., Lee, V. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+normal+tau+by+pathological+tau+conformers+drives+pathogenesis+of+Alzheimer-like+tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2011).</li>
<li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+mediate+internalization+and+propagation+of+specific+proteopathic+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).</li>
<li>de Calignon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+Tau+Pathology+in+a+Model+of+Early+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease.</a> Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-Synaptic+Spread+of+Tau+Pathology+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo.</a> PLoS One. 7 (2), e31302(2012).</li>
<li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 Forthcoming.</li>
<li>Yoshiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+loss+and+microglial+activation+precede+tangles+in+a+P301S+tauopathy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.</a> Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. 65 (65), (2012).</li>
<li>Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+hippocampal+dentate+gyrus+from+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse.</a> J Vis Exp. (33), (2009).</li>
<li>Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+prion+protein+bound+to+stainless+steel+wires%3A+a+model+for+testing+decontamination+procedures+for+transmissible+spongiform+encephalopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Control+Hosp+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).</li>
<li>McDonnell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleaning%2C+disinfection+and+sterilization+of+surface+prion+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hosp+Infect%22%5BJournal%5D)">Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination.</a> J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).</li>
<li>Banning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometry-based+FRET+assay+to+identify+and+analyse+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells.</a> PLoS One. 5 (2), e9344(2010).</li>
<li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Features+of+Tau+Fibrils+from+Alzheimer%27s+Disease+Brain+Are+Faithfully+Propagated+by+Unmodified+Recombinant+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein.</a> Biochemistry. , (2013).</li>
<li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> J Vis Exp. (95), e51537(2015).</li>
</ol>

בדיקה זו ניתנה ברישיון ל-Janssen Pharmaceuticals.

מערכת cytometry זרימת סריג המתוארת כאן היא כלי רב עוצמה להערכת פעילות זריעת טאו במהירות ובכמותית. זה דורש רק ניסיון מתון תרבית תאים וידע בסיסי של סריג וcytometry זרימה. מבחני זריעה אחרים, כגון Thioflavin T - אשר מציגה משופר הקרינה כאשר חייב מבנה גיליון בטא - הם מייגע ודורשים מצע חלבון טהור, רקומביננטי. בנוסף, במבחנה מבחני זריעה לטאו הם חצי כמותית בלבד, ובדרך כלל רגישים לרמות subnanomolar חומר זרע 23,24. סריג cytometry זרימה, לעומת זאת, מספק מדד כמותי ורגיש להפל...

ההצטברות של amyloids טאו תאיים מגדירה tauopathies כגון מחלת אלצהיימר. בשלבים המוקדמים של מחלה, פתולוגיה בדרך כלל מקומית לאזורים הנפרדים של המוח, אך עם התקדמות מחלה, פתולוגיה תמיד מתפשטת לאורך רשתות עצביות שונות 1-5. ראיות מצטברות מצביעות על התפשטות transcellular של אגרגטים חלבון רעילים בבסיס הפתולוגיה זה (שנסקר ב6-10). במודל זה, זרעי proteopathic (למשל, באוניברסיטת תל אביב) משתחררים מתאי תורם ולהיכנס תאי שכנים, הפיכת חלבון טאו ילידים לטופס misfolded באמצעות שינוי קונפורמציה בתבניות 11-15. Assay המתואר כאן פותח כדי לזהות פעילות זריעה כגון רגישות. זה תואם עם חלבון רקומביננטי ודגימות ביולוגיות ומאפשר כימות של רמות דקות של פעילות זריעת proteopathic 16. תאי HEK 293T שיציבות להביע ד חוזר טאוomain (RD) המכיל את המוטציה P301S הקשורים למחלות התמזגו או CFP או YFP (להלן כתאי טאו-RD-CFP / YFP) לשמש כbiosensor יציב של פעילות זריעה. בהעדר זרעי proteopathic, התאים לשמור על טאו כמונומר מסיס, ואין להם סריג רקע ניכר. ספיגה ספונטנית או התמרה תיווך liposome של זרעי טאו לתאים, עם זאת, תוצאות בRD-CFP וצבירת RD-YFP, אשר מייצר אות סריג שנמדד בתוך תאים בודדים באמצעות cytometry זרימה. רכיבים רבים של assay זה הונדסו כדי לשפר את הרגישות ולהפחית השתנות. שורת תאים חד שבטי עם יחס של 1: ביטוי RD-CFP / YFP 1 נבחרה, כפי שהיא מספקת אות אופטימלית: רעש. כדי להגביר את הרגישות, פוספוליפידים משמשים להציג זרעים ישירות לתוך תאים (למרות ללמוד מנגנונים ביולוגיים של ספיגה, זה יכול להיות מושמט). לבסוף, cytometry זרימת צגי סריג ברמת אוכלוסייה ותא בודד<html> רמה, שלא כמו מבחני צבירת חלבון אחרים. מדד התוצאה הסופי, צפיפות סריג משולבת, היא כמותי מאוד והחשבונות הן למספר תאים עם צבירה, והמידה שבה צבירה התרחשה בתוך כל תא. כל פרמטרים האופטימליים אלה לשפר את הרגישות ולהבטיח שחזור. מערכת זו הועסקה לאחרונה במחקר מקיף בעכברים מהונדסים tauopathy P301S 17 שהעריך את תחילת הזמן והתקדמות של פעילות ביחס זריעת טאו לסמנים פתולוגיים טאו הנפוץ אחרים (לדוגמא, MC1, AT8, PG5, וThioflavinS). פעילות זריעה היא רחוקה סמן המוקדם וחזק ביותר של פתולוגיה באוניברסיטת תל אביב העריך, שקדמו לגילוי היסטולוגית על ידי לפחות 6 שבועות. פעילות זריעה מופיעה ב 1.5 חודשים ועליות בהדרגה עם גיל, מה שמרמז תפקיד סיבתי של זרעי proteopathic בתחילה ו / או ההתקדמות של ניוון מוחיים 16. e_content &quot;&gt; כימות מדויק של רמות דקות של חומר זרע מדגימות ביולוגיות יכול להקל על מחקרים העוקבים אחר התקדמות מחלה מוקדמת. על ידי קיצור משך משפט ומאפשר שימוש בבעלי החיים צעירים, זה יכול להגביר את היעילות והדיוק של ניסויים בבעלי חיים פרה-קליניים. לדוגמא, ב עכבר P301S שתואר קודם לכן, תרכובות עופרת יכולות להיות מועברות מוקדם ככל 4-6 שבועות (מייד לפני, או בתחילתה של פעילות זריעה), ופיקוח על יעילות 2-4 שבועות לאחר מכן. assay צריך במדויק לכמת הפחתה כלשהי בזריעה פעילות. סריג cytometry זרימה שניתן לבדוק במבחנה יישומי הקרנה גם כן. לדוגמא, ריאגנטים אנטי-טאו (למשל, נוגדנים, מולקולות קטנות, וכו &#39;) במהירות ליכולתם לחסום זריעת אינדוקציה ישירות בתרבות, או באמצעות טאו רקומביננטי אגרגטים או lysates נגזר מוח כמקור זרע (איור 5). עם התקנה זו, מהרגע שחומר זרע מוכן, לשעברperiment לוקח רק שלושה ימים כדי להשלים, כולל ניתוח נתונים. הכימות המהיר של פעילות זריעת proteopathic יכול כך להקל על מחקרים רבים של ניוון של מערכת עצבים.

<table><tbody><tr><td>TBS</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete מעכבי פרוטאז (ללא EDTA)</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-vials</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>איזון אנליטי</td><td>מטלר טולדו</td><td>XSE 105DU</td><td></td></tr><tr><td>סירות שקילה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור חרוטי</td><td>ארה"ב Scientific</td><td>1475-0501</td><td></td></tr><tr><td>Omni Sonic Ruptor הומוגנייזר אולטראסוני</td><td>Omni International</td><td>18-000-115</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-טיפ להומוגנייזר קולי</td><td>Omni International</td><td>OR-T-156</td><td></td></tr><tr><td>2-פרופנול</td><td>פישר מדעי</td><td>A451</td><td></td></tr><tr><td>מבטל רעשים אוזניים</td> אטמי <td>פישר סיינטיפיק</td><td>19-145-412</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>שפופרות 1.5 מ"ל</td><td>ארה"ב Scientific</td><td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.215</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>Phoenix Research</td><td>SS-PH15</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל מאגרים ריאגנטים</td><td>VWR</td><td>41428-954</td><td></td></tr><tr><td>פיפט רב ערוצי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>TI13-690-049</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחות תחתונות שטוחות היטב</td><td>קורנינג</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחות תחתונות עגולות היטב</td><td>קורנינג</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה Sciences</td><td>RT 15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EDTA סיגמא-אולדריץ'</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 40 Thermo</td><td>Scientific</td><td>75004509</td><td></td></tr><tr><td>BIOLiner מתנדנד דלי רוטור</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003796</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>VWR</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant VYB Flow Cytomter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-116</td><td></td></tr><tr><td>Chill 96 Rack</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-459</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח Flow Jo</td><td>Flow Jo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l טיפים פיפט</td><td>Rainin</td><td>GPS-L10</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l טיפים פיפט</td><td>Rainin</td><td>GPS-250</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל קצות פיפט</td><td>Rainin</td><td>GPS-1000</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l טיפים פיפט</td><td>ארה"ב סיינטיפיק</td><td>1111-1800</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפט סרולוגי</td><td>פיניקס מחקר</td><td>SPG-606180</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפט סרולוגי</td><td>פיניקס מחקר</td><td>SPG-607180</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל פיפט סרולוגי</td><td>פיניקס מחקר</td><td>SPG-760180</td><td></td></tr></tbody></table>

איתור רגיש של פעילות זריעת proteopathic עם סריג cytometry הזרימה

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

ראיות הולכות וגדלות תומכות בהתפשטות טרנס-תאית של אגרגטים חלבונים רעילים, או זרעים פרוטאופתיים, כמנגנון להתחלה והתקדמות של פתולוגיה במספר מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר והטאואופתיות הקשורות אליה. התפקיד הפוטנציאלי הקריטי של זרעי טאו בהתקדמות המחלה תומך מאוד בצורך בבדיקה רגישה המזהה בקלות פעילות זריעה בדגימות ביולוגיות. 
על ידי שילוב הספציפיות של העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET), הרגישות של ציטומטריית זרימה ויציבות קו תאים חד שבטי, הונדסה בדיקת זריעה רגישה במיוחד ותואמת לזיהוי זרעים מדגימות רקומביננטיות או ביולוגיות, כולל הומוגנטים של מוח אנושי ועכבר. הבדיקה משתמשת בתאי HEK 293T חד-שבטיים המבטאים ביציבות את תחום החזרה הנוטה לצבירה (RD) של טאו המכיל את מוטציית P301S הקשורה למחלה המאוחה ל-CFP או YFP, המייצרים אות FRET בעת צבירת חלבונים. ספיגת זרעי טאו פרוטאופתיים (אך לא חלבונים אחרים) לתאי החיישן הביולוגי מגרה צבירה של RD-CFP ו-RD-YFP, וזרימה ציטומטרית מנטרת באופן רגיש וכמותי את ה-FRET המושרה על ידי הצבירה. הבדיקה מזהה ריכוזים פמטומולריים (שווה ערך למונומר) של זרעי טאו רקומביננטיים, בעלת טווח דינמי המשתרע על פני שלושה סדרי גודל, ותואמת להומוגנטים במוח מעכברים טרנסגניים מטאואופתיה ונבדקי טאואופתיה אנושיים. עם שינויים קלים, הבדיקה יכולה גם לזהות פעילות זריעה של זרעים פרוטאופתיים אחרים, כגון α-synuclein, והיא תואמת גם לתרביות עצביות ראשוניות. הקלות, הרגישות והישימות הרחבה של ציטומטריית זרימת FRET הופכות את זה לשימושי לחקור מגוון רחב של הפרעות צבירת חלבונים.

סריג cytometry זרימה מאפשר רגיש, כמותי, וזיהוי מהיר של פעילות זריעה מדגימות רקומביננטי או ביולוגיות. התקנת assay היא קלילה: שורות תאי יציבות הנגזר חד שבטיים להביע טאו-RD-CFP / YFP הם transduced עם חומר זרע, טופח במשך 24-48 שעות, ונתונים לניתוח תזרים cytometry (איור 1 א). בהעדר זרעים, תאי biosensor לשמור טאו בצורה מסיסה, monomeric (איור 1). בנוכחות של זרעים, לעומת זאת, תאי biosensor להמיר טאו למדינה מצטברת (איור 1 ג), ייצור תגובת ס...

העברה מתא לתא של אגרגטים חלבונים, או זרעים פרוטאופתיים, עשויה להיות הבסיס להתקדמות הפתולוגיה במחלות ניווניות. כאן, מתוארת בדיקת ציטומטריית זרימת FRET חדשה המאפשרת זיהוי ספציפי ורגיש של פעילות זריעה מדגימות רקומביננטיות או ביולוגיות.

איתור רגיש של פעילות זריעת Proteopathic עם סריג cytometry הזרימה

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות פעילות זריעה (seeding activity) פרוטופתית ממקורים רקומביננטיים או ביולוגיים, מה שמאפשר זיהוי רגיש של חלבונים, אגרגטים ודגימות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום של ניוון עצבי. לדוגמה, כיצד ניתן להעריך באופן כמותי שינויים בפעילות הזריעה בעקבות התערבות טיפולית במודלים של מחלה בבעלי חיים?היתרונות של טכניקה זו כוללים ספציפיות גבוהה כלפי רמות נמוכות של אגרגטים של חלבונים. ספציפיות יוצאת דופן, קלות שימוש ותפוקה גבוהה. את הפרוצדורה אדגים היום יחד עם השותף לכתיבה, Brandon Holmes.להכנת חומר הזרע הביולוגי, התחילו בשקילה של רקמת מוח קפואה בתוך סירה לבדיקה חד-פעמית. לאחר מכן, העבירו את הרקמה לשפופרת קונית, הוסיפו תמיסת באפר להומוגניזציה קרה מאוד, כך שהתמיסה הסופית תהיה בריכוז 10% לנפח, והעבירו את הדגימות לחדר קירור על קרח. לאחר מכן, כווןו את הפרובה להגדרות המתאימות ושטפו את דפנותיה ואת תחתיתה של הפרובה.שטוף את קצה המחוון שלוש פעמים כפי שהודגא, תוך ניגוב המחוון בין כל תמיסה. כאשר המחוון מוכן, טבול את הקצה בתוך בופר ההומוגניזציה של דגימה אחת והפעל את הסוניקציה כך שיימסרו 25 פולסים בסך הכל. כאשר הרקמה נמצאת בתשסיה מלאה, סבב את ההומוגנאט במערך צנטריפוגלי והעבר את העילאי למבחנה נקייה.יש להיזהר לא להפריע לחך. בעוד שקיימות טכניקות הומוגניזציה רבות אחרות, התהליך הנוכחי עדיף לבידוד כמויות קטנות של זרעי protio pathic מדגימות ביולוגיות. הדיסוסיאציה המכנית מאפשרת פירוק עקבי ויעיל של הרקמה ולאחריו חילוץ הזרעים.לאחר מכן, חלק את העל-מנת (supine) למנובות ושמור את הליזטים בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. כדי להעביר את תאי הביוסנסור בתנאים סטריליים, שטוף כל שורה של תאים ב-PBS חם, ולאחר מכן בצע אינקובציה של שלוש דקות עם trypsin EDTA. כאשר התאים ניתקו, עצור את התגובה באמצעות מדיום תרבית חם והעבר מיד את התאים לפרועת קונית.סנטריפוגו את התאים התלויים, והשביו את המשקע במצע טרי. לאחר מכן, ספרו את התאים והכינו תמיסה מרוכזת (master mix) של דילול תאים בריכוז של 3,500,000 תאים ל-13 מיליליטר של מצע. באמצעות פיפט רב-ערוצי, העבירו באיטיות 130 microliters מהתאים לכל באר בלוח 96 בארות בעל תחתית שטוחה המטופל לתרביות רקמה, תוך הקפדה להניח את קצות הפיפט במרכז הבארות מבלי לגעת בתחתית הלוח.לאחר זריעת התאים, יש להניח להם להשקיע ללא הפרעה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להדגיר את הפלטה למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C, 5% carbon dioxide ולחות יחסית של 80% או יותר. למחרת, כאשר תאי הביו-סנסור מגיעים למנח של 60% עד 65% confluent, יש לשלב מצע עם סרום מופחת, ריאגנט ליפוזומים ומקור זריעה ביולוגי כדי ליצור קומפלקסים של טרנסדוקציה. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה כדי להוסיף 20 µL של קומפלקס הטרנסדוקציה לאורך הדופן של כל באר ביו-סנסור בנפרד, והחזירו את התאים המטופלים לאנקובטור למשך 24 עד 48 שעות נוספות לפני הקציר.תאים שלא טופלו יראו פלואורסצנציה דיפוזית בלבד. עם זאת, תאים שטופלו בחומרי זריעה של tau יראו אגרגטים בהירים. לאחר יום עד יומיים, כדי לקצור את התאים, החליפו את מצע תרבית התאים ב-50 µL של trypsin EDTA, ובכך עצרו את התגובה. לאחר חמישה דקות עם 150 µL של מצע תרבית מקורר, העבירו מיד את התאים לצלחת בעלת 96 בארות עם תחתית עגולה וצרו משקע של התאים, שאבו את העלונות מבלי להפריע למשקעים, ולאחר מכן השעו בעדינות אך ביסודיות את התאים ב-50 µL של 2% paraformaldehyde למשך 10 דקות.לאחר מכן, סובבו שוב את התאים במערך צנטריפוגה ותשחקו את המשקעים ב-200 microliters של תמיסת בופר קרה לציטומטריה זרימתית בהקדם האפשרי. לאחר הקיבוע, טענו את הפלטה לציטומטר זרימתי תואם-fret וייצרו תרשים של שטח פיזור צדי (side scatter area) מול שטח פיזור קדמי (forward scatter area) לפי וריאנט. לאחר מכן, בעוד שקו תאי מספר אחת פועל, כווןנו את מתחי הפיזור הצדי והפיזור הקדמי עד שאוכלוסיית התאים תהיה ברבע השמאלי התחתון.לאחר מכן, באמצעות כלי הפוליגון, הגדירו את אוכלוסיית התאים כשער P1. כעת, צרו תרשים פיזור של גובה הפיזור קדימה (forward scatter height) לעומת שטח הפיזור קדימה (forward scatter area) והחילו את שער P1. לאחר מכן, הגדירו את התאים הבודדים כשער P2 וצרו היסטוגרמה אחת עבור כל אחד.עבור מסנני C-F-P-Y-F-P ו-fret, החילו את שער P על שתי עד שלוש היסטוגרמות שונות, אחת עבור כל אחד ממסנני C-F-P-Y-F-P ו-fret לצורך פיצוי (compensation). הוסיפו 30 µL של תרחיף של cell line one לתוך 200 µL של תרחיף של cell line two. לאחר מכן, לחצו על סמל הגדרות המכשיר, ולאחר מכן על לשונית הפיצוי (compensation) וסמנו את matrix כדי לפתוח את טבלת הפיצוי.צרו תרשים של שטח FRET לעומת שטח CFP לפי משתנה והפילו את שער P2. לאחר מכן, כאשר קו תאים 1 וקו תאים 2 פועלים, לחצו על סמל הרביעים ושרטטו רביעים כך שהאוכלוסיות הפלואורסצנטיות השליליות והחיוביות יופרדו על ידי שני הרביעים התחתונים. כעת צרו טבלת סטטיסטיקה המציגה את עוצמת הפלואורסצנציה החציונית (MFI) של FRET עבור השערים LL3 ו-LR3, וכוונו את פרמטר ה-FRET במטריצת הפיצוי עד שערך ה-MFI של אות ה-FRET יהיה שווה בקירוב בין LL3 ל-LR3.בשלב הבא, צור גרף פיזור של שטח YFP לעומת שטח CFP עם רבעים (quadrants). כוון את פרמטר ה-YFP במטריצת הפיצוי עד שה-MFI של אות ה-YFP יהיה שווה בקירוב בין הרבעים, באופן דומה למה שהוצג קודם לכן עבור ציטומטריה זרימה של FRET.זליגת הפלואורסצנציה העיקרית מתרחשת כאשר CFP נפלט לערוץ הגילוי של ה-fret, שניתן לתקן באמצעות פיצוי פלואורסצנציה (fluorescence compensation) באמצעות תאי בקרת חיוביים של צבע בודד. כאשר כל השערים (gates) נקבעו ואות ה-CFP עבר פיצוי, סמנו את הבארות הרלוונטיות והריצו את שאר הפלטה כדי לנתח את הנתונים. ראשית, הגדירו את התאים ואת התאים הבודדים באמצעות אותם פרמטרים המשמשים להגדרת ניתוח הזרימה.בשלב הבא, באמצעות שורת תאים מספר שלוש, שרטטו את התאים החיוביים בודדים ל-YFP בגרף של fret מול YFP לפי וריאנט. שרטטו שער פוליגונלי העובר לאורך ובמרחק מהשיפוע של אוכלוסיית התאים החיוביים ל-fret כדי להגדיר שער fret שגוי, אשר שולל זליגה של YFP למסנן ה-fret. לאחר יישום שער ה-fret השגוי על כל הדגימות, שרטטו את תאי ה-C-F-P-Y-F-P שטופלו בליפוזומים ריקים בגרף של fret מול CFP לפי וריאנט, והכניסו שער פוליגונלי לאורך שיפוע האוכלוסייה הנמתח כלפי מעלה ושמאלה, הרחק מהאוכלוסייה.כל האירועים שמעתקים אל תוך שער זה נחשבים לחיוביים ל-fret, ואחוז התאים יהיה במתאם עם תר ঘনত্ব הזרעים ששימשה במהלך הטיפול. לבסוף, רשמו את פרמטרי האנליזה הרלוונטיים, כולל אחוז החיוביות ל-fret ועצימות הפלואורסצנציה החציונית (MFI) של התאים החיוביים ל-fret. לאחר מכן, חשבו את המכפלה של אחוז החיוביות וה-MFI כדי לחשב ידנית את צפיפות ה-fret המשולבת.בהיעדר אגרגטים או גרעיני tau, חלבון ה-tau נשמר במצב מונומרי מסיס, כפי שבא לידי ביטוי באות פלואורסצנציה דיפוזי ועקבי השלילי ל-FRET. בעקבות הכנסת גרעיני tau לתאי הביו-סנסור, חלבון tau אנדוגני עובר המרה למצב אגרגטי וחיובי ל-FRET, כפי שניתן לראות בכמות ה-FRET. ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה מאשר כי ריכוזים של recombinant tau ברמה של femto molar מספיקים לצורך הגילוי כאן.רקמת גזע המוח מעכברי טאופתיה שהוקריבו בגילאים שונים, משמשת כאזור מוח מייצג המדגים זיהוי עקבי של פעילות זריעה (seeding activity) בכל החיות כבר מגיל 1.5 חודשים. בניסוי זה, הומוגנאט מוח מנבדקי מחלת אלצהיימר הפגין פעילות זריעה חזקה, בעוד שנבדקי ביקורת תואמי גיל ונבדקים עם מחלת הטינגטון לא הפגינו זאת, מה שמעיד על ספציפיות הבדיקה לאגרגטים של tau. תרביות נוירונים ראשוניות לא מטופלות שעברו טרנסדוקציה של קונסטרוקטים לנטיוירליים של tau-CFP ו-tau-YFP הפגינו אות פלואורסצנטי מפוזר לאחר טיפול בזרעי tau רקומביננטיים.עם זאת, tau אנדוגני יוצר אגרגטים גדולים הניתנים לזיהוי באמצעות פלוו-ציטומטריה בשיטת FRET, גם בהיעדר טרנסדוקציה המתווכת על ידי ליפוזומים. כאשר מקורות הזרעים עוברים דגירה מוקדמת עם תרופות המעכבות ספיגת tau, כגון heparin, ומטופלים בהיעדר ליפוזומים, ניתן לחסום את פעילות ההזרעה המכילה הן דגימות recombinant fis והן דגימות ממוח של עכברים עם tauopathy. לאחר השליטה בטכניקה.ניתן להשלים טכניקה זו בתוך שלושה ימים, כאשר בכל יום נדרשות שעה עד שעתיים בלבד של עבודה במעבדה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שיהיה צורך באופטימיזציה פנימית עבור שלבים מסוימים. לדוגמה, בעת קביעת טטרים יעילים מזרעים פתוגניים ממקורים ביולוגיים שונים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו יש להקים, להריץ ולנתח ניסויי FRET flow cytometry למטרות זיהוי פעילות זריעה פתוגנית (protio pathic seeding) ממקורות רקומביננטיים וביולוגיים.

sensitive-detection-proteopathic-seeding-activity-with-fret-flow

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיטת ה-IP FCM מוצג, המאפשר רגיש, הערכה החזקה, ביוכימיות של חלבונים אינטראקציות הילידים, ללא צורך בהנדסה גנטית או גודל מדגם גדול.

IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

הסרטון מדגים שיטה אימונולוגית לניטור in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte או CTL production. עכבר מוזרק מראש עם לימפוציטים CD8+ T מהונדסים גנטית, מוכתמים בצבע מתרבים. הזרקה תת עורית של אובלבומין עם אדג'ובנטים מייצרת לימפוציטים ציטוטוקסיים CD8+ T המזוהים לאחר הקציר באמצעות אימונוסטיין וציטומטריית זרימה.

טכניקה אימונולוגית לניטור יצירת לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T בתיווך אדג'ובנטי

הסרטון מדגים בדיקת ציטומטריית זרימה של זרימת תהודה פלואורסצנטית (FRET) כדי לזהות את פעילות הזריעה של אגרגטים חלבוניים שבודדו מדגימות ביולוגיות. תאי יונקים המבטאים חלבוני טאו ריפורטר מודגרים בקומפלקסים של התמרה ליפוזומלית המכילים זרעי טאו. זרעים אלה מתווכים את הצבירה של חלבוני הכתב, מה שמוביל ליצירת אות חיובי FRET בציטומטר הזרימה.

טכניקת ציטומטריה של זרימת FRET לזיהוי צבירת חלבוני כתב המושרה על ידי זרעי טאו

שתואר כאן הוא שיטה לאיתור וללכמת חלבוני קרום חיצוני של המיטוכונדריה ידי immunolabeling של מיטוכונדריה מבודדת מרקמת מכרסמים וניתוח על ידי cytometry זרימה. שיטה זו ניתנת להארכה על מנת להעריך היבטים פונקציונליים של אוכלוסיות המיטוכונדריה.

Immunodetection של החלבונים בממברנה חיצוניים על ידי cytometry הזרימה של מיטוכונדריה מבודדת

שיטות שונות רבות קיימות למדידה של שלפוחית ​​תאית (EVS) באמצעות cytometry זרימה (FCM). כמה היבטים יש לשקול בעת קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. שני פרוטוקולים לכלי רכב חשמליים מדידה מוצגים, או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז.

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

בעוד מחלחלים מקרופאגים הם גויסו ללא הרף רקמות מבוגר מ מבשר במחזור, מקרופאגים תושב זרע הרקמה שלהם במהלך הפיתוח, שם הם מתוחזקים ללא קלט נוסף של אבות. אבות של מקרופאגים תושב זוהו לאחרונה. כאן, אנו מציגים שיטות למיפוי גורל גנטי של אבות מקרופאגים תושב.

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

הציגו כאן הוא פרוטוקול למדידת תאים מתרבים CD4+ T בתגובה לחלבונים אנטיגניים או פפטידים באמצעות דילול צבען. שיטת הפעולה רגישה במיוחד לתאי T נדירים הספציפיים לאנטיגן וניתן לשנותם כדי להקל על השכפול של תאים ספציפיים לאנטיגן.

קוונפיקציה של מתרבים אנטיגן אנושי-ספציפי CD4+ T תאים באמצעות Carboxyפלואורומיתאת הדיקן אסתר

מאמר זה מתאר זרימה מבוססת-סריג cy, מבוסס הפרוטוקול כדי לכמת הרכבה עצמית חלבון בשני S. cerevisiae ס ו HEK293T תאים.

גילוי ואפיון הרכבה עצמית של חלבון בVivo על-ידי הזרמת הקיטומטל

צעד הכרחי בפיתוח אפטמר נגד סרטן הוא לבחון את קשירתו למטרה. אנו מדגימים בדיקה מבוססת ציטומטריה של זרימה כדי לחקור את הקשירה הזו, תוך הדגשת החשיבות של הכללת אפטמר בקרה שלילית ותאים סרטניים חיוביים או שליליים עבור אותו חלבון מסוים.

בדיקת קשירה של חלבון פני התא המבוסס על ציטומטריה של זרימה להערכת סלקטיביות וספציפיות של אפטמר אנטי-סרטני

פרוטוקול זה מתאר שיטת סינון מבוססת ציטומטריה של זרימה בתפוקה גבוהה לזיהוי תרופות במולקולות קטנות המעכבות הפעלת אינטגרין β2 על נויטרופילים אנושיים.

טכניקת תפוקה גבוהה מבוססת ציטומטריה של זרימה לבדיקת תרופות מעכבות אינטגרין

כאן, מתוארת שיטה מבוססת ציטומטריית פוספופלואו לניתוח איתות במורד הזרם של מסלולי mTORC1, JAK/STAT5 ו-MAPK בתאי לוקמיה מיאלואידית אנושית חריפה שהושתלו בעכברים ומתקבלים מאספיראטים של מח עצם. רמות p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 ו-p-ERK1/2 נמדדות בו זמנית באמצעות ציטומטר זרימה ספקטרלי מהדור הבא עם רגישות גבוהה.

ציטומטריית פוספו-פלואו תוך-תאית של השתלות קסנו-השתלות שמקורן בלוקמיה מיאלואידית חריפה

למד לזהות פעילות זריעה פרוטאופתית באמצעות שיטת FRET cytometry זרימה. שיטה זו מאפשרת גילוי רגיש של צבירי חלבון בדגימות ביולוגיות ורקומביננטיות לחקר מחלות נוירודגנרטיביות.

איתור רגיש של פעילות זריעת Proteopathic עם סריג cytometry הזרימה

גלה סרטונים נוספים