איתור רגיש של פעילות זריעת Proteopathic עם סריג cytometry הזרימה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות פעילות זריעה (seeding activity) פרוטופתית ממקורים רקומביננטיים או ביולוגיים, מה שמאפשר זיהוי רגיש של חלבונים, אגרגטים ודגימות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום של ניוון עצבי. לדוגמה, כיצד ניתן להעריך באופן כמותי שינויים בפעילות הזריעה בעקבות התערבות טיפולית במודלים של מחלה בבעלי חיים?

היתרונות של טכניקה זו כוללים ספציפיות גבוהה כלפי רמות נמוכות של אגרגטים של חלבונים. ספציפיות יוצאת דופן, קלות שימוש ותפוקה גבוהה. את הפרוצדורה אדגים היום יחד עם השותף לכתיבה, Brandon Holmes.

להכנת חומר הזרע הביולוגי, התחילו בשקילה של רקמת מוח קפואה בתוך סירה לבדיקה חד-פעמית. לאחר מכן, העבירו את הרקמה לשפופרת קונית, הוסיפו תמיסת באפר להומוגניזציה קרה מאוד, כך שהתמיסה הסופית תהיה בריכוז 10% לנפח, והעבירו את הדגימות לחדר קירור על קרח. לאחר מכן, כווןו את הפרובה להגדרות המתאימות ושטפו את דפנותיה ואת תחתיתה של הפרובה.

שטוף את קצה המחוון שלוש פעמים כפי שהודגא, תוך ניגוב המחוון בין כל תמיסה. כאשר המחוון מוכן, טבול את הקצה בתוך בופר ההומוגניזציה של דגימה אחת והפעל את הסוניקציה כך שיימסרו 25 פולסים בסך הכל. כאשר הרקמה נמצאת בתשסיה מלאה, סבב את ההומוגנאט במערך צנטריפוגלי והעבר את העילאי למבחנה נקייה.

יש להיזהר לא להפריע לחך. בעוד שקיימות טכניקות הומוגניזציה רבות אחרות, התהליך הנוכחי עדיף לבידוד כמויות קטנות של זרעי protio pathic מדגימות ביולוגיות. הדיסוסיאציה המכנית מאפשרת פירוק עקבי ויעיל של הרקמה ולאחריו חילוץ הזרעים.

לאחר מכן, חלק את העל-מנת (supine) למנובות ושמור את הליזטים בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. כדי להעביר את תאי הביוסנסור בתנאים סטריליים, שטוף כל שורה של תאים ב-PBS חם, ולאחר מכן בצע אינקובציה של שלוש דקות עם trypsin EDTA. כאשר התאים ניתקו, עצור את התגובה באמצעות מדיום תרבית חם והעבר מיד את התאים לפרועת קונית.

סנטריפוגו את התאים התלויים, והשביו את המשקע במצע טרי. לאחר מכן, ספרו את התאים והכינו תמיסה מרוכזת (master mix) של דילול תאים בריכוז של 3,500,000 תאים ל-13 מיליליטר של מצע. באמצעות פיפט רב-ערוצי, העבירו באיטיות 130 microliters מהתאים לכל באר בלוח 96 בארות בעל תחתית שטוחה המטופל לתרביות רקמה, תוך הקפדה להניח את קצות הפיפט במרכז הבארות מבלי לגעת בתחתית הלוח.

לאחר זריעת התאים, יש להניח להם להשקיע ללא הפרעה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להדגיר את הפלטה למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C, 5% carbon dioxide ולחות יחסית של 80% או יותר. למחרת, כאשר תאי הביו-סנסור מגיעים למנח של 60% עד 65% confluent, יש לשלב מצע עם סרום מופחת, ריאגנט ליפוזומים ומקור זריעה ביולוגי כדי ליצור קומפלקסים של טרנסדוקציה. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה כדי להוסיף 20 µL של קומפלקס הטרנסדוקציה לאורך הדופן של כל באר ביו-סנסור בנפרד, והחזירו את התאים המטופלים לאנקובטור למשך 24 עד 48 שעות נוספות לפני הקציר.

תאים שלא טופלו יראו פלואורסצנציה דיפוזית בלבד. עם זאת, תאים שטופלו בחומרי זריעה של tau יראו אגרגטים בהירים. לאחר יום עד יומיים, כדי לקצור את התאים, החליפו את מצע תרבית התאים ב-50 µL של trypsin EDTA, ובכך עצרו את התגובה. לאחר חמישה דקות עם 150 µL של מצע תרבית מקורר, העבירו מיד את התאים לצלחת בעלת 96 בארות עם תחתית עגולה וצרו משקע של התאים, שאבו את העלונות מבלי להפריע למשקעים, ולאחר מכן השעו בעדינות אך ביסודיות את התאים ב-50 µL של 2% paraformaldehyde למשך 10 דקות.

לאחר מכן, סובבו שוב את התאים במערך צנטריפוגה ותשחקו את המשקעים ב-200 microliters של תמיסת בופר קרה לציטומטריה זרימתית בהקדם האפשרי. לאחר הקיבוע, טענו את הפלטה לציטומטר זרימתי תואם-fret וייצרו תרשים של שטח פיזור צדי (side scatter area) מול שטח פיזור קדמי (forward scatter area) לפי וריאנט. לאחר מכן, בעוד שקו תאי מספר אחת פועל, כווןנו את מתחי הפיזור הצדי והפיזור הקדמי עד שאוכלוסיית התאים תהיה ברבע השמאלי התחתון.

לאחר מכן, באמצעות כלי הפוליגון, הגדירו את אוכלוסיית התאים כשער P1. כעת, צרו תרשים פיזור של גובה הפיזור קדימה (forward scatter height) לעומת שטח הפיזור קדימה (forward scatter area) והחילו את שער P1. לאחר מכן, הגדירו את התאים הבודדים כשער P2 וצרו היסטוגרמה אחת עבור כל אחד.

עבור מסנני C-F-P-Y-F-P ו-fret, החילו את שער P על שתי עד שלוש היסטוגרמות שונות, אחת עבור כל אחד ממסנני C-F-P-Y-F-P ו-fret לצורך פיצוי (compensation). הוסיפו 30 µL של תרחיף של cell line one לתוך 200 µL של תרחיף של cell line two. לאחר מכן, לחצו על סמל הגדרות המכשיר, ולאחר מכן על לשונית הפיצוי (compensation) וסמנו את matrix כדי לפתוח את טבלת הפיצוי.

צרו תרשים של שטח FRET לעומת שטח CFP לפי משתנה והפילו את שער P2. לאחר מכן, כאשר קו תאים 1 וקו תאים 2 פועלים, לחצו על סמל הרביעים ושרטטו רביעים כך שהאוכלוסיות הפלואורסצנטיות השליליות והחיוביות יופרדו על ידי שני הרביעים התחתונים. כעת צרו טבלת סטטיסטיקה המציגה את עוצמת הפלואורסצנציה החציונית (MFI) של FRET עבור השערים LL3 ו-LR3, וכוונו את פרמטר ה-FRET במטריצת הפיצוי עד שערך ה-MFI של אות ה-FRET יהיה שווה בקירוב בין LL3 ל-LR3.

בשלב הבא, צור גרף פיזור של שטח YFP לעומת שטח CFP עם רבעים (quadrants). כוון את פרמטר ה-YFP במטריצת הפיצוי עד שה-MFI של אות ה-YFP יהיה שווה בקירוב בין הרבעים, באופן דומה למה שהוצג קודם לכן עבור ציטומטריה זרימה של FRET.

זליגת הפלואורסצנציה העיקרית מתרחשת כאשר CFP נפלט לערוץ הגילוי של ה-fret, שניתן לתקן באמצעות פיצוי פלואורסצנציה (fluorescence compensation) באמצעות תאי בקרת חיוביים של צבע בודד. כאשר כל השערים (gates) נקבעו ואות ה-CFP עבר פיצוי, סמנו את הבארות הרלוונטיות והריצו את שאר הפלטה כדי לנתח את הנתונים. ראשית, הגדירו את התאים ואת התאים הבודדים באמצעות אותם פרמטרים המשמשים להגדרת ניתוח הזרימה.

בשלב הבא, באמצעות שורת תאים מספר שלוש, שרטטו את התאים החיוביים בודדים ל-YFP בגרף של fret מול YFP לפי וריאנט. שרטטו שער פוליגונלי העובר לאורך ובמרחק מהשיפוע של אוכלוסיית התאים החיוביים ל-fret כדי להגדיר שער fret שגוי, אשר שולל זליגה של YFP למסנן ה-fret. לאחר יישום שער ה-fret השגוי על כל הדגימות, שרטטו את תאי ה-C-F-P-Y-F-P שטופלו בליפוזומים ריקים בגרף של fret מול CFP לפי וריאנט, והכניסו שער פוליגונלי לאורך שיפוע האוכלוסייה הנמתח כלפי מעלה ושמאלה, הרחק מהאוכלוסייה.

כל האירועים שמעתקים אל תוך שער זה נחשבים לחיוביים ל-fret, ואחוז התאים יהיה במתאם עם תר ঘনত্ব הזרעים ששימשה במהלך הטיפול. לבסוף, רשמו את פרמטרי האנליזה הרלוונטיים, כולל אחוז החיוביות ל-fret ועצימות הפלואורסצנציה החציונית (MFI) של התאים החיוביים ל-fret. לאחר מכן, חשבו את המכפלה של אחוז החיוביות וה-MFI כדי לחשב ידנית את צפיפות ה-fret המשולבת.

בהיעדר אגרגטים או גרעיני tau, חלבון ה-tau נשמר במצב מונומרי מסיס, כפי שבא לידי ביטוי באות פלואורסצנציה דיפוזי ועקבי השלילי ל-FRET. בעקבות הכנסת גרעיני tau לתאי הביו-סנסור, חלבון tau אנדוגני עובר המרה למצב אגרגטי וחיובי ל-FRET, כפי שניתן לראות בכמות ה-FRET. ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה מאשר כי ריכוזים של recombinant tau ברמה של femto molar מספיקים לצורך הגילוי כאן.

רקמת גזע המוח מעכברי טאופתיה שהוקריבו בגילאים שונים, משמשת כאזור מוח מייצג המדגים זיהוי עקבי של פעילות זריעה (seeding activity) בכל החיות כבר מגיל 1.5 חודשים. בניסוי זה, הומוגנאט מוח מנבדקי מחלת אלצהיימר הפגין פעילות זריעה חזקה, בעוד שנבדקי ביקורת תואמי גיל ונבדקים עם מחלת הטינגטון לא הפגינו זאת, מה שמעיד על ספציפיות הבדיקה לאגרגטים של tau. תרביות נוירונים ראשוניות לא מטופלות שעברו טרנסדוקציה של קונסטרוקטים לנטיוירליים של tau-CFP ו-tau-YFP הפגינו אות פלואורסצנטי מפוזר לאחר טיפול בזרעי tau רקומביננטיים.

עם זאת, tau אנדוגני יוצר אגרגטים גדולים הניתנים לזיהוי באמצעות פלוו-ציטומטריה בשיטת FRET, גם בהיעדר טרנסדוקציה המתווכת על ידי ליפוזומים. כאשר מקורות הזרעים עוברים דגירה מוקדמת עם תרופות המעכבות ספיגת tau, כגון heparin, ומטופלים בהיעדר ליפוזומים, ניתן לחסום את פעילות ההזרעה המכילה הן דגימות recombinant fis והן דגימות ממוח של עכברים עם tauopathy. לאחר השליטה בטכניקה.

ניתן להשלים טכניקה זו בתוך שלושה ימים, כאשר בכל יום נדרשות שעה עד שעתיים בלבד של עבודה במעבדה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שיהיה צורך באופטימיזציה פנימית עבור שלבים מסוימים. לדוגמה, בעת קביעת טטרים יעילים מזרעים פתוגניים ממקורים ביולוגיים שונים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו יש להקים, להריץ ולנתח ניסויי FRET flow cytometry למטרות זיהוי פעילות זריעה פתוגנית (protio pathic seeding) ממקורות רקומביננטיים וביולוגיים.