Caspase-3 פעילות באמיגדלה העכברוש נמדד על ידי Spectrofluorometry לאחר אוטם שריר הלב

אוטם שריר הלב (MI) מלווה לא רק בתפקוד לב לקוי אלא גם באפופטוזיס באמיגדלה, אזור במוח המעורב בהשלכות ההתנהגותיות של MI. פרוטוקול זה מתאר כיצד לגרום ל-MI, לאסוף רקמת אמיגדלה ולמדוד בה פעילות קספאז-3, סמן לאפופטוזיס.

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את פעילות הקספאז-3 באמיגדלה של החולדה לאחר אוטם שריר הלב באמצעות ספקטרופלואורומטריה. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח ההתנהגותיים, כגון ההשלכות של אוטם שריר הלב על ביצועים קוגניטיביים, בריאות הנפש, תהליך ההזדקנות והשינה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה, מהירה ואמינה.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהיא דורשת מיומנות לניתוח ודגימת רקמות. מי שתדגים את ההליך היא קים גילברט, עוזרת מחקר במעבדה שלנו. לאחר השראת הרדמה על פי פרוטוקולים מוסדיים מאושרים, יש לאשר הרדמה נכונה באמצעות היעדר רפלקס צביטת הכפות.

החדרו את החולדה עם צינורות אנדוטרכיאליים והניחו את החיה במצב דקוביטוס הגחוני על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף על 37 מעלות צלזיוס. חבר את הצינור האנדוטרכיאלי למכונת הרדמה המחלקת 2% איזופלואורן. לאחר מכן, הכינו את אתר הניתוח עם כלורהקסידין גלוקונאט ואלכוהול איזופרופיל.

ולמרוח משחת עיניים על שתי העיניים למניעת יובש. הניחו וילון סטרילי על החיה כדי ליצור שדה סטרילי סביב אתר הניתוח. והניחו את מכשירי הניתוח הסטריליים הנדרשים על שדה סטרילי אחר ליד החיה.

לאחר מכן, חתכו את העור בעזרת להב אזמל מספר 10 או מספריים. השתמש במספריים או מהדק המוסטטי כדי לקלף את רקמת השריר. לאחר מכן השתמש במספריים או מהדק המוסטטי כדי לפתוח את דופן בית החזה ולמקם את מפסק החזה, ופתח את קרום הלב עם המהדק ההמוסטטי.

כדי לגרום לחסימה כלילית, תחילה לולאה תפר משי באורך 360 מילימטר ארבעה אפס סביב העורק הכלילי היורד ודרך רקמת שריר הלב הרציפה. הכנס את שני הקצוות של תפר המשי לצינור פלסטיק בגודל 14 באורך 1.25 סנטימטר. משוך את שני קצוות תפר המשי ודחף את הצינור כלפי מטה כנגד העורק כדי לחסום אותו.

אבטח את החסימה על ידי clampצינור הפלסטיק עם clamp המוסטטי ושמור על החסימה למשך 40 דקות. לאחר 40 דקות, שחרר את הסתימה על ידי הסרת המהדק ההמוסטטי ולאחר מכן את הצינור הגמיש ותפר המשי. סגור את בית החזה עם שני תפרים אפס והנח קטטר גמיש דרך חלל בית החזה ושאב אוויר מבית החזה עם מזרק של 10 מיליליטר כדי למנוע פנאומוטורקס.

תפר את השריר בארבעה תפרים אפס משי ואת העור בשלושה תפרים אפס משי. לפני סגירת תפר העור האחרון, שאבו שוב אוויר מבית החזה באמצעות מזרק 10 מיליליטר וקטטר. סיים לסגור את העור ולאחר מכן עצור את האיזופלואורן.

הניחו את החולדה בכלוב נקי ועקבו אחר ההתאוששות מההרדמה. יש לתת משככי כאבים במינון חוזר כל שמונה שעות. לאחר עריפת ראש החיה באופן הומני על פי נהלים מאושרים, הניחו את ראש החולדה על צלחת המונחת על קרח כתוש.

השתמש במספריים כדי לפתוח את הגולגולת. לאחר מכן השתמש ב-rongeurs כדי לנתק את אלומות העצם מבלי לפגוע ברקמה הבסיסית על ידי משיכה כלפי מעלה. לאחר מכן, הניחו את הלהב השטוח של מרית בין החלק התחתון של הגולגולת לבין הגחון האחורי של המוח, ונתקו את המוח מהגולגולת על ידי דחיפה עדינה של הלהב קדימה, תוך הרמת המוח החוצה מהגולגולת.

הניחו את המוח על פני הגב שלו. זהה את ההיפותלמוס מול המוח הקטן וחתוך את המוח באופן קורונלי מול הקצה האחורי של ההיפותלמוס וגם מאחורי הקצה הקדמי. זהה את האמיגדלה הדו-צדדית כשני כדורים קטנים מתחת לאונות הטמפורליות ממש ליד ההיפותלמוס.

לאחר מכן הפוך את המוח שטוח בקצהו הקדמי כשפני השטח הגביים הרחק מהנסיין. לאחר מכן, הפרד את חצאי הכדור והסר את קליפת המוח מהאמיגדלה הרציפה. כאשר האמיגדלה מתגלה, חתכו את האמיגדלה בעזרת אזמל.

חותכים לאורך התפר הכהה העובר על פני האמיגדלה כדי להפריד בין החלקים הבסיסיים והמדיאליים המרכזיים ואז מניחים את שני החלקים בצינורות מסומנים נפרדים על קרח. שלב זה צריך להיעשות מהר ככל האפשר כדי למנוע הידרדרות של אנזימים. לאחר חזרה על הליך החיתוך עם חצי הכדור השני, טבלו את כל ארבעת הבקבוקונים בחנקן נוזלי למשך דקה אחת ולאחר מכן אחסנו במקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס.

התחל בהוספת 150 מיקרוליטר של מאגר ליזה לכל חמישה עד 10 מיליגרם של דגימה על קרח. סוניקציה של כל דגימה על קרח בעוצמה מקסימלית למשך חמש שניות. לאחר מכן דגרו על קרח למשך 30 דקות.

במהלך הדגירה, מערבל את הדגימה למשך חמש שניות כל חמש דקות. לאחר מכן, בצע שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה על ידי הנחת דגימות לסירוגין בחנקן נוזלי ועל צלחת חימום מבוקרת תרמוסטטית המוגדרת ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מחזור ההפשרה הסופי בהקפאה, צנטריפוגה את דגימות הרקמה ב-1300 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר מכן, שאפו בזהירות את הסופרנטנט והעבירו לצינור טרי על קרח. לאחר כימות החלבון על פי ההוראות בפרוטוקול הכתוב, יש להוסיף 25 מיקרוגרם חלבון לצינור תגובה המכיל 0.8 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי Ac-DEVD-AMC ומאגר תגובה לנפח סופי של 200 מיקרוליטר. עבור דגימות תגובה שלילית, שלב 25 מיקרוגרם חלבון עם מיקרוליטר אחד של 800 מיקרו-מולרי Ac-DEVD-CHO ו-0.8 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי Ac-DEVD-AMC.

דגרו על כל הדגימות והבקרות בחושך למשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שחלף זמן הדגירה, עצור את התגובה עם 600 מיקרוליטר של 0.4 גליצין מולרי ו-0.4 נתרן הידרוקסיד מולרי ב-pH 10 בכל דגימה ובקרה. הוסף שני מיליליטר מים מזוקקים לכל תגובה בקוביית זכוכית.

כימות הקרינה על ידי ספקטרופלואורומטריה. קרא בקרות ודגימות במשך 10 שניות עם קריאה אחת בכל שנייה. לבסוף, כמת פעילות ספציפית בכל דגימה בהתאם לנוסחה המוצגת כעת על המסך.

היסטוגרמה זו מציגה פעילות caspase-3 באמיגדלה של חולדות שעברו אוטם שריר הלב. הנתונים מבוטאים כאחוז הפעילות הממוצעת בבקרות דמה שנקבעו ל-100%כל קבוצה כללה שמונה חולדות. הכוכבית מציינת הבדל מובהק בין הקבוצות עם ערך p של פחות מ-0.05.

לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבע שעות, לא כולל המרווח בין ניתוח אוטם שריר הלב לדגימת רקמות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לגרום לאוטם שריר הלב בחולדה ולמדוד את פעילות הקספאז-3 באמיגדלה של החולדה באמצעות ספקטרופלואורומטריה.