Caspase-3 פעילות באמיגדלה העכברוש נמדד על ידי Spectrofluorometry לאחר אוטם שריר הלב

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד את פעילות ה-caspase-3 באמיגדלה של חולדה לאחר אוטם בשריר הלב באמצעות ספקטרופלואורומטריה. שיטה זו יכולה לספק תשובות לשאלות מפתח בתחום מדעי העצבים ההתנהגותיים, כגון ההשלכות של אוטם בשריר הלב על תפקוד קוגניטיבי, בריאות הנפש, תהליכי הזדקנות ושינה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה, מהירה ואמינה.

בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה, מכיוון שהיא דורשת מיומנות ידנית לניתוח ולדגימת רקמות. את הפרוצדורה תדגים Kim Gilbert, עוזרת מחקר במעבדה שלנו. לאחר השראת הרדמה בהתאם לפרוטוקולים המוסדיים המאושרים, יש לוודא שההרדמה תקינה באמצעות בדיקת היעדר רפלקס צביטה של כף הרגל.

בצעו אינטובציה לחולדה באמצעות צינור אנדוטרכאלי והניחו את בעל החיים במנח שכיבה על הבטן (ventral decubitus) על פד חימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף של 37 °C. חברו את הצינור האנדוטרכאלי למכשיר הרדמה המפיץ 2% isofluorane. לאחר מכן, הכינו את אזור הניתוח באמצעות chlorhexidine gluconate ואלכוהול איזופרופיל.

יש למרוח משחה עינית בשתי העיניים כדי למנוע יובש. יש להניח סדין סטרילי על בעל החיים כדי ליצור שטח סטרילי מסביב לאתר הניתוח. כמו כן, יש להניח את כלי הניתוח הסטריליים הנדרשים על שטח סטרילי נוסף לצד בעל החיים.

בשלב הבא, בצעו חתך בעור באמצעות להב סכין מנתחים מספר 10 או מספריים. השתמשו במספריים או בתפסן המוסטטי כדי לקלף את רקמת השריר. לאחר מכן, השתמשו במספריים או בתפסן המוסטטי כדי לפתוח את דופן בית החזה והניחו את מורחב החזה (chest retractor), ופתחו את פריקרדיום (pericardium) באמצעות התפסן המוסטטי.

כדי להשרות חסימה כלילית (coronary occlusion), יש תחילה להשחיל תפר משי בחוזק 4-0 ובאורך 360 מילימטר סביב העורק הכלילי היורד (descending coronary artery) ודרך רקמת השריר הלבבי הסמוכה. יש להחדיר את שני קצות תפר המשי לתוך צינור פלסטיק בכיול 14-gauge ובאורך 1.25 סנטימטר. משוך את שני קצות תפר המשי ודחף את הצינור כלפי מטה כנגד העורק כדי לחסום אותו.

בצעו את החסימה על ידי ת clamp של צינור הפלסטיק באמצעות תפס המוסטטי והמתינו בחסימה למשך 40 דקות. לאחר 40 דקות, שחררו את החסימה על ידי הסרת התפס ההמוסטטי, ולאחר מכן הסירו את הצינור הגמיש ואת תפר המשי. סגרו את בית החזה באמצעות תפר two zero, והחדירו קטטר גמיש דרך חלל בית החזה ושאבו אוויר מבית החזה באמצעות מזרק של 10 milliliter כדי למנוע פנומטורקס.

תפרו את השריר באמצעות תפר משי 4-0 ואת העור באמצעות תפר משי 3-0. לפני סגירת תפר העור האחרון, שאבו שוב אוויר מבית החזה באמצעות מזרק של 10 milliliter וקתטר. השלימו את סגירת העור ולאחר מכן הפסיקו את מתן ה-isofluorane.

הניחו את החולדה בכלוב נקי ועקבו אחריה במהלך ההתאוששות מההרדמה. ניתן משככי כאבים במינונים חוזרים בכל שמונה שעות. לאחר ביצוע דקפיטציה הומנית לבעל החיים בהתאם לנהלים המאושרים, הניחו את ראש החולדה על צלחת המונחת על קרח גרוס.

השתמשו במספריים כדי לפתוח את הגולגולת. לאחר מכן, השתמשו ברונגאורים כדי להסיר את לוחות העצם על ידי משיכה כלפי מעלה, תוך הקפדה על אי-פגיעה ברקמה שמתחתיהם. בשלב הבא, הניחו את הלהב השטוח של שפכטל בין בסיס הגולגולת לבין המשטח הוונטרלי האחורי של המוח, והפרידו את המוח מהגולגולת על ידי דחיפה עדינה של הלהב קדימה והרמת המוח אל מחוץ לגולגולת.

הנח את המוח על פניו הגביים (dorsal surface). זהה את ההיפותלמוס לפני הגבאי (cerebellum) ובצע חיתוך קורונלי של המוח לפני הקצה האחורי של ההיפותלמוס וכן מאחורי הקצה הקדמי שלו. זהה את האמיגדלה הדו-צדדית כשני כדוריות קטנות מתחת לאונות הרקות, בסמוך להיפותלמוס.

לאחר מכן, הפכו את המוח כך שיהיה מונח שטוח על קצהו הפרונטלי, כאשר המשטח הדורסלי פונה הרחק מהנסיין. בשלב הבא, הפרידו בין ההמיספירות והסירו את הקורטקס מהאמיגדלה הרציפה. כאשר האמיגדלה נחשפת, חתכו אותה באמצעות סקלפל.

גזרו לאורך התפר הכהה העובר לרוחב האמיגדלה כדי להפריד בין החלקים הבזולטרליים והמרכזיים-מדיאליים, ולאחר מכן הניחו את שני החלקים במבחנות נפרדות ומסומנות על קרח. יש לבצע שלב זה במהירות רבה ככל האפשר כדי למנוע התדרדרות של אנזימים. לאחר חזרה על הליך הדיסקציה בהמיספירה השנייה, טבלו את כל ארבע המבחנות בחנקן נוזלי למשך דקה אחת ולאחר מכן אחסנו במקפיא בטמפרטורה של 80- °C.

התחל בהוספה של 150 µL של באפר ליזיס לכל 5 עד 10 mg של דגימה על קרח. בצע סוניקציה לכל דגימה על קרח בעוצמה מרבית למשך 5 שניות. לאחר מכן, הדגר על קרח למשך 30 דקות.

במהלך הדגירה, ערבבו את הדגימה במיקסר וורטקס (vortex) למשך חמש שניות בכל חמש דקות. לאחר מכן, בצעו שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה על ידי העברת הדגימות לסירוגין לחנקן נוזלי ולפלטת חימום מבוקרת טמפרטורה המכוונת ל-37 °C. לאחר מחזור ההקפאה-הפשרה האחרון, סבבו את דגימות הרקמה בצנטריפוגה ב-1300 Gs בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות.

בשלב הבא, שאבו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) והעבירו אותו למבחנה נקייה על קרח. לאחר כימות החלבון בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב, הוסיפו 25 µg של חלבון למבחנת תגובה המכילה 0.8 µL של 10 mM Ac-DEVD-AMC ותמיסות באפר לתגובה, לנפח סופי של 200 µL. עבור דגימות תגובה שליליות, ערבבו 25 µg של חלבון עם 1 µL של 800 µM Ac-DEVD-CHO ו-0.8 µL של 10 mM Ac-DEVD-AMC.

דגרו את כל הדגימות והביקורות בחושך למשך שלוש שעות ב-37 degrees Celsius. לאחר תום זמן הדגירה, הפסיקו את התגובה על ידי הוספה של 600 microliters של 0.4 molar glycine ו-0.4 molar sodium hydroxide ב-pH 10 לכל דגימה וביקורת. הוסיפו שני milliliters של מים מזוקקים לכל תגובה בתוך קיובטה מזכוכית.

כמת את הפלואורסצנציה באמצעות ספקטרופלואורומטריה. קרא את הביקורות והדגימות במשך 10 שניות, בקצב של קריאה אחת בכל שנייה. לבסוף, כמת את הפעילות הספציפית בכל דגימה בהתאם לנוסחה המוצגת כעת על המסך.

היסטוגרמה זו מראה את פעילות ה-caspase-3 באמיגדלה של חולדות שעברו אוטם בשריר הלב. הנתונים מוצגים כאחוז מהפעילות הממוצעת בקבוצות הביקורת (sham), שנקבעו כ-100%. כל קבוצה כללה שמונה חולדות. הכוכבית מציינת הבדל מובהק בין הקבוצות עם ערך p נמוך מ-0.05.

לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בשבע שעות, לא כולל המרווח שבין הניתוח לאוטם השריר הלבבי לבין דגימת הרקמה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשרות אוטם שריר לבבי בחולדה ולמדוד את פעילות ה-caspase-3 באמיגדלה של החולדה באמצעות ספקטרופלואורומטריה.