Name: Caspase-3 פעילות באמיגדלה העכברוש נמדד על ידי Spectrofluorometry לאחר אוטם שריר הלב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: למדו למדוד פעילות קספאז-3 באמיגדלה של עכברוש לאחר אוטם שריר הלב באמצעות ספקטרופלואורומטריה. שיטה זו מאפשרת לחקור השלכות נוירולוגיות של אירועים לבביים על תפקוד קוגניטיבי ובריאות הנפש.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

. עבודה זו נתמכה על ידי מענק ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה קים גילברט מחזיק מלגת לימודים מחטיבות דה לה משוכלל ונדיר du קוויבק - סנטה.

בעלי חיים מטופלים בעמידה ברגולציה של ועדת הטיפול בבעלי חיים המקומית, בהתאם להנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים. חולדות שוכנו בנפרד בתנאים קבועים (טמפרטורה של 21-22 מעלות צלזיוס ולחות של 40-50%), כולל מחזור כהה אור 12 שעות, מתחיל בשעה 08:00 בבוקר. כדורי צ&#39;או ומים ברז הם כרצונך מודעה זמין לאורך כל תקופת המחקר. תקופת התאקלמות של 3 ימים לאחר לידה על ידי הספק מותר לפני הניסוי. חולדות זכרי Sprague-Dawley משקל בין 300-800 גר היו בשימוש באופן שיגרתי עם פרוטוקול זה. 1. ניתוח MI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום להרדמה עם זריקות intraperitoneal של 60 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין ו -10 מ&quot;ג / קילוגרם xylazine. אשר הרדמה תקינה על ידי היעדר רפלקס כאשר כפות הם צבטו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח אתר כירורגית. צנרר עכברוש עם צינורות endotracheal: צנתר (16G 1.77 אינץ &#39;) ולמקם את החיה בעמדת פַּחֶסֶת רוחב. מניחים את בעלי החיים על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורה סביב 37 מעלות צלזיוס. חבר את צינורות endotracheal לIsoflurane 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אתר כירורגית עם gluconate chlorhexidine ואלכוהול איזופרופיל. במהלך ניתוח, להשתמש בכפפות סטריליות ומכשירים מעוקרים. החל משחת עיניים לשני העיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. שים שדה סטרילי על בעלי חיים ועל המכשירים אחר שדה סטרילי בסמוך לבעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את עור עם להב סכין מנתחים # 10. לקלף את רקמת שריר עם מהדק עוצר דמום. מניחים את החיה בעמדת פַּחֶסֶת הגחון. קיר בית חזה פתוח עם מפשק חזה מהדק ומיקום עוצר דמום. קרום הלב פתוח עם מהדק עוצר דמום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר חסימה כלילית, לולאת תפר משי 4-0 מ&quot;מ 360-ארוך סביב העורקים הכליליים יורדים, עובר דרך רקמת שריר לב רציפה. הכנס את שני הקצוות של תפר המשי ל14g, צינור פלסטיק ארוך 1.25 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את שני הקצוות של תפר המשי ומוגלהh הצינור נחלש כנגד העורק כדי לחסום אותו, במשך 40 דקות. חסימה מאובטחת על ידי הידוק צינור הפלסטיק עם מהדק עוצר דמום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 40 דקות, לשחרר את החסימה על ידי שחרור המהדק עוצר דמום, ואחריו הסרת תפר צינורות ומשי גמיש. הערה: חולדות שליטה שאם עוברות את אותו הליך כירורגי מינוס החסימה של העורקים הכליליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני סגירת קיר בית החזה, מקום צנתר גמיש (18G, 4.5 סנטימטרים) בחלל בית החזה לצייר אוויר מבית החזה עם מזרק 5 מ&quot;ל כדי למנוע pneumothorax. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלל בית החזה לסגור עם 2-0 תפר, לתפור את השריר עם תפר 4-0 משי ועור עם 3-0 תפר משי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני סגירת נקודת העור שעברה, שוב לצייר אוויר מבית החזה עם מזרק 5 מ&quot;ל באמצעות הצנתר ממוקם בעבר בחלל בית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפור נקודת עור שעברה. תפסיק אוורור isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג התעוררות חולדה. אל תשאיר חיה ללא השגחה עד יש Regaineתודעה מספיק ד לשמור כיבתה sternal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את חולדה כל שעה 8 לשעה 24 עם משכך כאבים (עצירות, 0.05 מ&quot;ג / IP קילוגרם) ועם אנטיביוטיקה (מנה אחת של duplocillin, 0.2 מ&quot;ג / IP קילוגרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניתוח, חולדות בית בנפרד עד זמן הקרבה, כלומר, 3 ימים לאחר אוטם לבבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גודל אוטם, בעיקר נמק, מתבטא בשיעור של רקמת אוטם שריר באזור בסיכון של החדר השמאלי. זה יכול נמדד באמצעות צבע triphenyltetrazolium 11. </li></ol> 2. בידוד האמיגדלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ראש החיה ראשונה בתיק בצורת חרוט, עם אפה הבולט מתוך צמצם הקצה הצר. עכברוש מאובטח כדי למנוע כל תנועה. מקם את ראשה כראוי על הגיליוטינה, בין להבי המספריים. לערוף חיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש מקום החולדה בצלחת כל הזמן על קרח כתוש. לבצע את כל ההליכים לבידוד רקמות על קרח כתוש (4 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SK הפתוח לחתוךull עם מספריים, לנתק בזהירות נדני עצם עם rongeurs עצם על ידי משיכת והימנעות פציעת הרקמה מתחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את להב השטוח של מרית בין החלק התחתון של הגולגולת ומשטח הגחון האחורי של המוח ולנתק בזהירות מוח מגולגולת על ידי דחיפה קלה של הלהב קדימה לאורך החלק התחתון של הגולגולת עד שהמוח יכול להיות הרים לאט מ גוּלגוֹלֶת. מחק את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מוח על פני השטח הגב שלה. לזהות ההיפותלמוס (מבנה בחזית של המוח הקטן) ולחתוך את מוח coronally מול הקצה הקדמי שלה ומאחורי הקצה האחורי שלה; השלך את החלקים הקדמי והאחוריים של המוח, אם אין צורך לשימושים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין amygdalas כמו כדורים קטנים מתחת האונה הטמפורלית, דו-צדדי, רק בסמוך להיפותלמוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את שטוח המוח בסוף הקדמי שלה, משטח הגבי מהניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם צד שמאלי או ימני של המוח. הפרד את חמיתחומים ולאחר מכן הקליפה מהאמיגדלה רציפה. חותך דרך כ -8 מ&quot;מ של זה רופף קליפה כדי לאפשר בידוד של האמיגדלה. לחתוך אמיגדלה עם אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את החלק של basolateral האמיגדלה מחלק centromedial על ידי חיתוך לאורך התפר הכהה שחוצה אותו, כמעט חצי וחצי. מבנה זה לא תמיד קל לזיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים subparts האמיגדלה בבקבוקונים מזוהים נפרדים ולשמור על קרח כתוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך נתיחה חוזר עם חצי הכדור האחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הבקבוקונים בחנקן נוזלי דקות 1. שמור בקבוקון במקפיא -80 ° C עד צורך. </li></ol> 3. caspase-3 פעילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר תמוגה עם 0.32 M של סוכרוז, 1% Triton-X-100, 10 מ&quot;מ של טריס-HCl, pH 8, 5 מ&quot;מ של חומצת ethylenediaminetetraacetic, 2 מ&quot;מ של dithiothreitol, 1 מ&quot;מ של פלואוריד phenylmethylsulfonyl, 10 מיקרוגרם / μl של leupeptin , 10 מיקרוגרם / μl של pepstatin ו -10 מיקרוגרם / μl של aprotinin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">להוסיף 150 μl של חיץ תמוגה לכל דגימה (5-10 מ&quot;ג). שמור על קרח. Sonicate כל דגימה על קרח למשך 5 שניות בעוצמה מקסימלי (40 W). דגירה רקמה במאגר תמוגה על קרח למשך 30 דקות. וורטקס כל מדגם למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מחזורי 3 הקפאה / הפשרה על ידי הצבת דגימות לסירוגין בחנקן נוזלי ועל צלחת חימום תרמוסטטית שליטה המוגדרת על 37 מעלות צלזיוס. רקמת צנטריפוגה ב 13,000 ז (4 מעלות צלזיוס) במשך 10 דקות. מוציא בזהירות supernatant ולשמור בצינור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ריכוזי חלבון סטנדרטיים בין 0 ל 10 מיקרוגרם / מיליליטר עם אלבומין בסרום שור. הכן את החסר עם חיץ בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של מגיב ברדפורד לכל תקן. קראו סטנדרטי ב595 ננומטר. לרמות חלבון, להוסיף 5 μl של supernatant המדגם לμl 795 של מים מזוקקים ו -200 μl של מגיב ברדפורד. קראו כל דגימה ב595 ננומטר ולכמת חלבון עם עקומה סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ תגובה עם 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7, 5 מ&quot;מ של MgCl 2 &lt;/ Dimethylammonio] -1-propanesulfonate משנה&gt;, 1 מ&quot;מ של חומצת tetraacetic אתילן גליקול, 0.1% מ3-cholamidopropyl) ושל 1 מ&quot;מ dithiothreitol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 מיקרוגרם של חלבון למצעי חיץ התגובה וcaspase-3 להשיג דגימות תגובה חיוביות ושליליות. עבור דגימות שליליות, להוסיף למאגר תגובה, 25 מיקרוגרם של חלבון, 0.4 μl של מיקרומטר Ac-DEVD-CHO 800 וμl 0.8 של Ac-DEVD-AMC 10 מ&quot;מ. לדגימות חיוביות, להוסיף 25 מיקרוגרם של חלבון למאגר תגובה וμl 0.8 של Ac-DEVD-AMC 10 מ&quot;מ. לעבד את כל הדגימות השליליות וחיוביות בשלושה עותקים. השלם את הנפח הסופי של כל דגימה עד 200 μl על ידי הוספת תגובת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר בקרה שלילית על ידי הוספת 188.7 μl של חיץ תגובה ל 0.5 μl של Ac-DEVD-CHO 800 מיקרומטר, 0.8 μl Ac-DEVD-AMC 10 מ&quot;מ ו -10 μl של מאגר תמוגה. לבקרות חיוביות, להוסיף 189.2 μl של חיץ תגובה, 0.8 μl של Ac-DEVD-AMC 10 מ&quot;מ ו -10 μl של מאגר תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות ובקרות בחושך במשך 3 שעות על 37 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצות עם 600 גליצין μl 0.4 מ &#39;ו -0.4 NaOH M (pH 10) בכל דגימה ושליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת הקרינה על ידי spectrofluorometry בגל עירור של 365 ננומטר אורך גל ופליטה של ​​465 ננומטר. הוסף 2 מיליליטר של מים מזוקקים לתגובה בקובט זכוכית. קראו בקרות ודגימות למשך 10 שניות עם נקודה 1 בכל שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת פעילות ספציפית בכל דגימה: ((הקרינה של דגימות שליליות מינוס הקרינה של דגימות חיוביות) x נפח של 2.8 מיליליטר) מחולקים ב( זמן דגירה 3 כמות x שעות של חלבון 25 מ&quot;ג). </li></ol>

<ol><li>Denault, J. B., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases%3A+keys+in+the+ignition+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Caspases: keys in the ignition of cell death.</a> Chemical Reviews. 102, 4489-4500 (2002).</li>
<li>Boucher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-ischemic+cardioprotection+by+A2A+adenosine+receptors%3A+dependent+of+phosphatidylinositol+3-kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Post-ischemic cardioprotection by A2A adenosine receptors: dependent of phosphatidylinositol 3-kinase pathway.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43, 416-422 (2004).</li>
<li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celecoxib+after+the+onset+of+reperfusion+reduces+apoptosis+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Celecoxib after the onset of reperfusion reduces apoptosis in the amygdala.</a> Apoptosis. 12, 1945-1951 (2007).</li>
<li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+time+course+in+the+limbic+system+after+myocardial+infarction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis time course in the limbic system after myocardial infarction in the rat.</a> Brain Research. 1216, 87-91 (2008).</li>
<li>Rousseau, G., Bah, T. M., Godbout, R. Chapter 19, Post-Myocardial Infarction Depression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRousseau%2C+G+%22Novel+Strategies+in+Ischemic+Heart+Disease+%22">Novel Strategies in Ischemic Heart Disease </a>. Lakshmanadoss, U. , 333-362 (2012).</li>
<li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+detected+in+the+amygdala+following+myocardial+infarction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Apoptosis detected in the amygdala following myocardial infarction in the rat.</a> Biological Psychiatry. 59, 430-433 (2006).</li>
<li>Arseneault-Breard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Lactobacillus+helveticus+R0052+and+Bifidobacterium+longum+R0175+reduces+post-myocardial+infarction+depression+symptoms+and+restores+intestinal+permeability+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Combination of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 reduces post-myocardial infarction depression symptoms and restores intestinal permeability in a rat model.</a> British Journal of Nutrition. 107, 1793-1799 (2012).</li>
<li>Bah, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escitalopram+reduces+circulating+pro-inflammatory+cytokines+and+improves+depressive+behavior+without+affecting+sleep+in+a+rat+model+of+post-cardiac+infarct+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Escitalopram reduces circulating pro-inflammatory cytokines and improves depressive behavior without affecting sleep in a rat model of post-cardiac infarct depression.</a> Behavioural Brain Research. 225, 243-251 (2011).</li>
<li>Bah, T. M., Kaloustian, S., Rousseau, G., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+with+pentoxifylline+has+antidepressant-like+effects+in+a+rat+model+of+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Pretreatment with pentoxifylline has antidepressant-like effects in a rat model of acute myocardial infarction.</a> Behavioural Pharmacology. 22, 779-784 (2011).</li>
<li>Gilbert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+post-myocardial+infarction+depression+in+rats+by+n-3+fatty+acids+or+probiotics+starting+after+the+onset+of+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion.</a> British Journal of Nutrition. 109, 50-56 (2013).</li>
<li>Gilbert, K., Bernier, J., Godbout, R., Rousseau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+D1%2C+a+metabolite+of+omega-3+polyunsaturated+fatty+acid%2C+decreases+post-myocardial+infarct+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Resolvin D1, a metabolite of omega-3 polyunsaturated fatty acid, decreases post-myocardial infarct depression.</a> Marine Drugs. 12, 5396-5407 (2014).</li>
<li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+signs+of+depression+and+apoptosis+in+the+limbic+system+following+myocardial+infarction%3A+effects+of+sertraline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction: effects of sertraline.</a> Journal of Psychopharmacology. 23, Oxford, England. 451-459 (2009).</li>
<li>Gorr, T. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+re-visited%3A+critical+perusal+of+under-appreciated+technical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%3A+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Western blotting re-visited: critical perusal of under-appreciated technical issues.</a> Proteomics: Clinical Applications. , (2015).</li>
<li>McKernan, D. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Killing+the+blues%27%3A+a+role+for+cellular+suicide+%28apoptosis%29+in+depression+and+the+antidepressant+response%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">'Killing the blues': a role for cellular suicide (apoptosis) in depression and the antidepressant response.</a> Progress in Neurobiology. 88, 246-263 (2009).</li>
<li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+pathways%3A+paper+wraps+stone+blunts+scissors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors.</a> Cell. 102, 1-4 (2000).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הניסיון שלנו עם פרוטוקול זה מעל 10 השנים האחרונות הוביל לזיהוי של בעיות מתודולוגיות קריטיות. ראשית, לנתיחה מוח מהירה בצלחת פטרי על קרח כתוש חשוב לשמור על איכות הכנה. שנית, הוא חייב להיות הבין שsonication רקמה קצר לאמיגדלה המוחית בהשוואה לסוגים אחרים של רקמות, כמו הלב (10 שניות) או כליות (20 שניות). שלישית, יש לנקוט בזהירות רבה כדי לערבב בזהירות את המצע לפני הוספתו לדגימות. נתקלנו אותות משתנים כאשר רצף הערבוב היה לקוי. רביעית, אין בועות צריכה להיות נוכחת בתא קוורץ בעת קריאת הדגימות. אחרת, את האות אפשר לשנות. אנחנו עשינו שינוי בשנים האחרונות להגדיל את שחזור של התוצאות: הגדלת נפח מצע, כדי למנוע נפח של פחות מ 1 μl. ובכל זאת, שינויים קטנים עשויים להתרחש בין מבחני רצופים, ויש להשתמש לפחות 3 דגימות בקרה לשליטה לווריאציות. צעדי הקרינה של בקרות אלה בממוצע והממוצע מוגדר ב 100%. צעדי הקרינה בדגימות ניסוי הופכים באחוזים של דגימות הבקרה. מגבלה נוספת של הטכניקה היא שרק חלק מהרקמה משמש, ולכן, caspase-3 פעילות יכולה לזלזל. ואכן, החלון של אפופטוזיס הזמן קצר בכל תא נתון ויכול להיות שלא נענו למרות שהיא מתרחשת באזורים הסמוכות בזמן דגימת 1,4,15. ההפך הוא גם אפשרי: אפופטוזיס יכול להיות אינטנסיבי במיוחד בחלקים של רקמה, וכתוצאה מכך הערכת יתר של caspase-3 פעילות. אנו ממליצים על השימוש ברקמות שנותרו (אמיגדלה) לטכניקות משלימות, כגון מבחני TUNEL או יחס Bax / Bcl2 (ראה מבוא). יש Spectrofluorometry לפחות שני יתרונות על פני מערבי סופג. ראשית, אותו ישירות מייצר נתונים כמותיים. שנית, הוא מודד האנזימטיתctivity עצמו ולא חלבון או RNA ביטוי, אשר עשוי להיות קשורים, וזה ידוע כי ביטוי חלבון עשוי להיות מוגבר ללא כל שינוי בפעילות האנזימטית. יתר על כן, spectrofluorometry יכול להתבצע על רקמות אחרות או עם בעלי חיים שונים ויכולה להיות מותאם לתת caspase אחרים, עם מצעים שונים, כך ניתן לבצע השוואות שבטוחות. לסיכום, מסמך זה מדגים את השימוש בspectrofluorometry למדוד caspase-3 פעילות באמיגדלה, מתן עדות אפופטוזיס המתרחש באזור זה של המערכת הלימבית 3 ימים לאחר אוטם לבבי.

Caspases או פרוטאזות המכוונת aspartate ציסטאין תלוי היא משפחה של אנזימים שמעורבים בprocessess הומאוסטזיס שונים 1. Caspases יכול להיות מסווג באופן כללי על פי תפקידיהם באפופטוזיס או דלקת. Caspase-1, -4, -5 ו-12 מעורבים בדלקת ואילו אלה העוסקים באפופטוזיס יכולים להיות תת-מסווג כcaspases יוזם (caspase-8 ו -9) וcaspases התליין (caspase-3, -6 ו-7 ). Caspases לשחק תפקידים משמעותיים בפתולוגיות רבות, בעיקר בהפרעות בי אפופטוזיס יכול להיות מוגזם, כפי שנצפה לאחר אוטם שריר לב (MI) או איסכמיה מוחית. במודל העכברים של תסמונת הפוסט-MI משמשת במעבדה שלנו, נקבע כי caspase-3 מופעל לא רק בשריר הלב 2, אלא גם במערכת הלימבית שמעורבת בשליטה על מצב רוח ורגשות 3-6. הוא גם ראה שcaspase-3 מופעל באזורים שוניםשל המערכת הלימבית, כגון האמיגדלה וההיפוקמפוס, ופסגות הפעלה זה סביב 3 ימים לאחר עלבון איסכמי 4. מעניין לציין, caspase-3 פעילות בקורלציה עם ליקויים התנהגותיים לאחר אוטם לבבי, וההנחתה שלה באמצעות התערבות תרופתית ותזונתית מפחיתה פציעות אלה, המצביע על קשר אפשרי בין caspase-3 ודיכאון לאחר אוטם לבבי 7-12. Caspase-3 הפעלה ניתן למדוד על ידי טכניקות שונות. מערבי סופג ascertains המאפיינים האנזימטית של caspases ויכול לזהות אנזימים פעילים, כמו גם צורות פרו-האנזים שלהם. מערבי סופג, לעומת זאת, הוא חצי כמותית, ויכולים ללכת לאיבוד וריאציות קטנות באמצעות יחסי אות לרעש חלשים 13. טכניקה טובה יותר מבוססת על המחשוף של מצע (DEVD-AMC) על ידי caspase-3 שמשחרר מתחם fluorogenic וניתן למדוד על ידי spectrofluorometry. Caspase-3 הפעלה היא סמן אמין של אפופטוזיס. מדידה של CA אפופטוזיסn להיות לא יציב בגלל החלון של התרחשות הזמן קצר, ותאים שכנים יכולים phagocytize גופים או תאים אפופטוטיים 14. אפופטוזיס ניתן לאשר עוד יותר על ידי טכניקות אחרות, כגון תיוג סוף dUTP ניק assay מסוף deoxynucleotidyl transferase (TUNEL), שמזהה פיצול ה- DNA וכתוצאה ממפלים אפופטוטיים איתות 6, או היחס של חלבונים פרו / אנטי-אפופטוטיים, כגון Bax / Bcl2 6.

<table><tbody><tr>מכשיר טכנולוגיית פוטון <td>ספקטרופלורומטר</td><td>(כיום Horiba)</td> <td>Ratiomaster M-40</td><td>עם DeltaRAM&nbsp; מונוכרומטור גישה אקראית&nbsp;</td></tr><tr><td>מכונת הנשמה</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>683</td><td>אוורור בעלי חיים קטנים</td></tr><tr><td>קובטה</td><td>זכוכית תאים מדויקים NSG</td><td>3G10</td><td>זכוכית אופטית (340-2,500 ננומטר) נתיב 10 מ"מ</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Cole Parmer</td><td>4710&nbsp; סדרה</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר</td><td>Varian</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr></tbody></table>

caspase-3 פעילות באמיגדלה העכברוש נמדד על ידי spectrofluorometry לאחר אוטם שריר הלב

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

אוטם שריר לב (MI) יש השלכות אמצע וארוך טווח דרמטיים ברמות הפיזיולוגיות והתנהגותיים, אך המנגנונים המעורבים עדיין אינם ברורים. המעבדה שלנו פיתחה מודל חולדה של תסמונת הפוסט-MI המציגה פונקציות לקויים של הלב, אובדן עצבי במערכת הלימבית, ליקויים קוגניטיביים וסימנים התנהגותיים של דיכאון. ברמה העצבית, caspase-3 הפעלה מתווכת אפופטוזיס לאחר האוטם הלבבי באזורים הלימבית שונים, כגון האמיגדלה - שהגיע לשיא בימים 3 לאחר אוטם לבבי. ליקויים קוגניטיביים והתנהגותיים מופיעים 2-3 שבועות לאחר אוטם לבבי ואלה לתאם סטטיסטיים עם מדדים של caspase-3 פעילות. הפרוטוקול המתואר כאן משמש כדי לגרום לאוטם לבבי, לאסוף רקמת האמיגדלה ולמדוד caspase-3 פעילות באמצעות spectrofluorometry. כדי לגרום לאוטם לבבי, העורק הכלל יורד הוא occluded במשך 40 דקות. הפרוטוקול להערכת caspase-3 הפעלה מתחיל 3 ימים לאחר אוטם לבבי: החולדות הקריבו והאמיגדלה מבודדת אונסיםdly מהמוח. דגימות קפואות במהירות בחנקן נוזלי והמשיכו ב -80 ° C עד ניתוח בפועל. הטכניקה שבוצעה על מנת להעריך caspase-3 הפעלה מבוססת על מחשוף של מצע (DEVD-AMC) על ידי caspase-3, אשר משחרר מתחם fluorogenic שניתן למדוד על ידי spectrofluorometry. המתודולוגיה היא כמותית ושחזור אבל הציוד הנדרש הוא יקר וההליך לכימות הדגימות הוא זמן רב. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על רקמות אחרות, כגון לב וכליות. ניתן להחליף DEVD-AMC על ידי מצעים אחרים כדי למדוד את הפעילות של caspases האחר.

האמיגדלה הייתה מבודדת בדמה 8 (שליטה) ו8 חולדות MI שלושה ימים אחרי הגיוס של פרוטוקול איסכמיה / reperfusion. Caspase-3 פעילות נמדדה ברקמה זו באמצעות fluorochrome שניתן ביקע ידי caspase-3 הפעיל וזוהה על ידי spectrofluorometry. מדידות חיוביות ושליליות (ראה צעדים 3.11, 3.12 ו3.16) בוצעו בשלושה עותקים ונמדדו במהלך 10 שניות, עם נקודה 1 בכל שנייה. הבדלים בין בקרות חיוביות ושליליות חושבו והממוצע של ההבדלים לכל רקמת הדמה שבוצעה במהלך ניסוי זה נקבע על 100%. תוצאות מחולדות MI היו מדורגים על פי התייחסות זו והאיור 1 מדגים את התוצאות הסופיות: הוא מציין פעילות גבוהה יותר באופן משמעותי בהשוואה לחולדות MI דמה (p &lt;0.05). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> איור 1. caspase-3פעילות באמיגדלה של חולדות MI, הביעה כאחוז מפעילות הממוצעת בבקרת אחיזת עיניים, שנקבעה ל -100% (8 חולדות לכל קבוצה). * מציין משמעותי הבדל בין הקבוצות (p &lt;0.05). הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM.

אוטם שריר הלב (MI) מלווה לא רק בתפקוד לב לקוי אלא גם באפופטוזיס באמיגדלה, אזור במוח המעורב בהשלכות ההתנהגותיות של MI. פרוטוקול זה מתאר כיצד לגרום ל-MI, לאסוף רקמת אמיגדלה ולמדוד בה פעילות קספאז-3, סמן לאפופטוזיס.

Caspase-3 פעילות באמיגדלה העכברוש נמדד על ידי Spectrofluorometry לאחר אוטם שריר הלב

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד את פעילות ה-caspase-3 באמיגדלה של חולדה לאחר אוטם בשריר הלב באמצעות ספקטרופלואורומטריה. שיטה זו יכולה לספק תשובות לשאלות מפתח בתחום מדעי העצבים ההתנהגותיים, כגון ההשלכות של אוטם בשריר הלב על תפקוד קוגניטיבי, בריאות הנפש, תהליכי הזדקנות ושינה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה, מהירה ואמינה.בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה, מכיוון שהיא דורשת מיומנות ידנית לניתוח ולדגימת רקמות. את הפרוצדורה תדגים Kim Gilbert, עוזרת מחקר במעבדה שלנו. לאחר השראת הרדמה בהתאם לפרוטוקולים המוסדיים המאושרים, יש לוודא שההרדמה תקינה באמצעות בדיקת היעדר רפלקס צביטה של כף הרגל.בצעו אינטובציה לחולדה באמצעות צינור אנדוטרכאלי והניחו את בעל החיים במנח שכיבה על הבטן (ventral decubitus) על פד חימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף של 37 °C. חברו את הצינור האנדוטרכאלי למכשיר הרדמה המפיץ 2% isofluorane. לאחר מכן, הכינו את אזור הניתוח באמצעות chlorhexidine gluconate ואלכוהול איזופרופיל.יש למרוח משחה עינית בשתי העיניים כדי למנוע יובש. יש להניח סדין סטרילי על בעל החיים כדי ליצור שטח סטרילי מסביב לאתר הניתוח. כמו כן, יש להניח את כלי הניתוח הסטריליים הנדרשים על שטח סטרילי נוסף לצד בעל החיים.בשלב הבא, בצעו חתך בעור באמצעות להב סכין מנתחים מספר 10 או מספריים. השתמשו במספריים או בתפסן המוסטטי כדי לקלף את רקמת השריר. לאחר מכן, השתמשו במספריים או בתפסן המוסטטי כדי לפתוח את דופן בית החזה והניחו את מורחב החזה (chest retractor), ופתחו את פריקרדיום (pericardium) באמצעות התפסן המוסטטי.כדי להשרות חסימה כלילית (coronary occlusion), יש תחילה להשחיל תפר משי בחוזק 4-0 ובאורך 360 מילימטר סביב העורק הכלילי היורד (descending coronary artery) ודרך רקמת השריר הלבבי הסמוכה. יש להחדיר את שני קצות תפר המשי לתוך צינור פלסטיק בכיול 14-gauge ובאורך 1.25 סנטימטר. משוך את שני קצות תפר המשי ודחף את הצינור כלפי מטה כנגד העורק כדי לחסום אותו.בצעו את החסימה על ידי ת clamp של צינור הפלסטיק באמצעות תפס המוסטטי והמתינו בחסימה למשך 40 דקות. לאחר 40 דקות, שחררו את החסימה על ידי הסרת התפס ההמוסטטי, ולאחר מכן הסירו את הצינור הגמיש ואת תפר המשי. סגרו את בית החזה באמצעות תפר two zero, והחדירו קטטר גמיש דרך חלל בית החזה ושאבו אוויר מבית החזה באמצעות מזרק של 10 milliliter כדי למנוע פנומטורקס.תפרו את השריר באמצעות תפר משי 4-0 ואת העור באמצעות תפר משי 3-0. לפני סגירת תפר העור האחרון, שאבו שוב אוויר מבית החזה באמצעות מזרק של 10 milliliter וקתטר. השלימו את סגירת העור ולאחר מכן הפסיקו את מתן ה-isofluorane.הניחו את החולדה בכלוב נקי ועקבו אחריה במהלך ההתאוששות מההרדמה. ניתן משככי כאבים במינונים חוזרים בכל שמונה שעות. לאחר ביצוע דקפיטציה הומנית לבעל החיים בהתאם לנהלים המאושרים, הניחו את ראש החולדה על צלחת המונחת על קרח גרוס.השתמשו במספריים כדי לפתוח את הגולגולת. לאחר מכן, השתמשו ברונגאורים כדי להסיר את לוחות העצם על ידי משיכה כלפי מעלה, תוך הקפדה על אי-פגיעה ברקמה שמתחתיהם. בשלב הבא, הניחו את הלהב השטוח של שפכטל בין בסיס הגולגולת לבין המשטח הוונטרלי האחורי של המוח, והפרידו את המוח מהגולגולת על ידי דחיפה עדינה של הלהב קדימה והרמת המוח אל מחוץ לגולגולת.הנח את המוח על פניו הגביים (dorsal surface). זהה את ההיפותלמוס לפני הגבאי (cerebellum) ובצע חיתוך קורונלי של המוח לפני הקצה האחורי של ההיפותלמוס וכן מאחורי הקצה הקדמי שלו. זהה את האמיגדלה הדו-צדדית כשני כדוריות קטנות מתחת לאונות הרקות, בסמוך להיפותלמוס.לאחר מכן, הפכו את המוח כך שיהיה מונח שטוח על קצהו הפרונטלי, כאשר המשטח הדורסלי פונה הרחק מהנסיין. בשלב הבא, הפרידו בין ההמיספירות והסירו את הקורטקס מהאמיגדלה הרציפה. כאשר האמיגדלה נחשפת, חתכו אותה באמצעות סקלפל.גזרו לאורך התפר הכהה העובר לרוחב האמיגדלה כדי להפריד בין החלקים הבזולטרליים והמרכזיים-מדיאליים, ולאחר מכן הניחו את שני החלקים במבחנות נפרדות ומסומנות על קרח. יש לבצע שלב זה במהירות רבה ככל האפשר כדי למנוע התדרדרות של אנזימים. לאחר חזרה על הליך הדיסקציה בהמיספירה השנייה, טבלו את כל ארבע המבחנות בחנקן נוזלי למשך דקה אחת ולאחר מכן אחסנו במקפיא בטמפרטורה של 80- °C.התחל בהוספה של 150 µL של באפר ליזיס לכל 5 עד 10 mg של דגימה על קרח. בצע סוניקציה לכל דגימה על קרח בעוצמה מרבית למשך 5 שניות. לאחר מכן, הדגר על קרח למשך 30 דקות.במהלך הדגירה, ערבבו את הדגימה במיקסר וורטקס (vortex) למשך חמש שניות בכל חמש דקות. לאחר מכן, בצעו שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה על ידי העברת הדגימות לסירוגין לחנקן נוזלי ולפלטת חימום מבוקרת טמפרטורה המכוונת ל-37 °C. לאחר מחזור ההקפאה-הפשרה האחרון, סבבו את דגימות הרקמה בצנטריפוגה ב-1300 Gs בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות.בשלב הבא, שאבו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) והעבירו אותו למבחנה נקייה על קרח. לאחר כימות החלבון בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב, הוסיפו 25 µg של חלבון למבחנת תגובה המכילה 0.8 µL של 10 mM Ac-DEVD-AMC ותמיסות באפר לתגובה, לנפח סופי של 200 µL. עבור דגימות תגובה שליליות, ערבבו 25 µg של חלבון עם 1 µL של 800 µM Ac-DEVD-CHO ו-0.8 µL של 10 mM Ac-DEVD-AMC.דגרו את כל הדגימות והביקורות בחושך למשך שלוש שעות ב-37 degrees Celsius. לאחר תום זמן הדגירה, הפסיקו את התגובה על ידי הוספה של 600 microliters של 0.4 molar glycine ו-0.4 molar sodium hydroxide ב-pH 10 לכל דגימה וביקורת. הוסיפו שני milliliters של מים מזוקקים לכל תגובה בתוך קיובטה מזכוכית.כמת את הפלואורסצנציה באמצעות ספקטרופלואורומטריה. קרא את הביקורות והדגימות במשך 10 שניות, בקצב של קריאה אחת בכל שנייה. לבסוף, כמת את הפעילות הספציפית בכל דגימה בהתאם לנוסחה המוצגת כעת על המסך.היסטוגרמה זו מראה את פעילות ה-caspase-3 באמיגדלה של חולדות שעברו אוטם בשריר הלב. הנתונים מוצגים כאחוז מהפעילות הממוצעת בקבוצות הביקורת (sham), שנקבעו כ-100%. כל קבוצה כללה שמונה חולדות. הכוכבית מציינת הבדל מובהק בין הקבוצות עם ערך p נמוך מ-0.05.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בשבע שעות, לא כולל המרווח שבין הניתוח לאוטם השריר הלבבי לבין דגימת הרקמה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשרות אוטם שריר לבבי בחולדה ולמדוד את פעילות ה-caspase-3 באמיגדלה של החולדה באמצעות ספקטרופלואורומטריה.

caspase-3-activity-rat-amygdala-measured-spectrofluorometry-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

המודל של עכברוש אקוטי אוטם שריר הלב (AMI) כדאי ללמוד תוצאה של MI על תפקוד pathophysiological ופיזיולוגיות לב.

באוטם שריר הלב אצל חולדות

סרטון זה מדגים כיצד למדוד את פעילות הפרוטאזום בתאים תת-תאיים שונים של האמיגדלה הצידית ממוחות של חולדות מותני פחד ולשלוט בהם באמצעות בדיקת פפטיד פלואורוגני. הפרוטאזום חותך את המצע הפפטידי הפלואורוגני, ומשחרר מולקולות פלואורסצנטיות, אשר מכומתות באמצעות קורא לוחות כדי להעריך את פעילות הפרוטאזום בשברים של חלבון גרעיני וסינפטי. פעילות גרעינית מוגברת מצביעה על שינויים בביטוי גנים, בעוד שפעילות סינפטית מופחתת מצביעה על ייצוב חלבונים הנחוץ לתחזוקת הזיכרון לטווח ארוך.

מדידת פעילות פרוטאזום בתאים תת-תאיים שונים במוח החולדה

מודל איסכמיה-רפרפוזיה שריר הלב של לב חולדה משופר על ידי שימוש ב- retractor מתוצרת עצמית, צינור פוליוויניל כלוריד ושיטת קשר ייחודית. אלקטרוקרדיוגרמה, טריפנילטרזוליום כלוריד וכתמים היסטולוגיים, ותוצאות ניתוח הישרדות באחוזים הראו כי לקבוצת המודל המשופרת יש שיעורי הצלחה והישרדות גבוהים יותר מאשר לקבוצת המודל הקיימת כבר.

מודל מכרסמים משופר של איסכמיה שריר הלב ופציעת רפרפוזיה

מודלים של חולדה in vivo הם כלים הכרחיים לחקירת המנגנונים הפתולוגיים והמטרות הטיפוליות לשבץ איסכמי. עבודה זו תתאר ביצוע צביעה אימונופלואורסצנטית בפרוסות מוח עם אוטם לאחר חסימת עורק המוח האמצעי (MCAO) בחולדות.

הערכת איתות מוות תאי על ידי אימונופלואורסצנציה במודל חולדה של שבץ איסכמי

שחזור תלת מימדי (תלת מימדי) של נזק לבבי באוטם שריר הלב החריף (repAMI) מאפשר כימות נאמן ולוקליזציה משותפת של דפוסים המשפיעים על המחלה הקשורים. כאן, ניתנת גישת הדמיה מונחית יריעת אור אוטומטית למדידה בו-זמנית של נזק לבבי, אזור בסיכון ותגובת תאי חיסון.

ניתוח תלת מימד סימולטני של נזק לבבי ותגובה חיסונית באוטם שריר הלב החריף באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור

אינדוקציה כירורגי של נזק מוחי איסכמי בחולדה הוא מודל בשימוש נרחב עבור מחקר שבץ. כאן אנו מדגימים את האינדוקציה של איסכמיה מוחית המוקד על ידי חסימה של עורק המוח האמצעי. ויזואליזציה של האוטם שהתקבל על ידי צביעה היסטולוגית ו דימות בתהודה מגנטית מוצג גם.

דגם מרחק איסכמיה מוחית על ידי ספיגה תפר Endovascular של עורק המוח התיכון עכברוש

פרוטוקול זה מתאר דרך פשוטה וזולה לכמת את הפעילות של cis-הרגולציה אלמנטים (כלומר, משפר / היזמים) לחיות הרשתיות העכבר דרך electroporation explant. הכנת ה-DNA, דיסקציה רשתית, electroporation, תרבות explant רשתית, שלאחר קיבוע ניתוח וכימות מתוארים.

כימות של פעילות Cis-Regulatory אלמנטים ברשתית עכבר ידי electroporation Explant

Live-תא הדמיה של אפופטוזיס caspase-3 בתיווך ב-N19 oligodendrocyte תרבויות הנציח התא...

ביקע ניטור caspase-3 פעילות אפופטוזיס של תאים Oligodendroglial הונצח באמצעות Live-תא הדמיה Cleaveable Fluorogenic-צבע מצעים בעקבות שלילת קוטביות אשלגן-Induced ממברנה

אנחנו מדגימים וריאציות של טכניקה רבת יחידת ההקלטה התאית לאפיין תגובות ריח מעורר בשלושת השלבים הראשונים של מסלול ההרחה חסר חוליות. טכניקות אלה יכולים בקלות להיות מותאמות לבחינת פעילות הרכב במערכות עצביות אחרות גם כן.

שיטות הקלטה בעל מספר יחידות לאפיין את הפעילות עצבית בארבה (<em&gt; Schistocerca אמריקנה</em&gt;) מעגלי ריח

המנגנון העומד בבסיס ההשפעות הטיפוליות של ניתוח גירוי מוחי עמוק (DBS) זקוק לחקירה. השיטות המוצגות בכתב יד זה מתארות גישה ניסיונית לבחינת האירועים התאיים המופעלים על ידי DBS על ידי ניתוח פרופיל ביטוי הגנים של גנים מועמדים שיכולים להקל על נוירוגנזה לאחר ניתוח DBS.

ניתוח שינויי ביטוי הגנים בהיפוקמפוס העכברוש לאחר Deep Brain Stimulation של Anterior התלמוס הגרעין

למדו למדוד פעילות קספאז-3 באמיגדלה של עכברוש לאחר אוטם שריר הלב באמצעות ספקטרופלואורומטריה. שיטה זו מאפשרת לחקור השלכות נוירולוגיות של אירועים לבביים על תפקוד קוגניטיבי ובריאות הנפש.

Caspase-3 פעילות באמיגדלה העכברוש נמדד על ידי Spectrofluorometry לאחר אוטם שריר הלב

גלה סרטונים נוספים