Name: טיהור של כלי מוח עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: למד שיטה לטיהור כלי מוח עכבר תוך שמירה על שלמות מבנית באמצעות סריקה וסינון במהירות נמוכה. פרוטוקול זה מאפשר חקר מחסום דם-מוח בלי צורך באנטיגנים או שבטים טרנסגניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי MemoLife Labex ועל ידי ARSEP (Fondation לשפוך עוזר l&#39;à la משוכלל ונדיר sur la sclérose en לוחות)

1. פתרונות וחומרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות כלי בידוד: B1, להוסיף 1.5 מיליליטר של HEPES 1M 150 מיליליטר של HBSS; B2, להוסיף 3.6 גרם של Dextran 20 מיליליטר של B1; B3, להוסיף 1 גרם של BSA לשל B1 100 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את בעל מסנן על ידי חיתוך החלק התחתון מהחלק העליון הברגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות immunostaining: פתרון קיבוע, Paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS pH 7.4; Permeabilization / פתרון חסימה, לדלל סרום עז 5% וטריטון X100 0.25% ב PBS pH 7.4. הערה: הקיבוע תלוי בסוג של נוגדנים עיקריים בשימוש. </li></ol> 2. Dissection הערה: תנאים סטריליים אינם נדרשים, אלא אם כלי משמשים למטרות תרבות תא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כוס 150 מיליליטר עם 20 מיליליטר של B1. שמור על קרח ולכסות עם parafilm כדי למנוע זיהום אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמוק להרדים את העכבר מתחת למכסת מנוע עם מגבת נייר ספוגה בקטנה 1 מיליליטר של Isoflurane הטהורה שמתווסף into הכלוב. ההרדמה מאומתת על ידי חוסר התגובה לקמצוץ הבוהן. להרוג את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. הערה: צעדים אלה נעשים בעמידה בתקנות לאומיות ומוסדיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: בצע זלוף intracardiac עם 20 מיליליטר של PBS 1x לחסל את תוכן הדם 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף העור עם אזמל מהצוואר לאף ולמשוך אותו משם. הסר את כל שערות זיהום עם PBS 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפתוח את הגולגולת, הכנס ראשון מספריים anteriorly לנורת חוש הריח, ולפתוח את המספריים להתפקע הגולגולת בשני חלקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את המוח בעזרת מרית מוח. לנתח את מקלעת דמית העין מהחדרים לרוחב כפי שהם היו לזהם את הכנת כלי דם 38. הערה: אופציונאלי: ההכנה הסופית תכיל כלי parenchymal וקרומי מוח. אם לא רצוי, ניתן התקלפו קרומי המוח בעקבות ההליך שתואר על ידי 38. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TRansfer המוח לתוך הכוס המכילה פתרון B1 על קרח. ניתן לטפל עד 8 מוחות יחד. </li></ol> Homogenization רקמות 3. מוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שני סכינים, באופן ידני ונמרץ לנצח את המוח בפתרון B1 לאחר מכן קבלת חתיכות קטנות של כ -2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize ההכנה עם homogenizer Dounce automatized, ביצוע 20 מקרי שבץ ב 400 סל&quot;ד. ודא שצינור הזכוכית נשמר בקרח ושחלקו העליון של douncer הוא בפתרון כאשר נע מעלה ומטה, כדי למנוע ההיווצרות של כיסי אוויר. אם כמה דוגמאות מוכנות, לשטוף עם מים מיוננים douncer בין כל הומוגניזציה. </li></ol> טיהור 4. כלי שייט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את homogenate לתוך צינור פלסטיק 50 מ&quot;ל ולהמשיך לצנטריפוגה ב 2000 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. ממשק גדול לבן (בעיקר המיאלין) יהווה בחלקו העליון של גלולה הכלי (אדום אם לא זלוף בוצע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant. גלולה הכלי והממשק הלבן יישארו מחובר יחד. הוסף 20 מיליליטר של תמיסת B2 קר כקרח ולנער את הצינור באופן ידני ונמרץ דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לצנטריפוגה השנייה ב4,400 גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. המיאלין כעת ליצור שכבה לבנה צפופה על פני השטח של supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק בזהירות את שכבת המיאלין מקירות הצינור על ידי מחזיק את הצינור ולאט לאט מסובב אותו כדי לאפשר את supernatant לעבור לאורך הקירות. בטל המיאלין עם supernatant. גלולה המכילה את כלי נשארה מחוברת בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחוק את הקיר הפנימי של הצינור עם נייר סופג הכרוך סביב פיפטה פלסטיק 5 מ&quot;ל ולהסיר את כל נוזלים שיורית, הימנע מלגעת בגלולת הכלי. שמור הפוך צינור על נייר סופג כדי לנקז את נוזלים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את גלולה ב 1 מיליליטר של פתרון B3 קר כקרח על ידי pipetting למעלה ולמטה עם טיפים, keepi נמוך מחייבng הצינור על קרח, ולאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר נוסף של פתרון B3. ודא שכלי מפוזרים ככל האפשר ולא יוצרים אגרגטים. </li></ol> 5. סינון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כוס בקרח עם 30 מיליליטר של תמיסת B3 קר כקרח. לכסות עם parafilm כדי למנוע זיהום אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 20 מיקרומטר מסנן-רשת על בעל מסנן שונה בחלק העליון של בקבוק בקר ולאזן על ידי יישום 10 מיליליטר של תמיסת B3 קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הכנת הכלי על המסנן ולשטוף כלים עם 40 מיליליטר של תמיסת B3 קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את המסנן באמצעות מלקחיים נקיים ולטבול אותו באופן מיידי בכוס המכילה פתרון B3. לנתק את כלי מהמסנן ידי ניעור אותו בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את תוכן הכוס בצינור פלסטיק 50 מיליליטר ו צנטריפוגות ב -2,000 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: לחלופין, ההשעיה של כלי המוח מהשלב 4.6 ניתן לסנן על מסנן מיקרומטר-רשת 100.במקרה זה, כלי גדול יותר נשמרים באופן מועדף על המסנן בזמן הזרימה דרך מכיל microvessels (בעיקר נימים), אשר לאחר מכן מסוננות במסנן 20 מיקרומטר-רשת כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה של microvessels ב 1 מיליליטר של פתרון B3 קר כקרח ולהעביר אותו על ידי pipetting אותו לתוך צינור Eppendorf 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב -2,000 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 6. קיבוע, permeabilization וחסימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כלי על ידי pipetting לתוך 0.2 מיליליטר צינורות PCR המכילים PBS באמצעות קצה מחייב נמוך 1.0 מיליליטר. היזהר שלא לגעת בכולים כפי שהם עשויים לדבוק בחלק החיצוני של הקצה. לבצע את כל השלבים תחת מיקרוסקופ דו עיני הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל אחד מהשינויים בינוניים הבאים, להשאיר את הצינורות על קרח עד כלי הגיעו לתחתית, ופיפטה את רוב הנוזלים באמצעות טיפים pipet ג&#39;ל טעינה ארוכים ודבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את רוב PBS ולהוסיף 200 μl של פתרון מקבע.להשעות את כלי על ידי טלטול בעדינות דגירה במשך 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את הפתרון מקבע ולהחליף אותו עם 200 μl של 1x PBS (השטיפה ראשונה), דגירה של 5 דקות ב RT וחזור על שלב זה 3 פעמים. בכל פעם, לוודא שכלי שכהלכה שקעו לתחתית הצינורות ופיפטה את 1x PBS, הבטחת כלי לא נגעו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה האחרונה, להחליף 1x PBS על ידי permeabilization / פתרון חסימת דגירה שעה 1 ב RT, resuspending כלי על ידי טלטול בעדינות מהעת לעת. </li></ol> 7. Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את permeabilization פתרון החסימה / עם השילוב של נוגדנים עיקריים (ראה אזכור של הנוגדנים המשמשים כאן ודילולים בטבלת תבנית חומרים) בדילול מלא בpermeabilization / פתרון החסימה, ודגירה על 4 מעלות CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 שוטף PBS ב RT, דגירה כלי עם השילוב של נוגדנים משני מדולל PBS לשעה 2ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: אנו ממליצים בחום ביצוע מכתים גרעיני עם Hoechst (1: 2,000) או DAPI (1: 2,000) כדי להבדיל כלי מזיהום אפשרי שערות או אבק מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 שוטף ב PBS, resuspend הכלים בμl 50 של PBS. </li></ol> 8. הרכבה ותצפית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קצה עם נימי זכוכית siliconized: לחתוך קצה פיפטה P200 באמצעות אזמל ולהתאים את הנימים בפנים. הנפח המשוער של הנימים הוא 40 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כלי לשקופית זכוכית באמצעות זכוכית נימי siliconized ולהסיר בזהירות את הנוזל עם פיסת נייר סופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל טיפה אחת של הרכבה בינונית על הספינות ולהחזיק coverslip ב-45 מעלות המאפשר הירידה להפיץ בשולי הפתק. בואו ללכת coverslip ולאפשר בינוניים להפיץ לאט. בוא O היבש / N ב RT עם ההגנה מפני אור. ניתן לצפות כלי תחת fluorescמיקרוסקופ confocal אף אוזן גרון. </li></ol>

<ol><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).</li>
<li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Blood-Brain+Barrier+in+Health+and+Chronic+Neurodegenerative+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders.</a> Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier delivery.</a> Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).</li>
<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li>
<li>Armulik, A., Genové, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Hall, C. N., Reynell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+pericytes+regulate+cerebral+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease.</a> Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).</li>
<li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perivascular+astroglial+sheath+provides+a+complete+covering+of+the+brain+microvessels%3A+an+electron+microscopic+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li>
<li>Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+Metabolism%3A+Focus+on+Astrocyte-Neuron+Metabolic+Cooperation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).</li>
<li>Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+and+neuronal+control+of+brain+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial and neuronal control of brain blood flow.</a> Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).</li>
<li>Iadecola, C., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+regulation+of+the+cerebral+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial regulation of the cerebral microvasculature.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).</li>
<li>Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+brain+microvessels%3A+a+purified%2C+metabolically+active+preparation+from+bovine+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex.</a> Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).</li>
<li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li>
<li>Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+metabolically+active+capillaries+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier.</a> Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745(1991).</li>
<li>Boado, R. J., Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain-type+glucose+transporter+mRNA+is+specifically+expressed+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).</li>
<li>Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+the+blood-brain+barrier%3A+Distribution+of+enzymes+between+the+luminal+and+antiluminal+membranes+of+brain+capillary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells.</a> Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Blood-Brain+Barrier+Transcriptome%3A+A+New+Resource+for+Understanding+the+Development+and+Function+of+Brain+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells.</a> PLoS ONE. 5 (10), e13741(2010).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-Sequencing+Transcriptome+and+Splicing+Database+of+Glia%2C+Neurons%2C+and+Vascular+Cells+of+the+Cerebral+Cortex.%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
<li>Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sarcoglycan+complex+is+expressed+in+the+cerebrovascular+system+and+is+specifically+regulated+by+astroglial+Cx30+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9(2015).</li>
<li>Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+quiescence+of+the+brain+is+set+by+astroglial+Connexin+43%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).</li>
<li>Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+vessels+from+the+mouse+brain+for+gene+expression+analysis+using+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection.</a> Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).</li>
<li>Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+CNS+microvascular+endothelium+by+immune-guided+laser-capture+microdissection+coupled+to+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR.</a> Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).</li>
<li>Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Ex+Vivo+Laser-induced+Spinal+Cord+Injury+Model+to+Assess+Mechanisms+of+Axonal+Degeneration+in+Real-time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).</li>
<li>Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+pericytes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Central nervous system pericytes in health and disease.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).</li>
<li>Ezan, P., André, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+astroglial+connexins+weakens+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).</li>
<li>Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+at+the+gliovascular+interface%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Signaling at the gliovascular interface.</a> The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).</li>
<li>Dubois, L. G., Campanati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliomas+and+the+vascular+fragility+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418(2014).</li>
<li>Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+metabolically+active+capillaries+from+rat+brain1%2C2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2.</a> Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).</li>
<li>Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+microvessels%3A+the+blood-brain+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544(1978).</li>
<li>Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+brain+microvessels%3A+preparation%2C+morphology%2C+histamine+and+catecholamine+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Vessels%22%5BJournal%5D)">Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents.</a> Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).</li>
<li>Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+transport+of+vitamin+D+and+A+derivatives+through+the+rat+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier.</a> Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).</li>
<li>Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+and+canine+endothelial+cells+from+brain+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels.</a> Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).</li>
<li>Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+endothelial+cells+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of endothelial cells from rat brain.</a> Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).</li>
<li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).</li>
<li>Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+brain+capillary+endothelial+cells+exhibit+improved+barrier+properties+under+the+influence+of+hydrocortisone%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone.</a> Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).</li>
<li>Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+capillary+endothelium+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Primary culture of capillary endothelium from rat brain.</a> In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).</li>
<li>Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Visual+Description+of+the+Dissection+of+the+Cerebral+Surface+Vasculature+and+Associated+Meninges+and+the+Choroid+Plexus+from+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li>
<li>Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+Method+to+Isolate+Rat+Brain+Capillary+Endothelial+Cells+by+Magnetic+Cell+Sorting+and+Dominant+mRNA+Expression+of+Multidrug+Resistance-associated+Protein+1+and+4+in+Highly+Purified+Rat+Brain+Capillary+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells.</a> Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).</li>
<li>Warren, M. S., Zerangue, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+gene+expression+profiles+of+ABC+transporters+in+brain+microvessel+endothelial+cells+and+brain+in+five+species+including+human%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human.</a> Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).</li>
<li>Geier, E. G., Chen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+Solute+Carrier+Transporters+in+the+Human+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).</li>
<li>Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+Resistance-Related+Transport+Proteins+in+Isolated+Human+Brain+Microvessels+and+in+Cells+Cultured+from+These+Isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates.</a> Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).</li>
<li>Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+self-assembled+spheroidal+model+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier.</a> Sci Rep. 3, 1500(2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מחסום דם-המוח מסדיר את המעבר של חומרים פיסיולוגיים ולצאת של מערכת העצבים המרכזית ומגן עליו מפני חומרים מזיקים הנמצאים בדם. הוא מעורב במספר פתולוגיות של מערכת העצבים המרכזית, כוללים מחלות ניווניות 2 וגידולים במוח 28. החדירות נמוכות מאוד של BBB פוגעות גם המעבר של סוכנים טיפוליים מיקוד תאים עצביים והפיתוח של שיטות מתכוונות לפתוח BBB הפיך ללא השלכות מזיקות למוח הוא תחום מאוד פעיל של מחקר 3. מאמצים רבים נעשו כדי לפתח מודלים רבים-ערך וטכניקות המאפשרות חק...

תפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית (CNS) דורש סביבה תאית פיקוח הדוק, והדרישות מטבולים שלה הן עצומות בהשוואה לאיברים אחרים 1. מערכת העצבים המרכזית היא גם מאוד רגישה למגוון רחב של כימיקלים, בדרך כלל לא מזיק לאיברים היקפיים אבל לזה, רעיל למערכת עצבים. כדי להבטיח תפקוד נכון, רוב כלי הדם &quot;של מערכת העצבים המרכזית מהווה מחסום אנדותל; את מחסום דם-המוח (BBB), אשר שולט על הזרימה של מולקולות ויונים, כמו גם המעבר של תאי מערכת חיסון בין הדם והמוח, ובכך שמירה על הומאוסטזיס נכון 2, אבל גם מגביל את הכניסה של תרופות טיפוליות, טיפולים ובכך פוגעים הפרעות נוירולוגיות של 3. ברמה התאית, BBB הוא בעיקר שנגרם צמתים הדוקים נרחבים בין תאי האנדותל, ביטוי מקוטב של מובילי זרימה וקצב transcytosis נמוך מאוד 4. מאפיינים ופונקציות של BBB בעיקר נגרמים על ידי neתאי ighboring 4. בפרט, pericytes לשחק תפקיד חשוב בגרימה ושמירה על BBB 5,6. להיות תאי התכווצות, pericytes גם לווסת את זרימת דם 7 כפי שעושה תאי שריר החלק סביב כלי גדול. לבסוף, האסטרוציטים, תאי גלייה העיקריים של המוח, לשלוח תהליכים גדולים בשם endfeet סביב ביותר של כלי הדם במוח ולווסת 8 שלמות BBB וקפאון חיסוני 9, העברת מטבוליטים לנוירונים 10, ולגרום לצימוד ההדוק בין פעילות העצבית ו זרימת דם 11,12. היכולת ללמוד את המאפיינים המולקולריים ותאיים של מערכת כלי הדם במוח היא קריטית כדי לאפיין טובים יותר את תרומתה לפיזיולוגיה של המוח וphysiopathology. כדי להתמודד עם שאלה זו, אסטרטגיות לבודד את מערכת כלי הדם במוח של המוח פותחו, המאפשרים להכנה של שברי כלי המוח שלמים. עמ &#39;כלי המוחיurification תחילה תאר באמצעות מוח שור 13 ומשופרים ומותאם למינים אחרים, במכרסמים בפרט 14. במחקר האחרון, השימוש במסננים בגדלים שונים הוצג להפריד כלי מוח לשברים מועשרים בכלי בקטרים ​​שונים. מעניין לציין, בהכנות כגון, תאי האנדותל שמרו את הנכסים שלהם מטבולי 15, פונקציונלי טרנספורטר 16 וקיטוב 17. כאן, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול זה ולהפגין עוד כי כלי מבודדים לשמר רובם במבנים באתר. תאי האנדותל להישאר מקושרים על ידי צמתים הדוקים ומוקפים lamina בסיס מתמשך. Pericytes ותאי שריר חלק נשארים צמודים לשכבת האנדותל, כמו גם קרומי astrocyte perivascular. עם זאת, האסטרוציטים, תאי microglial, תאי עצב וoligodendrocytes בוטלו. לבסוף, אנו מתארים הליך לביצוע immunostaining על כלי מוח מבודדים. </p&gt; עד עכשיו רוב המחקרים המולקולריים ותאיים הנוגעים למערכת כלי הדם במוח בוצעו על תאי מוח כלי מטוהרים ניתקו באמצעות זני תא ספציפיים עכבר כתב או נהלים מבוססי immunostaining 18,19 מיון תאים. למרות שטכניקות אלו מאפשרת הבידוד של אוכלוסיות תאי כלי דם במוח כמעט טהורות, תאים מבודדים לאבד לחלוטין באתר המורפולוגיה שלהם ואינטראקציות, אשר בתורו, במידה רבה משפיעה על התכונות מולקולריות ותאיות שלהם. הפרוטוקול מתואר כאן, המאפשר לבידוד של שברי כלי דם במוח כולו ללא צורך בנוגדנים ספציפיים או כתמי עכבר מהונדסים, מציע אלטרנטיבה טובה כמו המבנה הכללי של כלי מוח מבודדים נשמרת, כך, הפחתת השלכות על המאפיינים המולקולריים שלהם. כלי מבודדים עשויים לשמש ללימוד פעילות גן, סינתזת חלבון ורגולציה בBBB כלאחרונה תיארו 20,21 </sup&gt;. לבסוף, בהשוואה לmicrodissection ללכוד לייזר 22,23 הפרוטוקול הנוכחי הוא זול, קל לביצוע ומהירות להתאמה לכל מעבדה.

<table><tbody><tr><td>מטחנת רקמות גודל C</td> צנטריפוגה <td>מדעית תומס</td><td>3431E25</td><td></td></tr><tr><td>5415&nbsp; R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5811000320</td><td></td></tr> מערכת קומפקטית <tr><td>סטריאומיקרוסקופ מודולרית</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td>בעלת ביצועים גבוהים</tr><tr><td>מספקת איכות גבוהה Leica LED1000</td><td></td><td>Leica</td> LED1000 <td></td></tr><tr><td>קצות כריכה נמוכים (P1000)</td><td>Sorenson BioScience</td><td>14200T</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מסנן Swinnex 47 מ"מ PP 8/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=SX0004700">SX0004700</a></td><td></td></tr><tr><td>ניילון מסנן דיסק מסנן נטו הידרופילי 20 ומיקרו; m 47 מ"מ 100/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY2004700">NY2004700</a></td><td></td></tr><tr><td>ניילון דיסק מסנן נטו הידרופילי 100 ומיקרו; m 47 מ"מ 100/pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700</a></td><td></td></tr><tr><td>קיר סטנדרטי צינור בורוסיליקט</td><td>מכשיר סאטר</td><td>B150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>1014356290F</td><td></td></tr><tr><td>החלקות כיסוי, עובי 1</td><td>תרמו מדעי</td><td>P10143263NR1</td><td></td></tr><tr><td>0.2 מ"ל צינורות דקי דופן וכובע כיפה</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0266</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; PARAFILM M (גודל גליל 4 אינץ' וזמנים; 125 רגל)</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדום</td><td>טכנולוגיית Life</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14175129">14175-129</a></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>טכנולוגיית חיים</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרן מ-Leuconostoc spp. מר ~ 70,000</td><td>סיגמא</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Euromedex</td><td>ET330</td><td></td></tr><tr><td>16% פורמלדהיד (w/v), ללא מתנול&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה בינונית Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>איזולקטין GS-IB4 מבית Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 מצומד; דילול 1/100</td><td>Life technology</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>Agrin (ארנב) ; דילול 1/400</td><td>מסופק באדיבות על ידי Dr Markus A Ruegg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti ZO-1 (עכבר, שיבוט 1A12)</td> <td>Life technology</td><td>33-9100</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>Anti Smooth Muscle Actin (עכבר, שיבוט 1A4)</td> <td>Sigma</td><td>A2547</td><td>&nbsp; דילול 1:500</td></tr><tr><td>Anti GFAP (עכבר, שיבוט GA5)</td><td>Sigma</td><td>G3893</td><td>&nbsp; דילול 1:500</td></tr><tr><td>Anti AQP4 (ארנב)</td><td>Sigma</td><td>A5971</td><td>&nbsp; דילול 1:500</td></tr><tr><td>Anti Cx43 (עכבר, שיבוט&nbsp; 2)</td><td>BD Biosciences</td><td>610061</td><td>&nbsp; דילול 1:500</td></tr><tr><td>אנטי אוליג2 (ארנב)</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>&nbsp; דילול 1:200</td></tr><tr><td>Anti NF-M (עכבר)</td> <td>מסופק על ידי ד"ר ביט מ. רידרר, אוניברסיטת לוזאן, שוויץ.</td><td>&nbsp; דילול 1:10</td><td></td></tr><tr><td>אנטי איבה1 (ארנב)</td><td>וואקו</td><td>019-19741</td><td>&nbsp; דילול 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עיזים נגד עכבר IgG (H+L) טכנולוגיית נוגדן</td><td>חיים</td><td>A11029</td><td>&nbsp; דילול 1:2,000</td></tr><tr><td>נוגדן משני IgG (H+L) נגד ארנב עזים, Alexa Fluor 488 מצומד</td><td>טכנולוגיית חיים</td><td>A11034</td><td>&nbsp; דילול 1:2,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technology</td><td>A21424</td><td>&nbsp; דילול 1:2,000</td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד ארנב IgG (H+L), Alexa Fluor 555 מצומד</td><td>טכנולוגיית חיים</td><td>A21429</td><td>&nbsp; דילול 1:2,000</td></tr></tbody></table>

טיהור של כלי מוח עכבר

Purification of Mouse Brain Vessels

במוח, רוב מערכת כלי הדם מורכב ממחסום בררני, מחסום דם-המוח (BBB) ​​המסדיר את חילופי מולקולות ותאי מערכת חיסון בין המוח והדם. יתר על כן, הדרישה המטבולית העצבית הענק דורשת רגולציה רגע לרגע של זרימת דם. יש לציין, חריגות של תקנות אלה הם סימני ההיכר של etiological ביותר פתולוגיות המוח; כולל גליובלסטומה, שבץ מוחי, בצקת, אפילפסיה, מחלות ניווניות (לשעבר: מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר), גידולים במוח, כמו גם מחלות דלקתיות כגון טרשת נפוצה, דלקת קרום מוח ותפקוד מוח הנגרם על-אלח דם. לפיכך, הבנת אירועי איתות ויסות הפיסיולוגיה כלי הדם במוח הוא אתגר גדול. תובנה הרבה לתוך המאפיינים התאיים ומולקולריים של סוגי התאים השונים המרכיבים את מערכת כלי הדם במוח יכולה להיות שנרכשו מהתרבות העיקרית או מיון תא מרקמת המוח טרי ניתק. למרות זאת,מאפיינים כגון קוטביות תא, מורפולוגיה ויחסים בין תאית אינם מתוחזקים בהכנות כאלה. הפרוטוקול שאנו מתארים כאן נועד לטהר שברי כלי מוח, תוך שמירה על שלמות מבנית. אנו מראים כי כלי מבודדים מורכבים מתאי האנדותל החתומים על ידי צמתים הדוקים שמוקפים lamina בסיס מתמשך. Pericytes, תאי שריר חלק, כמו גם את קרומי endfeet astrocyte perivascular נשארים צמודים לשכבת האנדותל. לבסוף, אנו מתארים כיצד לבצע ניסויי immunostaining על כלי מוח מטוהרים.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר לבידוד המכני של כלי מוח 14. איור 1 מסכם את השלבים העיקריים של טכניקה זו. הארכיטקטורה של כלי מוח היא מורכבת וכוללת מספר סוגי תאים, כלומר, תאי האנדותל חתום על ידי צמתים הדוקים ומוקף pericytes, תאי שריר חלק, ותהליכי רגל astrocyte 9. לפיכך, לאחר הבידוד של כלי מוח, אנחנו מכוונים כדי לאפיין את המבנה של כלי מטוהרים על ידי immunostaining כפי שמתוארת בחלק השני של הפרוטוקול שלנו. Agrin, רכיב של lamina בסיס אנדות...

אנו מתארים פרוטוקול המאפשר טיהור של תא כלי הדם של מוח העכבר. כלי מוח מבודדים כוללים תאי אנדותל המקושרים בצמתים הדוקים ומוקפים בלמינה בסיסית רציפה, פריציטים, תאי שריר חלק בכלי הדם, כמו גם ממברנות אסטרוגליאליות סביב כלי הדם.

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

המטרה הכללית של הפרוצדורה היא לטהר את המדור הווסקולרי (כלי הדם) של מוח העכבר תוך שמירה על השלמות המבנית שלו, באמצעות סדרה של סבבי צנטריפוגה במהירות נמוכה וסינונים, ללא צורך בנוגדנים ספציפיים או זנים טרנסגניים. נעשו מאמצים רבים לפיתוח טכניקות המאפשרות חקר תאי, מולקולרי ופרמקולוגי של מחסום הדם-מוח. היעדרם של שלבי הפרדה, מדרגי ריכוז (גרדיאנטים), עמודות או צנטריפוגה במהירות גבוהה הופכים את טיהור כלי הדם במוח באמצעות פרוצדורה זו לפשוטה, מהירה וזולה מאוד.כלי הדם של המוח יישארו שלמים מבחינה מבנית, כאשר תאי האנדותל יהיו אטומים באמצעות צמתי מהדקים ומוקפים על ידי הטבחות הבסיס, תאי שריר חלקים וקרומי אסטרוציטים פרי-וסקולריים. פרוטוקול זה יכול לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע לתפקוד המדור הווסקולרי של ה-CE ולאפשר את חקר הרכב המולקולרי שלו; הליך זה יודגם על ידי פוסט-דוקטור מצוותו של Martin Coen S. לפני תחילת ההליך, חתכו את החלק התחתון של חלק ההברגה העליון של מחזיק המסנן.לאחר מכן, השתמשו בסקאלפל כדי לחתוך את העור מהעורף של העכבר ועד לאף, ומשכו את העור לאחור. שטפו את הגולגולת עם PBS כדי להסיר שערות המזהמות את האזור, ולאחר מכן הכניסו מספריים לגולגולת בחלק הקדמי לבצבעים הריחניים (olfactory bulbs). פתחו את המספריים כדי לפרק את הגולגולת לחלקים והוציאו את המוח באמצעות השפכטל.בשלב הבא, הפרידו את הפלקסוס החורואידי (choroid plexus) מהחדרים הצדיים והעבירו את המוח לכלי כימי בנפח 150 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר של תמיסת B1 על קרח. לאחר מכן, השתמשו בשני סקלפלים כדי לקצוץ בעוצמה את המוח לרסיסי רקמה בגודל של 2 מילימטר, והשתמשו בהומוגניזר אוטומטי כדי להומוגנז את הרקמה למשך 20 תנועות במהירות של 400 RPM על קרח. כדי לטהר את כלי הדם, העבירו את ההומוגנאט לפטלה פלסטית בנפח 50 מיליליטר וסובבו את עיסת הרקמה במערכת צנטריפוגה.בצנטריפוגה בעלת רוטור מתנדנד, תיווצר בחלקו העליון של משקע הכלי שכבה לבנה רחבה המורכבת בעיקר ממיילין. השליכו את העליון, הוסיפו 20 milliliters של תמיסת B two קרה מאוד, ונערה את המבחנה בעוצמה במשך דקה אחת. לאחר צנטריפוגה שנייה, המיילין ייווצר כשכבה לבנה דחוסה על פני השטח של העליון.סובב את המבחנה באיטיות כדי לאפשר לתמיסה B two לזרום לאורך הדופן בזמן המזיגה, והשלך את המיאלין יחד עם העילום. לאחר מכן, השתמש בפיפט פלסטיק עטוף בנייר סופג כדי להסיר שאריות נוזל מדפנות המבחנה. הימנע מלגעת במשקע הכלי והפוך את המבחנה על קרח.בשלב הבא, השעו את המשקע ב-1 mL של תמיסת B three קרה (בטמפרטורת קרח), ולאחר מכן הוסיפו 5 mL נוספים של תמיסת B three, תוך הקפדה שהוסיקולות לא יגבשו. כעת, הניחו מסנן רשת ניילון של 20 מיקרון על גבי ביקר ושטפו את המסנן ב-10 mL של תמיסת B three קרה לאיזון. שפכו את תכשיר הוסיקולות על המסנן ושטפו בזהירות את כלי העבודה עם 40 mL נוספים של תמיסת B three קרה.לאחר מכן, השתמשו בפינצטה נקייה כדי להעביר מיד את המסנן לכלי כימי המכיל 30 milliliters של תמיסת B three טרייה, ושטפו את כלי המסנן בערעור עדין. שפכו את תכולת הכלי לתוך מבחנה פלסטית של 50 milliliters. לאחר סבוב צנטריפוגה, השביו את המשקע (pellet) ב-1 milliliter של תמיסת B three קרה מאוד (בטמפרטורת קרח) לפני הצביעה האימונולוגית.העבירו את כלי הדם לשפופרות PCR בנפח 0.2 מיליליטר והניחו את השפופרות על קרח עד לשקיעת משקע הרקמה לתחתית השפופרות. לאחר מכן, השתמשו בקצות טפטוף להטענת ג'ל (gel loading tips) כדי לשאוב את רוב הנוזל. בשלב הבא, הכניסו קפילרית זכוכית סיליקונית בקוטר 40 מיקרומטר לתוך קצה של פ pipette P 200, והשתמשו בקפילרית כדי להעביר את כלי הדם למסקירי זכוכית. כאשר כלי הדם שקעו, הסירו בזהירות את הנוזל באמצעות פיסת נייר סופג.לאחר מכן, טפטפו טיפה אחת של מדיום עיגון (mounting medium) על הכלי והניחו זכוכית כיסוי בזווית של 45 מעלות, תוךما מתירים למדיום העיגון להתפשט לאורך קצה הזכוכית עד להנחתו של כיסוי הזכוכית. בתמונה זו ניתן להבחין בסימון RIN רציף מסביב לתאי אנדותל עצביים, מה שמאשר את שימור הלמינה הבזאלית על הכלי המזוהה. רכיבים של צומת מהדק אנדותליאלי, כגון ZO one, מזוהים אף הם על הכלי המזוהה.בנוסף, סימוני NG two ו-smooth muscle actin מעידים על שימור של טפילים שלמים ותאי שריר חלק וסקולריים, בהתאמה. חלבוני ממбраנה של אסטרוגליות פרי-וסקולריות, connection 43 ו-Aquaporin four, מזוהים אף הם על פני כלי הדם המופרדים, מה שמעיד על שימור נוסף של ממברנות אסטרוציטים פרי-וסקולריים במהלך תהליך ההפרדה; עם זאת, על כלי הדם המבודדים נצפו רק סיבים קצרים ומפוזרים חיוביים ל-GFAP, מה שמעיד כי גופי התא של האסטרוציטים לא הופרדו יחד עם כלי הדם. רק מספר קטן של סיבים עצביים נותרים צמודים לכלי הדם.באופן דומה, לא זוהו תאים חיוביים ל-IBA one ו-oli two, מה שמאשר שמיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים אינם מטוהרים יחד. אנו ממליצים בחום להסיר את הפלקסוס הנוכחי לפני הומוגניזציה של המוח, שכן חווינו זאת כמקור אפשרי לזיהום; עבדו באזור נקי והימנעו מזיהום של שיער ואבק, מכיוון שלנוגדנים יש זיקה לא ספציפית גבוהה לחומרים אלו.חשוב גם לבצע תמיד צביעה גרעינית במקביל. ניתן להסיר תאי דם מהכליים המזוהים על ידי ביצוע פרפוזיה תוך-לבבית עם PBS לפני הוצאת הכליים. חלצנו בהצלחה RNA וחלבונים מכליים שזוהו באמצעות הליך זה, הן מלוחיות של כלי דם שהוכנו טריים והן מאלו שהיו קפואים.השתמשנו גם בגששים פלואורסצנטיים ובמיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לחקור את תפקודי ההובלה האנדותליאליים של כלי הדם ex vivo. אנו מאחלים לכם בהצלחה בניסוייכם.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

במאמר זה, אנו מציגים טכניקה פשוטה, מעשית ליציקת כלי דם במוח כי הוא קל לביצוע, יכול להיות מנוצל על התמונה עץ כלי דם של המוח עכבר מבוגר.

יציקה של כלי דם במוח העכבר למבוגרים הדמיה 3D ו ניתוח מורפולוגי

סרטון זה מדגים בידוד של כלי דם שלמים ממוחו של עכבר המהווים את מחסום הדם-מוח (BBB) יחד עם תאי עצב ותאי גלייה. כלי הדם המבודדים יכולים לשמש כמודל במבחנה כדי לחקור את תפקידם בשמירה על הומאוסטזיס מוחי.

בידוד כלי דם במוח של עכבר: פרוטוקול לבידוד כלי דם שלמים מדגימת מוח מורין

סרטון זה מדגים את בידוד הנימים ממוחות חזיריים טריים. התהליך כולל הסרת קרומי המוח, בידוד החומר האפור מרקמת המוח, הומוגניזציה וסינון של החומר האפור כדי לבודד את הנימים, ולבסוף שימוש בעיכול אנזימטי כדי לטהר את הנימים עוד יותר.

טיהור נימים ממוח חזירי

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד פריציטים מוחיים ממוח עכבר. התאים המבודדים מתורבתים במדיה ספציפית לפריציטים כדי לקדם את התפשטות הפריציטים.

בידוד וטיפוח פריציטים מוחיים של עכברים

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד צינורות האנדותל מפרנכימה מוחית של עכבר. באמצעות שילוב של עיכול אנזימטי ודיסוציאציה מכנית, התהליך מניב צינור שלם עם תאי אנדותל.

הכנת צינורות אנדותל מוחיים מעורקים פרנכימליים של עכבר

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMEC) מחוברים זה לזה על ידי חלבוני צומת ספציפיים היוצרים מחסום מווסת מאוד המפריד בין הדם למערכת העצבים המרכזית (CNS), מה שנקרא מחסום דם-מוח (BBB). הבידוד של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח העכברים, כפי שנדון בפרוטוקול זה, מאפשר מחקרי מבחנה מפורטים של BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

אנו מתארים כאן פרוטוקול הניתן לשחזור לבידוד מעגל העכבר של וויליס.

פרוטוקול בידוד לחוג עכבר של וויליס

אנחנו מציגים פרוטוקול להפקת. קרום המוח של מורציטים פרוטוקול זה הינו כלי רב ערך עבור מחקרים בלתי מתורבת המספקים טוהר גבוה ותשואה גבוהה, ובכך מקטין את מספר החיות הנסיוניות המשמשות.

שיטת פלט גבוהה כדי לבודד קרום הלב של מוחין מהעכבר

הכנה אינטנסיבית של "צינורות" אנדותל מוחיים של עכבר שלמים מעורקיים פרנצ'ימליים מוחיים מודגמת לחקר ויסות זרימת הדם במוח. יתר על כן, אנו מדגימים את החוזקות הניסיוניות של מודל מחקר אנדותל זה להדמיית פלואורסצנטיות ומדידה אלקטרופיזיולוגית של מסלולי איתות תאיים מרכזיים, כולל שינויים בתאיים [Ca2+] ופוטנציאל הממברנה.

בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

אנו מדגימים התרחבות כימית של כלי דם גדולים בעכברים כמודל לחקר תפקוד לקוי של כלי הדם במוח, אשר יכול לשמש עבור מודלים של דמנציה וסקולרית ואלצהיימר. אנו גם מדגימים הדמיה של כלי הדם על ידי הזרקת תרכובת גומי סיליקון ומתן הדרכה חזותית ברורה למדידת שינויים בגודל כלי הדם.

גישה חזותית לגרימת דוליכואקטזיה בעכברים כדי למדל תפקוד לקוי של כלי דם גדולים בתיווך כלי דם במוח

למד שיטה לטיהור כלי מוח עכבר תוך שמירה על שלמות מבנית באמצעות סריקה וסינון במהירות נמוכה. פרוטוקול זה מאפשר חקר מחסום דם-מוח בלי צורך באנטיגנים או שבטים טרנסגניים.

טיהור של כלי מוח עכבר

גלה סרטונים נוספים