טיהור של כלי מוח עכבר

המטרה הכוללת של ההליך היא לטהר את תא כלי הדם של מוח העכבר תוך שמירה על שלמותו המבנית, באמצעות סדרה של צנטריפוגות וסינון במהירות נמוכה ללא צורך בנוגדנים ספציפיים או זנים טרנסגניים. נעשו מאמצים רבים לפתח טכניקות המאפשרות חקירות תאיות, מולקולריות ותרופתיות של מחסום הדם-מוח. היעדר הפרדה, שיפועים, נקודתיים או צעדי צנטריפוגה במהירות גבוהה הופך את טיהור כלי המוח על ידי הליך זה לקל מאוד, מהיר וזול.

כלי המוח יישארו שלמים מבחינה מבנית כאשר תאי האנדוט אטומים על ידי צומת תגים ומוקפים בטפילי הלנאר הבסיסיים, תאי השריר S של כלי הדם וממברנות אסטרו-וסקולריות. פרוטוקול זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לתפקוד תא כלי הדם CE ולאפשר לחקור את ההרכב המולקולרי שלו המדגים את ההליך יהיה פוסט-דוקטורט מצוות מרטין כהן S. לפני תחילת ההליך, חתכו את החלק התחתון של חלק ההברגה העליון של מחזיק המסנן.

לאחר מכן השתמש באזמל כדי לחרוט את העור מצוואר העכבר לאף ולמשוך את העור לאחור. שטפו את הגולגולת עם PBS כדי להסיר שערות מזהמות, ולאחר מכן הכניסו זוג מספריים לגולגולת הקדמית לנורות הריח. פתחו את המספריים כדי לקרוע את הגולגולת לחלקים והסירו את המוח בעזרת המרית.

לאחר מכן, נתחו את מקלעת הכורואיד מהחדרים הצדדיים והעבירו את המוח לכוס של 150 מיליליטר המכילה 20 מיליליטר של B תמיסה אחת על קרח. לאחר מכן השתמשו בשני אזמלים כדי לחתוך במרץ את המוח לשני שברי רקמה של מילימטר, והשתמשו בהומוגנייזר אוטומטי למטה כדי להומוגניזציה של הרקמה ל-20 משיכות ב-400 סל"ד על קרח. כדי לטהר את הכלים, העבירו את ההומוגנאט לצינור פלסטיק של 50 מיליליטר וסובבו את תמיסת הרקמות.

בצנטריפוגת רוטור מתנדנדת, ייווצר ממשק לבן גדול המורכב בעיקר ממיאלין בחלק העליון של כדור הכלי. השליכו את הסופרנטנט ב-20 מיליליטר תמיסת B 2 קרה כקרח, ונערו את הצינור במרץ במשך דקה אחת. לאחר צנטריפוגה שנייה, המיאלין ייצור שכבה לבנה צפופה על פני השטח של הסופרנטנט.

סובב לאט את הצינור כדי לאפשר לתמיסת B 2 לרוץ לאורך הקיר בזמן שהוא נשפך החוצה והשליך את המיאלין עם הסופרנטנט. לאחר מכן השתמש בפיפטה מפלסטיק עטופה בנייר סופג כדי להסיר שאריות נוזל מדפנות הצינור. הקפד לא לגעת בכדור הכלי ולהפוך את הצינור על קרח.

לאחר מכן, החייאה, השעו את הגלולה במיליליטר אחד של תמיסת B 3 קרה כקרח, ואחריה תוספת של עוד חמישה מיליליטר של תמיסת B שלוש תוך הקפדה שהכלים לא ייווצרו אגרגטים. כעת הניחו מסנן רשת ניילון 20 מיקרון על גבי בקבוק בקר ואזנו את המסנן עם 10 מיליליטר תמיסת B 3 קרה כקרח. שופכים את תכשיר הכלי על המסנן ושוטפים בזהירות את הכלים עם עוד 40 מיליליטר תמיסת B 3 קרה כקרח.

לאחר מכן השתמש במלקחיים נקיים כדי להעביר מיד את המסנן לכוס המכילה 30 מיליליטר של תמיסת B 3 טרייה, ולחבר את הכלים מהפילטר בניעור עדין. שופכים את תכולת הכוס לצינור פלסטיק של 50 מיליליטר. לאחר מכן לאחר צנטריפוגה, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של תמיסת B שלוש קרה כקרח לפני צביעה חיסונית.

העבירו את הכלים לצינורות PCR של 0.2 מיליליטר והניחו את הצינורות על קרח עד למשקעי הרקמה בתחתית הצינורות. לאחר מכן השתמש בטיפים לטעינת ג'ל כדי לשאוב את רוב הנוזל. לאחר מכן, הכנס נימי זכוכית סיליקון של 40 מיקרומטר לקצה פיפטה P 200, והשתמש בנימי כדי להעביר את הכלים למגלשת זכוכית כאשר הכלים התייצבו הסר בזהירות את הנוזל בעזרת פיסת נייר סופג.

לאחר מכן טען טיפה אחת של מדיום הרכבה על הכלים והחל החלקת כיסוי בזווית של 45 מעלות, מה שמאפשר למדיום ההרכבה להתפשט לאורך קצה הזכוכית עד להחלקת הכיסוי במקומה. בתמונה זו, ניתן לראות תיוג RIN רציף סביב תאי אנדותל עצביים המאשר את החזקת הלמינה הבסיסית על כלי הדם המטוהרים. רכיבים של הצמתים ההדוקים של האנדותל, כגון ZO one, מתגלים גם על הכלים המטוהרים.

יתר על כן, סימון NG two ושריר חלק מצביעים על שימור של טפילים שלמים ותאי שריר חלק בכלי הדם, בהתאמה. חיבור חלבוני ממברנה אסטרו-גליאלית פריבסקולרית 43 ואקוופורין ארבע מתגלים גם על פני הכלים המטוהרים, מה שמדגים את השמירה הנוספת של ממברנות אסטרוציטים פריווסקולריות במהלך תהליך הטיהור, רק סיבים חיוביים מפוזרים וקצרים של GFAP, עם זאת, נצפים על הכלים המבודדים החושפים את גופי תאי האסטרוציטים אינם מטוהרים במשותף. רק מעט סיבים עצביים נשארים מחוברים לכלי הדם.

באופן דומה, גם תאים חיוביים של IBA 1 ו-oli 2 לא זוהו, מה שמאשר כי מיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים אינם מטוהרים במשותף. אנו ממליצים בחום להסיר את מקלעת הזרם לפני הומוגניזציה של המוח מכיוון שחווינו אותו כמקור אפשרי לזיהום, לעבוד באזור נקי ולהימנע מזיהום שיער ואבק. מכיוון שלנוגדנים יש זיקה גבוהה ולא ספציפית לחומרים אלה.

כמו כן, חשוב תמיד לבצע גם צביעה גרעינית. ניתן להוציא תאי דם מכלי הדם המטוהרים על ידי ביצוע זלוף תוך לב עם PBS לפני שאיבת הכלי. הוצאנו בהצלחה אוויר וחלבונים מכלי שיט שטוהרו בהליך זה מפלטות כלים טריים או קפואים.

השתמשנו גם בבדיקות פלואורסצנטיות ובמיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לחקור את תפקוד ההובלה האנדותל ex vivo של כלי הדם. אנו מאחלים לך בהצלחה בניסויים שלך.