VDJ-Seq: ניתוח רצף עמוק של ג'ין שרשרת מחדש Immunoglobulin כבד לחשוף את דפוסים משובטים אבולוציה של לימפומה B הסלולרי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפיין את ההרכב הקלונאלי של דגימות לימפומה לצורך זיהוי דפוסי אבולוציה קלונאלית של הישנות לימפומה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הלימפומה, כגון האופן שבו גידולים חוזרים נובעים מהגידולים המקוריים. היתרון המרכזי של פרוטוקול זה הוא שהוא מתאים את טכנולוגיית הריצוף בעלת התפוקה הגבוהה העדכנית ביותר כדי לאפשר מיפוי מקיף יותר של מאפיינים משותפים בלימפומה.

בפרוטוקול זה, DNA יופק מחתכים דקים של רקמה נורמלית או ממאירה המוטמעת ב-OCT קפוא, וכן מרקמה מקובעת בפורמלין ומוטמעת בפראפין, על מנת להפיק DNA מרקמות המוטמעות ב-OCT קפוא. ראשית, יש לעכל 10 עד 30 חתכים דקים ב-4 mL של nucleic lysis buffer עם protase K ו-0.625% SDS באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה. למחרת, יש להוסיף 1 mL של sodium chloride רווי בריכוז 5 M לתערובת העיכול, לנער בעוצמה למשך 15 שניות, ולסובב בצנטריפוגה במהירות של 1,100 ×g למשך 15 דקות.

בטמפרטורת החדר, העבירו את הנוזל העליון למבחנה חדשה של 15 מיליליטר לצנטריפוגה. הוסיפו שני נפחים של 100% ethanol, ערבבו על ידי הפיכת המבחנה שש עד שמונה פעמים, וסובבו בצנטריפוגה ב-5,000 ×g למשך 60 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כדי לאסוף את ה-DNA המשקע, שטפו את משקע ה-DNA פעמיים עם 70% ethanol וסובבו בצנטריפוגה ב-5,000 ×g למשך 15 דקות בכל פעם.

כדי לאסוף את המשקע, המסס את משקע ה-DNA ב-100 עד 400 µL של תמיסת TE בטמפרטורת החדר על שייקר למשך לילה, במטרה להפיק DNA מחתכים דקים של רקמה מקובעת בפורמלין ומוטמעת בפרפין. ראשית, בצע דה-פרפיניזציה על ידי דגירה של חתכי הפרפין ב-1 mL של xylene פעמיים, בטמפרטורת החדר, למשך 10 דקות בכל פעם. אסוף את חתכי הרקמה על ידי סבוב ב-13,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

בשלב הבא, הסר שאריות של xylenes על ידי דגירה של החתכים ב-1 mL של 100% Ethanol פעמיים בטמפרטורת החדר, למשך 10 דקות בכל פעם. אסוף את חתכי הרקמה על ידי סבוב ב-13,000 ×g למשך חמש דקות. ייבש את החתכים באוויר בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות.

הוסיפו תמיסת protease שהוכנה טרי לדגימות לנפח סופי של 50 עד 100 µL והדגירו למשך לילה ב-37 °C. ביום למחרת, חממו את הדגימות ב-95 °C למשך 10 דקות כדי לבטל את פעילות ה-proteinase. תנובת ה-DNA מההפקות שהודגמו במקטע הקודם היא 5 עד 200 µg, תלוי בגודל הרקמה.

השלב הבא הוא הערכת האיכות של כל דגימת DNA בתערובת של מבחנת PCR. שפפו 25 microliters של TDNA polymerase יחד עם 45 microliters של master mix מערכה מסחרית של סולם (ladder kit). הוסיפו חמישה microliters של DNA למבחנת ה-PCR וערבבו היטב על ידי פיפוט למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים.

הגבירו את ה-DNA בהתאם לתנאים המפורטים בטקסט הפרוטוקול. לאחר מכן, ערבבו 20 µl מתגובת ה-PCR עם ארבעה µl של loading dye בריכוז six x וטענו על ג'ל agarose בריכוז 2% . עם סיום האלקטרופורזה, צבעו את ג'ל ה-AGROS ב-Ethereum bromide וזהו את תוצרי ה-PCR.

באמצעות מערכת לדימוי ג'ל, הדגימות המניבות חמישה תוצרי PCR בגדלים של 100, 200, 300, 400 ו-600 זוגות בסיסים ישמשו ליצירת אמפליקונים של VDJ בלבד. בסרטון זה יודגם תהליך ההגברה של מקטע I-G-H-V-D-J שחובב מאזור המסגרת הראשון (framework region one) או IGV HFR one. הגברת מקטע I-G-H-B-D-J שחובב מאזור המסגרת השני מתבצעת בהליך דומה ומתוארת בטקסט הפרוטוקול תחת תערובת מבחנת PCR.

45 µL של תערובת מאסטר (master mix) מהמבחנה המסומנת כתערובת שתיים (mix two) של ערכה מסחרית לבדיקת IGH HYPERMUTATION סומטית לזיהוי בג'ל, 0.25 µL של TAC DNA polymerase וחמישה µL של DNA מהדגימה. הגבירו את ה-DNA בהתאם לתנאים המתוארים בטקסט הפרוטוקול. כדי להגביר DNA שאינו אופטימלי, ניתן להתאים את תנאי ה-PCR על ידי הארכת זמן הגיבוב (annealing time) או הגדלת מספר מחזורי ההגברה. הפרדו את כל תוצרי ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה בג'ל AGROS בריכוז 2% וצבעו אותו. צבעו את ג'ל ה-AGROS בתמיסת אתידיום ברומיד (ethidium bromide) בריכוז 0.5 µg/mL וזהו את תוצרי ה-PCR.

במערכת לדימוי ג'ל, צפוי אמפליקון מונוקלונאלי בטווח גדלים של 310 עד 380 זוגות בסיסים. גזרו את חלק הג'ל המכיל את האמפליקון המונוקלונאלי. לאחר מכן, טהרו את ה-DNA מהחלק שנגזר מהג'ל באמצעות ערכה סטנדרטית להפקת ג'ל לפי פרוטוקול היצרן.

כדי להתחיל בפרוצדורה זו, העבירו את תוצר ה-V-D-J-P-C-R המטוהר לשפופרת PCR והוסיפו Resus suspension buffer מהערכה להכנת דגימות DNA כדי להגיע לנפח של 60 microliters. הוסיפו 40 microliters של end repair mix מהערכה להכנת דגימות DNA, ערבבו היטב ודגרו את התגובה בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך 30 דקות בטרמוסייקלר שחומם מראש עם מכסה שחומם מראש ל-100 degrees Celsius. לאחר מכן, ערבבו 136 microliters של חרוזי מגנט ו-24 microliters של מים בדרגת PCR בשפופרת של 1.5 milliliter, העבירו את כל תגובת ה-end repair לשפופרת וערבבו היטב עם תמיסת החרוזים.

הנח את המבחנות על מעמד מגנטי למשך שתי דקות כדי לאפשר את הפרדת החרוזים מהתמיסה. שאב את הנוזל העליון (supernatant) ושטוף את החרוזים פעמיים עם ethanol 80% שהוכן טרי. שאב את תמיסת ה-ethanol לחלוטין והשאר את החרוזים להתייבש באוויר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר 15 דקות, הוציאו את המבחנות מהמעמד המגנטי והשעיקו מחדש את החרוזים ב-17.5 microliters של Resus Suspension Buffer. החזירו את המבחנות למעמד המגנטי למשך שתי דקות כדי להפריד את החרוזים מה-Resus Suspension Buffer. העבירו את ה-Resus Suspension Buffer, המכיל כעת את תוצר תיקון הקצוות (end repair), למבחנת PCR נקייה.

השלב הבא הוא הוספת זנב a לתוצר תיקון הקצוות. הוסף 12.5 microliters של תערובת a tailing לשפופרת ה-PCR המכילה את תוצר תיקון הקצוות וערבב היטב. דגרי את שפופרות ה-PCR בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 30 דקות בטרמוסייקラー שחומם מראש עם מכסה שחומם מראש ל-100 degrees Celsius.

עבור ליגציית מתאמים, הוסף 2.5 µL של תמיסת Resus suspension buffer,‏ 2.5 µL של תערובת ליגצייה (ligation mix) ו-2.5 µL של מתאם DNA index לתגובת ה-a-tailing. דגרי את התגובה בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות בטרמוסייקラー שחומם מראש עם מכסה שחומם מראש ל-100 °C. לאחר 30 דקות, הוסף 5 µL של תמיסת stop ligation buffer לכל תגובה וערבב היטב.

הוסף 42.5 µL של חרוזי מגנט מעורבבים היטב לכל תגובה ושטוף עם 80% ethanol כפי שהודגם קודם לכן. הוסף 50 µL של Resus suspension buffer כדי לאלוט את התוצר המחובר לאדפטור. נקה את התוצר המחובר לאדפטור פעם שנייה באמצעות 50 µL של חרוזי ampu XP מעורבבים היטב, ואלוט את התוצר ב-25 µL של Resus Suspension Buffer לתוך מבחנה נקייה ל-PCR.

כדי להגביר את ה-VDJ Amplicon, הוסף חמישה µL של תערובת פריימרים ל-PCR ו-25 µL של PCR master mix לשפחור ה-PCR המכיל את תוצר הליגציה של האדפטור וערבב היטב; בצע את ההגברה בטרמוסייקלר בהתאם לתנאים המתוארים בטקסט הפרוטוקול. עם סיום ההגברה, נקה את התגובה באמצעות 50 µL של חרו지를 מגנטיים שערבבו היטב, ואלוט את התוצר הסופי ב-30 µL של Resus Buffer. ספריית ה-VTJ Amplicon עוברת לאחר מכן ולידציה, איסוף (pooling) וריצוף כפי שמתואר בטקסט הפרוטוקול.

מכיוון שהמורכבות של ספריית הריצוף של VVG נמוכה, אנו ממליצים להוסיף "ספייק-אין" (spike-in) של 20% עד 50% של דגימות ריצוף מאושרות כדי לאפשר קריאת בסיסים מדויקת. תמונות ג'ל מייצגות אלו מראות תוצרי Amplicon של V-D-J-P-C-R מ-DNA שהופק מדגימות של חולי לימפומה. איכות ה-amplicon של V-D-J-P-C-R לפני ואחרי בניית הספרייה הוערכה באמצעות bioanalyzer.

השינוי בגודל מ-334 bp ל-459 bp מעיד על הוספת המתאם למעקב אחר האבולוציה הקלונלית של מקרה של חזרה של לימפומה מסוג diffuse large B cell. בוצע ניתוח פילוגנטי של פרופילי המוטציות ההיפר-סומטיות (SHM) של העיבודים המרכזיים של VDJ בשרשרת הכבדה בין דגימות האבחנה והחזרה.

נצפה דגם של אבולוציה קלונאלית דיוורגנטית מאוחרת. פותחו שיטות גרפיות חדשות להדמיה של אבולוציה קלונאלית. התבניות המוצגות הן תרשימי scaling רב-ממדי של מודל רלפס עם דיוורגנציה מאוחרת ומודל רלפס עם דיוורגנציה מוקדמת.

רדיוס כל עיגול מציין את מספר תתי-השבטים התואמים לפרופיל SHM מסוים. כחול מייצג את דגימת האבחנה, ואדום מייצג את דגימת ההישנות. באופן דומה, גרפים לא מכוונים מראים כי התפלגות מספרי תתי-השבטים במקרה של התבדרות מאוחרת שונה מזו שבמקרה של התבדרות מוקדמת.

הקצוות תואמים לשני פרופילי SHM עם מרחק מחרוזת של הפרדה של אות אחת, וסרגל קנה המידה של הצבעים מציין את פרופורציית הרצפים הממופים לפרופיל SHM מסוים התואם לדגימת האבחנה האדומה, או לדגימת ההישנות הצהובה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להימנע מזיהומים צולבים בין הדגימות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מעריכים את האיכות של דגימות גידולים של לימפומה.

ניתן להשתמש בגישה זו גם למעקב אחר מחלה מינימלית שיורית (minimal residual disease) ולבדיקת תגובת המעקב החיסוני לסרטנים. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.