באמצעות מבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות נשימה microplate תפוקה הגבוה

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשתמש בטכנולוגיה למדידת צריכת חמצן המבוססת על מיקרופלטה, כדי להעריך את התפקוד של שרשרת העברת האלקטרונים, מעגל ה-TCA, מסלול בטא-חמצון ונשאי סובסטרט. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת תמיסאות הסובסטרט וההזרקה עבור הבדיקה. השלב השני הוא הוספת תמיסאות ההזרקה לקרטריג' tric assay שהושרה מראש, כדי לכלול את מכשיר מדידת צריכת החמצן.

בשלב הבא, הכינו את תמיסות הסובסטרט המיטוכונדריאליות והעמיסו תמיסות אלו לתוך פלטת תרבית התאים. סובבו את פלטת תרבית התאים כדי לאפשר היצמדות של המיטוכונדריה לתחתית הבאר לפני העמסת הפלטה למכשיר ה-Respira metric assay. תוצאות המכשיר המתקבלות מראות את שיעורי צריכת החמצן המבוססים על נשימה מיטוכונדריאלית עבור כל בדיקת respiro metric.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אלקטרודת קלארק (Clark Electrode), הוא שטכנולוגיות המבוססות על פלטות מיקרו מאפשרות רכישה יעילה יותר ובעלת תפוקה גבוהה יותר של צריכת חמצן עם כמויות קטנות יותר של מיטוכונדריה. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בקושי בשל כלל השלבים המעורבים בהכנת התמיסות לבדיקה. בלילה שלפני הניסוי, יש להשרות את מחסנית הבדיקה ב-1 mL של תמיסת כיול באינקובטור שאינו מכיל CO2 בטמפרטורה של 37 °C. ביום למחרת, הוציאו את כל הדגימות הקפואות והמיסו אותן במכחול או באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. הכינו את כל תמיסות התסריט (substrate) ותמיסות ההזרקה ושמרו אותן על קרח. השלב הבא הוא לתכנת את מכשיר המדידה של צריכת חמצן בריבוי בארות לפרמטרי המשקל והמדידה של הערבוב המתאימים.

היכנסו לתוכנת הניתוח ובחרו במצב הסטנדרטי. היכנסו לפורום האורחים של seahorse ולחצו על נצח הבדיקה (assay wizard). לאחר הכניסה לנצח הבדיקה, לחצו על הפרוטוקול כדי לשנות את משקלי התערובת ואת פרמטרי המדידה.

סמנו את בארי הרקע תחת לשונית תיקון הרקע (back correction) וודאו שהם מודגשים. בצעו תיקון רקע. סמנו את התנאים על ידי לחיצה תחילה על לשונית הקבוצות והתוויות (groups and labels), ולאחריה על לשונית מידע על הקבוצה (group info).

לאחר הזנת פרמטרים אלה, לחצו על end ולאחר מכן על save template. כדי להתחיל את ההליך, טענו את תמיסות ההזרקה למחסנית הרצת הבדיקה. הקפידו להזריק את התמיסות לפתחים המתאימים.

הטעינו את מחשבבת הרצת הבדיקה למכונה, כאשר הפינה עם השקע פונה לפינה השמאלית התחתונה. התחילו את הכיול תחילה על ידי כניסה לתוכנת הניתוח ולאחר מכן כניסה למצב הסטנדרט (standard mode). היכנסו לפורום האורחים של seahorse.

פתחו את התבנית השמורה בכונן XF תחת לשונית התבניות. לאחר הפתיחה, לחצו על start כדי להתחיל את הכיול, שייקח כ-30 דקות. המיטוכונדריה להליך זה בודדו משריר שלד אדום; ערבבו בעדינות אך ביסודיות את מלאי התשתית המיטוכונדריאלית על ידי ערבוב עדין של התמיסה באמצעות קצה של טיפ פפיט של 200 µL, שגזזו מקצהו כ-3 מ"מ.

לאחר קביעת ריכוז החלבון של מלאי המיטוכונדריה, השעו 10 µg של חלבון מיטוכונדריאלי ל-200 µL של תערובת הסובסטראט הידועה succinate. ערבבו את תמיסת המיטוכונדריה והסובסטראט בעדינות אך ביסודיות, על ידי ערבוב עדין של התמיסה בעזרת טיפ פיפט של 200 µL שקצהו נגזז בכ-3 mm באותו אופן. השעו 14 µg של חלבון מיטוכונדריאלי ל-200 µL של כל אחת מתערובות הסובסטראט הנותרות. הניחו את כל תערובות הסובסטראט והחלבון המיטוכונדריאלי על קרח.

הניחו פלטת תרבית תאים בעלת 24 בארות על קרח, וטענו בשלוש חזרות 50 µL לכל בארה מכל אחת מתערובות התסביס למיטוכונדריה. מפתחי בדיקת ה-tric מבוססת המיקרופלטה ממליצים להשאיר לפחות שתי בארות ריקות ללא מיטוכונדריה, רצוי בכל צד של פלטת תרבית התאים. סובבו את פלטת תרבית התאים ב-2000 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי להצמיד את המיטוכונדריה לבארות בזמן סיבוב הפלטה.

חממו את תמיסות התסבס בבן-מריחa בטמפרטורה של 37 °C. לאחר סיום הספין, העבירו בזהירות 450 µL מכל תמיסת תסבס אל תוך הבארים המתאימות. וודאו כי טעינת הפלטה מתבצעת בטמפרטורת החדר.

מלאו בארות ריקות ב-500 microliters של בלאנק של תסביב. בארות המיועדות לבדיקת זרימת אלקטרונים צריכות להיות מלאות בתסביב עבור בדיקת זרימת אלקטרונים, בעוד שניתן למלא את בארות הבלאנק של הבדיקה המשולבת בכל תסביב של בדיקה משולבת. לאחר הוספת 450 microliters של תסביב לכל בארה, בחנו את שכבת המיטוכונדריה בבארת בהגדלה של 20x כדי לוודא שהמיטוכונדריה מפוזרות באופן אחיד בשכבה אחת (monolayer).

כפי שניתן לראות בדוגמה זו, ניתן להסיר לאחר שלב ה-oc בארות דימוי שבהן לא נראה כי נוצרה שכבה חד-שכבתית (monolayer) בעלת התפלגות אחידה. לאחר אישור ההיצמדות המיטוכונדריאלית, העבירו את פלטת תרבית התאים למכשיר בדיקת ה-Respir metric. לחצו על אישור.

המכונה תוציא את לוח השירות ששימש קודם לכיול. הוציאו את לוח השירות והניחו על המגש את לוח תרבית התאים המכיל את המיטוכונדריה. יש להניח את השקע הכחול שבלוח תרבית התאים בפינה השמאלית התחתונה של המגש.

לחצו על "המשך" (continue) כדי להתחיל את הרצת הבדיקה, שארכה כ-40 דקות. עם סיום ההרצה, לחצו על "הוצא" (eject) במסך כדי להוציא את פלטת תרבית התאים. לאחר הוצאת הפלטה, הסירו והשליכו את פלטת תרבית התאים ואת המחסנית.

לחצו על המשך (continue) על המסך. ההרצה תישמר באופן אוטומטי כקובץ XLS בתיקיית קובצי הנתונים. פתחו קובץ זה ושנו את התצוגה מ-O2 ל-OCR על ידי לחיצה על החץ הפונה כלפי מטה תחת סמן ה-Y one.

לאחר מכן, שנו את הגדרת נקודת האמצע לשיעורי נקודה לנקודה (point to point rates) תחת האפשרות "rate data displayed". לחצו על אישור. כדי להחיל שינויים אלו, לחצו על לשונית "well group mode" בפינה השמאלית התחתונה של המסך כדי לקבץ יחידות בארות בעלות תנאים דומים יחד.

לבסוף, לחצו על לשונית השגיאה הסטנדרטית של ממוצע הדגימות (sample mean standard error) הממוקמת במרכז המסך מצד שמאל. ניתן להגדיר פקודות אלו גם לפני ביצוע הבדיקה. עקומות אלו מייצגות קצבי צריכת חמצן או OCR לעומת זמן עבור ארבע בדיקות צימוד.

הפאנל הראשון מייצג את מצב 2, נשימה או נשימה בהיעדר DP. הפאנל השני, לאחר הזרקה של A DP, מייצג נשימה מצומדת מרבית, המכונה גם נשימת מצב 3. הפאנל השלישי, לאחר הזרקה של אוליגומייסן (oligo mycin), מייצג נשימה הנובעת מדליפת פרוטונים, המכונה גם נשימת מצב 4 oh.

הפאנל הרביעי לאחר הזרקת FCCP מייצג נשימה מקסימלית נפרדת (uncoupled), המכונה גם נשימה במצב State three U. הפאנל החמישי לאחר הזרקת antimycin A מייצג עיכוב של הנשימה החמצונית. לכל מצבי המיטוכונדריה יש סטיית תקן מינימלית בשל ערבוב יסודי של מלאי המיטוכונדריות ותערובות הסובסטרט המיטוכונדריאליות, והשגת שכבה אחת (monolayer) של מיטוכונדריות לאחר סבב ספינמרקז להצמדה.

לעומת זאת, טעינה של כמויות לא שוות של מיטוכונדריה בכל באר ואי-השגת שכבה אחת (monolayer) של מיטוכונדריה מובילות לסטיית תקן מוגברת בכל מצב, כפי שניתן לראות בעקבה הכחולה, המראה ערכי OCR מעל 1,500 ole לדקה, וכן לירידה בשיעורי הנשימה במהלך תקופת המדידה, המודגמת על ידי הירידה בערכי השיעור מנקודה לנקודה. שימו לב כי העקבה האדומה מראה שיעורים עקביים מנקודה לנקודה וערכי OCR מקסימליים הנמוכים מ-1,500 ole לדקה. עומס יתר של חלבון מיטוכונדריאלי עלול להוביל גם לדליסת החמצן בתוך המיקרו-תא של הבאר, ובכך למנוע מדידה מדויקת של OCR עבור כל מדידה עוקבת, כפי שניתן לראות בעקבה הכחולה, המראה ערכי O2 השואפים לאפס במהלך תקופת המדידה, וכן ערכי O2 התחלתיים מופחתים משמעותית לאחר כל מדידה עוקבת.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להפעיל סבלנות בעת ערבוב המיטוכונדריה עם תמיסאות הסובסטרט. לאחר שליטה בשיטות אלו, ניתן לבצע ניסויים נוספים כדי לענות על שאלות כגון: כיצד משפיעים טיפולים תרופתיים המכוונים נגד נשא סובסטרט מסוים על צריכת החמצן המיטוכונדריאלית?