באמצעות מבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות נשימה microplate תפוקה הגבוה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בטכנולוגיית צריכת חמצן מבוססת מיקרופלייט כדי להעריך את תפקוד שרשרת הובלת האלקטרונים, מסלול חמצון בטא של מחזור TCA ומובילי מצע. זה מושג על ידי הכנת המצע ופתרונות ההזרקה לבדיקה. השלב השני הוא להוסיף את תמיסות ההזרקה למחסנית בדיקת טרי מיובשת בעבר כדי לכייל את מכונת צריכת החמצן.

לאחר מכן, הכינו את תמיסות המצע המיטוכונדריאלי וטענו את התמיסות הללו בצלחת תרבית התאים. סובב את לוחית תרבית התאים כדי לאפשר היצמדות מיטוכונדריאלית לצלחת היטב לפני טעינת הצלחת לבדיקה המטרית של Respira. מתקבלות תוצאות מכשירים המציגות שיעורי צריכת חמצן המבוססים על נשימה מיטוכונדריאלית עבור כל מבחן מטרי רספירו.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו אלקטרודת קלארק, הוא שטכנולוגיות מבוססות מיקרופלייט מאפשרות רכישת תפוקה יעילה וגבוהה יותר של צריכת חמצן עם כמויות קטנות יותר של מיטוכונדריה, בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל כל החלקים הנעים המעורבים בהכנת הפתרונות לבדיקה בלילה שלפני הניסוי מחסנית בדיקת טרי הידראט במיליליטר אחד של תמיסת כיול ב אינקובטור CO2 ב-37 מעלות צלזיוס למחרת, הוציאו את כל הגבעולים הקפואים והפשירו אותם באמבט או באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. הכן את כל תמיסות המצע ותמיסות ההזרקה ואחסן אותם על קרח. השלב הבא הוא לתכנת את מכונת מדידת צריכת החמצן מרובת הבארות לפרמטרי משקל התערובת והמדידה המתאימים.

היכנס לתוכנת הניתוח ובחר את המצב הסטנדרטי. היכנס לפורום האורחים של סוסון הים ולחץ על אשף הבדיקה. לאחר אשף הבדיקה, לחץ על פרוטוקול כדי לשנות את משקל התערובת ופרמטרי המדידה.

סמן את בארות הרקע תחת לשונית התיקון האחורי והקפד להדגיש. בצע תיקון רקע. סמן את התנאים על ידי לחיצה תחילה על הכרטיסייה קבוצות ותוויות, ולאחר מכן על כרטיסיית פרטי הקבוצה.

לאחר הזנת פרמטרים אלה, לחץ על סיום ואחריו שמור תבנית. כדי להתחיל בהליך זה, טען את תמיסות ההזרקה למחסנית הפעלת בדיקה. הקפד להזריק את התמיסות ליציאות המתאימות.

טען את מחסנית הפעלת הבדיקה למכונה עם פינה מחורצת בפינה השמאלית התחתונה. התחל את הכיול על ידי כניסה תחילה לתוכנת הניתוח ולאחר מכן כניסה למצב הסטנדרטי. היכנסו לפורום האורחים של סוסון הים.

פתח את התבנית השמורה תחת XF Drive תחת הכרטיסייה תבניות. לאחר הפתיחה, לחץ על התחל כדי להתחיל בכיול, שייקח כ-30 דקות. המיטוכונדריה להליך זה בודדו משריר השלד האדום בעדינות אך ערבבו היטב את מלאי מצע המיטוכונדריה על ידי ערבוב עדין של התמיסה עם קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר שכשלושה מילימטרים מקצהו נחתך.

לאחר קביעת ריכוז החלבון של מלאי המיטוכונדריה, החייאת 10 מיקרוגרם של חלבון מיטוכונדריאלי לכל 200 מיקרוליטר של תערובת הסובסטרט הידועה של ריקבון סוקסינט. מערבבים את תמיסת מצע המיטוכונדריה בעדינות אך ביסודיות על ידי ערבוב עדין של התמיסה עם קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר שכשלושה מילימטרים מקצהו נחתך באותו אופן. Reeses Band, 14 מיקרוגרם של חלבון מיטוכונדריאלי לכל 200 מיקרוליטר מכל אחת מתערובות הסובסטרט הנותרות מניחות את כל תערובות הסובסטרט המיטוכונדריאלי על קרח.

הניחו צלחת תרבית תאים של 24 בארות על קרח ובעומס משולש 50 מיקרוליטר לבאר מכל אחת מתערובות מצע המיטוכונדריה. מפתחי בדיקת הטריקים המבוססת על מיקרופלייט ממליצים להשאיר לפחות שתי בארות ריקות ללא מיטוכונדריה, רצוי משני צידי צלחת תרבית התאים. סובב את צלחת תרבית התאים ב -2000 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להדביק את המיטוכונדריה לבארות בזמן שהצלחת מסתובבת.

מחממים את תמיסות המצע באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר השלמת הסחיטה, טען בזהירות 450 מיקרוליטר מכל תמיסת מצע על גבי הבארות המתאימות. הקפד להעמיס את הצלחת בטמפרטורת החדר.

טען בארות ריקות עם 500 מיקרוליטר מצע ריק. בארות המיועדות לבדיקת זרימת האלקטרונים צריכות להיות טעונות במצע זרימת האלקטרונים ואילו את הבארות הריקות של הבדיקה המשולבת ניתן להעמיס בכל מצע בדיקת צימוד. לאחר הוספת 450 מיקרוליטר של מצע לכל אחד, צפה היטב בשכבת המיטוכונדריה בבאר בהגדלה של פי 20 כדי להבטיח שהמיטוכונדריה מתפזרת באופן שווה בשכבה חד-שכבתית אחת.

כפי שמוצג בדוגמה זו, ניתן להסיר בארות תמונה שלא נראה שיש להן שכבה חד-שכבתית מפוזרת באופן שווה לאחר oc. לאחר אישור ההיצמדות למיטוכונדריה, קח את לוחית תרבית התאים למכשיר הבדיקה המטרית של הנשימה. לחץ על אישור.

המכונה תפלוט את לוחית השירות ששימשה קודם לכן לכיול. הסר את לוחית השירות והנח את לוחית תרבית התאים המכילה את המיטוכונדריה על המגש. יש למקם את החריץ הכחול בצלחת תרבית התאים בפינה השמאלית התחתונה של המגש.

לחץ על המשך כדי להתחיל את ריצת הבדיקה, שנמשכת כ-40 דקות. לאחר השלמת הריצה, לחץ על הוצא על המסך כדי להוציא את לוחית תרבית התאים. לאחר פליטת הצלחת, הסר והשליך את לוחית תרבית התאים והמחסנית.

לחץ על המשך על המסך. הריצה תישמר אוטומטית כקובץ XLS בקובץ הנתונים. פתח את זה file ושנה את התצוגה מ-O2 ל-OCR על ידי לחיצה על החץ כלפי מטה מתחת לסמן Y one.

לאחר מכן, שנה את נקודת האמצע לשיעורי נקודה לנקודה תחת נתוני השער המוצגים כאופציה. לחץ על אישור. כדי להחיל שינויים אלה, לחץ על הכרטיסייה מצב קבוצת באר בפינה השמאלית התחתונה של המסך כדי לקבץ בארות בתנאים דומים יחד.

לבסוף, לחץ על לשונית השגיאה הסטנדרטית הממוצעת לדוגמה לכיוון אמצע המסך משמאל. ניתן להגדיר פקודות אלה גם לפני הבדיקה. מעקבים אלה מייצגים את שיעורי צריכת החמצן או OCR לעומת הזמן לארבע בדיקות צימוד.

הפאנל הראשון מייצג את המצב השני, נשימה או נשימה בהיעדר DP. הפאנל השני לאחר הזרקת A DP מייצג נשימה מצומדת מקסימלית, הנקראת גם נשימה במצב שלוש. הפאנל השלישי לאחר הזרקת אוליגו מיצין. A מייצג נשימה עקב דליפת פרוטון, הנקראת גם נשימה במצב ארבע OH.

הפאנל הרביעי לאחר הזרקת FCCP מייצג נשימה מקסימלית ללא צימוד, הנקראת גם נשימת U במצב שלוש. הפאנל החמישי לאחר הזרקת אנטימיצין A מייצג את עיכוב הנשימה החמצונית. לכל המצבים המיטוכונדריאלים יש סטיית תקן מינימלית עקב ערבוב יסודי של מלאי המיטוכונדריה ותערובות הסובסטרט המיטוכונדריה והשגת שכבה אחת של מיטוכונדריה לאחר סיבוב ההדבקה.

לעומת זאת, העמסת מיטוכונדריה לא שווה בכל באר ואי השגת שכבה אחת של מיטוכונדריה מובילה לסטיית תקן מוגברת בכל מצב, כפי שמצוין על ידי העקבה הכחולה, המציגה ערכי OCR מעל 1,500 ole לדקה, כמו גם ירידה בשיעורי הנשימה במהלך תקופת המדידה המודגמת על ידי הירידה בערכי קצב מנקודה לנקודה. שים לב שהעקבה האדומה מציגה קצבי נקודה לנקודה עקביים וערכי OCR מקסימליים הם מתחת ל-1,500 ole לדקה. עומס יתר של חלבון מיטוכונדריאלי יכול גם להוביל לתשישות החמצן בתוך תא המיקרו של הבאר, ובכך למנוע מדידה מדויקת של OCR עבור כל מדידה עוקבת כפי שמצוין על ידי ה-Blue Trace, המראה ערכי O2 המתקרבים לאפס במהלך תקופת המדידה, כמו גם ערכי O2 התחלתיים מופחתים משמעותית לאחר כל מדידה עוקבת.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שיהיו מטופלים בעת ערבוב המיטוכונדריה ותמיסות הסובסטרט. לאחר שליטה בשיטות אלה, ניתן לעוות ניסויים נוספים על מנת לענות על שאלות נוספות כגון, כיצד טיפולים ממוקדי תרופות בטרנספורטר סובסטרט מסוים משפיעים על צריכת החמצן המיטוכונדריאלי?