לומד קהילות חיידקים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקים מודל לבדיקת האינטראקציות בין חיידק בודד לבין פטרייה בודדת. מודל זה יכול לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום האינטראקציות של פתוגנים, כגון אילו גורמים מעורבים בתקשורת (cross-talk) ובדיאלוג בין-מיני. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שלנתונים המופקים ממודל in vivo זה יש רלוונטיות קלינית.

להחדרה אינטראנזאלית של הפטרייה, שאיसबसे תחילה לדלל 2×10⁶ CFU של C.albicans למילילטר ב-PBS סטרילי. לאחר מכן, לאחר אישור של אובדן רפלקס ההישרות בעכבר בוגר היפוטוני, שאבו לפחות 50 µL של ת сусפנזיית הפטריות לפיפט של 200 µL. כעת, אחזו בעכבר ביד אחת והפכו את בעל החיים כך שיהיה מונח על גבו כאשר בטנו פונה כלפי מעלה.

כאשר העכבר נמצא במקומו, השתמשו באצבע המורה של היד האוחזת בעכבר כדי לתמוך בראש, ובבוהן כדי להחזיק את הלסת סגורה, והזיזו את קצה הפ pipette קרוב לאפו של בעל החיים. לאחר מכן, טפטפו בזהירות טיפה של 50 microliter של פטרייה על הנחיריים, ואפשרו לטיפה להישאף באמצעות הנשימה הספונטנית של העכבר. הניחו את העכבר לבדו בכלוב עד להחלמתו המלאה.

ארבעה ימים לאחר ההחדרה של C.albicans, גלחו את הבטן של בעל החיים שהורקה, ולאחר מכן בצעו עיקור באתנול של העור החשוף. לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי לפתוח את העור מהסטרנום (עצם החזה) ועד למרכז הבטן. לאחר מכן, הרחיבו את החתך לאורך כלוב הצלעות משני צדי קו האמצע וקפלו לאחור את העור משני צדי בית החזה.

כאשר כלוב הצלעות נראה, בצעו חתך אנכי משני צידי החזה לכיוון הבריחויות, והשתמשו בעצם הסטרנום כדי להגביה את כל דופן החזה הקדמית כדי לחשוף את הלב והריאות. לאחר מכן, באמצעות מזרק שעבר הפרינזציה מראש, נקבו את הלב בסמוך לעורק התוך-חדרי, ושאבו לפחות 500 µL של דם. הניחו את דגימת הדם על קרח.

לאחר מכן, בצעו חתך צווארי בקו האמצע כדי לחשוף את הקנה. בצעו דיסקציה זהירה של הפסציה סביב הקנה, ולאחריה הצבת תפר מתחת לקנה. לאחר מכן, השתמשו במחט גavage משונה בכיול 20-gauge כדי לבצע קטטרציה של הקנה, תוך קיבוע הקנולה באמצעות התפר שהוצב קודם לכן.

כדי לבצע שטיפה ברונכואלוולארית, יש להזריק בעדינות 500 µL של PBS קר מאוד אל תוך הריאה. לאחר מכן, יש לשאוב את נוזל השטיפה ולהעבירוו אל מבחנת צנטריפוגה של 2 mL על קרח. לאחר איסוף של שני דגימות נוספות של 500 µL, יש להוציא את הריאות מבית החזה ולהניח נתח ריאה בתוך מבחנת צנטריפוגה של 1.5 mL לאחסון מיידי בטמפרטורה של 80- °C.

לאחר מכן, העבירו חתיכה נוספת של רקמת ריאה לתוך מבחנת המוליזה שנשקלה מראש ומכילה PBS על קרח. לבסוף, בצעו חתך בצדו השמאלי של הבטן. הוציאו את הטיפקס (Spleen) למבחנה שנייה המוליזה המכילה מיליליטר אחד של PBS והניחו את המבחנה על קרח.

מודל התמדה של ארבעה ימים מושג על ידי התקנה תוך-אפית של 5×10⁵ CFU של C.albicans לכל עכבר. במהלך ארבעה ימים אלו, העכברים עולים במשקל, אך אינם מראים פגיעה ריאתית. עם זאת, ככל שמספר ה-CFU של התוסף עולה, כך עולה גם חומרת הפגיעה הריאתית.

עם הפגיעה המקסימלית בריאות שנצפתה בין 24 ל-36 שעות לאחר ההדבקה. העומס החיידקי, לעומת זאת, מראה ירידה של log 1 של CFU למיליליטר בכל 24 שעות, כאשר נצפתה עלייה מצטברת של הפצת החיידקים לאורך כל יום. בשטיפה ברונכואלוולולרית שנלקחה מעכברים מדובקים, נגייסים נויטרופילים באופן נרחב, כאשר ספירת תאים דיפרנציאלית מראה אוכלוסיית תאי חיסון חודרים המורכבת מ-90 אחוז נויטרופילים ו-10 אחוזים של מקרופאגים ולימפוציטים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ניתוח של שטיפת ברונכואלוולרית, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לאפיון התגובה הדלקתית. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להחזיק בהבנה טובה של האופן שבו בונים קולוניזציה של Pseudomonas. אל תשכחו שעבודה עם Candida לומניסצנטית עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן למניעת זיהום מרסס, בעת ביצוע הליך זה.