13 בינואר 2016
בעוד שמחקר במבחנה של אינטראקציות מארח-פתוגן מאפשר אפיון של תגובות חיסוניות ספציפיות, מודלים in vivo נדרשים כדי להתבונן בהשפעות של תגובות מורכבות. באמצעות חשיפה לקנדידה אלביקנס ואחריה זיהום ריאות בתיווך Pseudomonas aeruginosa, הקמנו מודל עכברי של אינטראקציות מיקרוביאליות המעורבות בפתוגניות של דלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבנות מודל לחקר האינטראקציות בין חיידק בודד לפטרייה בודדת. המסר הזה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האינטראקציות בין פתוגנים, כמו למשל אילו גורמים מעורבים בדיבור צולב ובניב בין-מיני. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שלנתונים המופקים ממודל in vivo זה יש רלוונטיות קלינית.
כדי להתקין את הפטרייה בתוך האף, יש לדלל תחילה פעמיים עשר עד ה-CFU השישי של C.albicans למיליליטר ב-PBS סטרילי. לאחר מכן, לאחר אישור אובדן רפלקס היישור בעכבר היפוטוני בוגר, שאפו לפחות 50 מיקרוליטר מהתרחיף הפטרייתי לפיפטה של 200 מיקרוליטר. כעת, תפסו את העכבר ביד אחת וסובבו את החיה כך שהיא תשכב על גבה כשבטנה פונה זקופה.
כאשר העכבר נמצא במקומו, השתמש באצבע המורה של היד המחזיקה את העכבר כדי לתמוך בראש, ובאגודל כדי לשמור על הלסת סגורה, והזז את קצה הפיפטה קרוב לאף של החיה. לאחר מכן, הוציא בזהירות טיפה של 50 מיקרוליטר פטרייה על הנחיריים, ואפשר לטיפה להישאף על ידי נשימה ספונטנית של העכבר. והניחו את העכבר לבד בכלוב עד להתאוששות מלאה.
ארבעה ימים לאחר התקנת C.albicans, יש לגלח את הבטן של החיה המורדמת, ולאחר מכן לעקר אתנול של העור החשוף. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לפתוח את העור מעצם החזה לאמצע הבטן. לאחר מכן, האריכו את החתך לאורך כלוב הצלעות משני צידי קו האמצע וקפלו לאחור את העור משני צידי בית החזה.
כאשר כלוב הצלעות גלוי, בצע חתך אנכי משני צידי החזה לכיוון עצם הבריח, והשתמש בעצם החזה כדי להטות את כל דופן החזה הקדמית כדי לדמיין את הלב והריאות. לאחר מכן, באמצעות מזרק טרום הפרין, נקב את הלב ליד העורק התוך חדרי, והוציא מינימום של 500 מיקרוליטר דם. הניחו את דגימת הדם על קרח.
לאחר מכן, בצע חתך בצוואר הרחם בקו האמצע כדי לחשוף את קנה הנשימה. נתח בזהירות את הפאשיה סביב קנה הנשימה, ואחריו הנחת תפר מתחת לקנה הנשימה. לאחר מכן, השתמש במחט גבאז' שונה בגודל 20 כדי לצנתר את קנה הנשימה, ולאבטח את הצינורית עם התפר שהוצב קודם לכן.
כדי לבצע שטיפת סימפונות, יש להוציא בעדינות 500 מיקרוליטר PBS קר כקרח לריאות. לאחר מכן, שאפו את נוזל השטיפה והעבירו את הנוזל לצינור צנטריפוגה של שני מיליליטר על קרח. לאחר איסוף שתי דגימות נוספות של 500 מיקרוליטר, הוציאו את הריאות מבית החזה, והניחו חתיכת ריאה לתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר לאחסון מיידי במינוס 80 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הנח חתיכה נוספת של רקמת ריאה לתוך צינור המוליזה שנשקל מראש המכיל PBS על קרח. לבסוף, בצע חתך בצד שמאל של הבטן. קצרו את הטחול לתוך צינור המוליזה שני המכיל מיליליטר אחד של PBS והניחו את הצינור על קרח.
מודל התמדה של ארבעה ימים מתקבל על ידי התקנה תוך-אפית של חמש פעמים עשר עד ה-CFU החמישי של C.albicans לכל עכבר. במהלך ארבעת הימים הללו, עכברים עולים במשקל, אך אינם מציגים פגיעה בריאות. עם זאת, ככל שה-CFU של החיסון עולה, כך גם הפגיעה בריאות.
כאשר הפגיעה המקסימלית בריאות נצפתה בין 24 ל-36 שעות לאחר ההדבקה. עומס החיידקים, לעומת זאת, מדגים ירידה של CFU אחד למיליליטר כל 24 שעות, עם עלייה מצטברת בהתפשטות החיידקים שנצפתה בכל יום. בשטיפת הסימפונות שנקצרה מעכברים נגועים, נויטרופילים מגויסים באופן נרחב, כאשר ספירת התאים הדיפרנציאלית מדגימה 90 אחוז נויטרופילים, 10 אחוז לימפוציטים מקרופאגים חודרים לאוכלוסיית תאי החיסון.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח שטיפת הסימפונות כדי לענות על שאלות נוספות לגבי אפיון התגובה הדלקתית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבנות קולוניזציה Pseudomonas. אל תשכח שעבודה עם קנדידה זוהרת עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי הזהירות, כגון לבישת ציוד מגן כדי למנוע זיהום טיפתי, בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
מחקר זה מבסס מודל מורין כדי לחקור את האינטראקציות בין Candida albicans ו-Pseudomonas aeruginosa בהקשר של דלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה. המודל מכוון להבהיר את תגובות החיסון המורכבות המעורבות באינטראקציות בין הפתוגנים.
Modeling host-mediated interactions between Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa in vivo addresses a critical gap in understanding polymicrobial dynamics relevant to airway infections. This approach enables mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses by capturing immune complexity and pathogen cross-talk not accessible in vitro. The model supports predictive confidence for translational research targeting ventilator-associated and chronic lung infections.
This in vivo model bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis testing of microbial and immune interactions in the airway. It provides a platform for lead identification and mechanistic de-risking in infection biology.