במבחנה הדגם של פיזיולוגי ופתולוגיים זרימת דם עם בקשה לחקירות של שיפוץ תא דם

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להתבונן בהשפעות של פתולוגיות זרימה פועמות שונות על תאי אנדותל. במבחנה. זה מושג על ידי טיפול כימי ראשון בשקופיות זכוכית וציפוי שלהן בחלבון כדי להבטיח חיבור תאים במהלך חשיפה לזרימה.

כשלב שני, נקבע מדד הפעימה של הזרימה, המאפשר השוואה של זרימה חוץ גופית לערכים המתוארים בספרות. לאחר מכן, שקופיות יושבות תאים מחוברות למערכת הזרימה על מנת למדוד את תגובת התא לפתולוגיות זרימה. התוצאות מראות שינויים במורפולוגיה ובביטוי החלבון על סמך פרופילי זרימה באמצעות מיקרוסקופיה אופטית וצביעה אימונו-פלואורסצנטית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני המשאבה הפריסטלטית או הפועמת הוא היכולת להתאים את פעימות הזרימה כדי לחקות תגובה חולה או בריאה. זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלות עורקים. כדי להתחיל, הנח שקופיות זכוכית חדשות בגודל 75 מילימטר על 50 מילימטר על מילימטר אחד לתוך צלחת זכוכית נקייה.

לאחר מכן הוסיפו מספיק תמיסת חומצה גופרתית של 20% כדי לטבול את שקופיות הזכוכית במלואן ולדגור אותן בתמיסת החומצה למשך הלילה למחרת. שטפו את המגלשות שלוש פעמים על ידי טבילתן במים טריים נטולי יונים למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר השטיפה, טבלו את השקופיות באצטון למשך 30 דקות, ולאחר מכן למשך הלילה בתמיסה של 6%three אמינו פרופיל טריקסי סלין באצטון.

לאחר מכן, שטפו את השקופיות שלוש פעמים באצטון טהור למשך חמש דקות והחליפו אצטון לאחר כל שטיפה. לאחר מכן שטפו את המגלשות שלוש פעמים במים נטולי יונים למשך חמש דקות, והחליפו את המים נטולי היונים לאחר כל שטיפה. לאחר מכן, טבלו את המגלשות ב-1.5% גלוטרלדהיד והשאירו אותן שקועות למשך 60 דקות.

לאחר הצלבה, שטפו את המגלשות פעמיים במים נטולי יונים, החליפו את המים נטולי היונים לאחר כל שטיפה, ולאחר מכן הניחו את המגלשות לתוך 70% אתנול למשך 30 דקות כדי לעקר אותן. הסר את האתנול ואפשר לכל שאריות שנותרו להתאדות מהשקופיות. לאחר הייבוש, החזר את המגלשות על ידי הנחתן לזמן קצר במים סטריליים נטולי יונים.

לאחר מכן, הסר את מחזיק השקופיות והנח אותו בצלחת פטרי בגודל 100 מילימטר על 100 מילימטר מרובע. במכסה המנוע הזרימה הלמינרית מצפים את השקופית הפונקציונלית במיליליטר אחד של תמיסת פיברונקטין של 25 מיקרוגרם למיליליטר, המכסה את השטח המשוער שייחשף לתא תרבית התאים. לאחר מכן מכסים את המנה ומדגרים את השקופיות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים לאחר הדגירה, שאפו את התמיסה הנותרת וזרעו 600,000 תאי אנדותל במיליליטר אחד של DMEM עם 10% FBS על הצד המצופה של השקופית.

מכסים את החדר ואז דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 120 דקות. לאחר מכן מכסים את התאים במדיום נוסף וממשיכים לדגור אותם עד שהם מתכנסים 70 עד 80%. חבר את מעגל הזרימה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה וכפי שמוצג כאן, ודא שתא השיכוך ומד הזרימה האולטראסוני מסודרים בכיוון הזרימה הנכון.

לאחר מכן, מלאו את הזרימה, המעגל והמאגר במים דה-יונים. ודא שצינור יציאת המאגר שקוע בנפח המאגר. לאחר מכן דמיין את צורת גל הזרימה באמצעות מד זרימה.

פתח את שסתום שחרור האוויר ב-דampתא כדי לשנות את יחס הנוזל לנפח האוויר. סגור את שסתום שחרור האוויר במרווחי מפלס נוזלים שונים וחשב את מדד הפעימות. כדי לחשב את האינדקס, הערך את צורת גל הזרימה מכיוון שהשיא מייצג את ה-VM max.

השוקת מייצגת את ה-v min וממוצע V הוא הממוצע של רשומת האות. ערכי אינדקס הפולסים במחברת. סמן את מפלס הנוזל ומדד הפעימה המתקבלים על תא השיכוך באמצעות עט דיו קבוע עם קצה לבד לשימוש עתידי.

קבע את רמות מדד הפעימה הרצויות מהספרות הפתולוגית המוזכרת בפרוטוקול הטקסט הנלווה תוך הכנת חימום תא הזרימה. DMEM תוסף עם 1% FBS באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. הוצא את אחת השקופיות המצופות בתא מהמדיה ברגע שהן מתכנסות ב-70 עד 80% והנח אטם על גבי הצד היושב בתא.

לאחר מכן, יישר את תעלת הוואקום של תא הזרימה עם החורים באטם. לאחר מכן חבר צינורות ואקום ליציאות הוואקום, וודא שלא תדלוף מדיה לשואב. הנח יריעת פוליקרבונט מתחת לשקופית הזכוכית והדק את מכלול תא הזרימה עם מהדק קפיץ אחד בכל אחד מהצדדים הקצרים ושני מהדקי קפיץ לאורך הצדדים הארוכים של תא הזרימה.

לאחר מכן, חבר את תא הזרימה, הכניסה והיציאה למעגל הזרימה. הנח את מערכת הזרימה באינקובטור המוגדר על 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני ומלא את המעגל במדיה החמה מראש על ידי מילוי המאגר במדיה ושאיבתו פנימה בפעימה נמוכה. שמרו על זרימה זו במשך ארבע שעות כדי להקדים את התאים.

לאחר מכן כוונן את נפח הנוזל בתא השיכוך לרמת מדד הפעימה והתרבות המסומנים מראש. התאים למשך הזמן הרצוי. תאי האנדותל המוצגים כאן תורבבו ללא זרימה, זרימה קבועה וזרימה פועמת.

ניתן לראות שינויים במורפולוגיה מהמורפולוגיה האופיינית של תאי האנדותל למורפולוגיה דמוית ציר יותר לאחר 24 שעות של חשיפה לזרימה פועמת גבוהה. בעוד שזרימה סטטית ויציבה מראים הבדל מועט או ללא הבדל במורפולוגיה. תאי שריר חלק מושפעים גם מתרבית משותפת עם תאי אנדותל החשופים לזרימה פועמת גבוהה כפי שמצוין כאן על ידי רמות שונות של שריר חלק אלפא אקטין ושרשרת כבדה של מיוזין.

לאורך תנאי הזרימה המשתנים, תאים שנחשפו לזרימה פועמת הראו את הכמויות הגדולות ביותר של שני החלבונים, מה שמעיד על היפרטרופיה והתכווצות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על כל האטמים ולהבטיח שרמות הנוזלים יישארו קבועות לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כגון תאי אנדותל, תרבית משותפת של תאי כלי דם על מנת לענות על שאלות נוספות כגון אינטראקציות בין תאים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להרכיב את מעגל הזרימה, לשלוט באינדקס ולחשוף תאי אנדותל לזרימה פועמת.