Name: Sacs Ex Vivo המעיים להעריך חדירות ריריות מודלים של מחלות במערכת העיכול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: למדו להכין שקי מעיים אקס ויו להערכת שלמות המחסום האפיתליאלי והשכבה הג'לית הרירית במודלים של מחלות מערכת העיכול. שיטה זו מאפשרת מחקר ממוקד של פיזיולוגיית המעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו מומנה על ידי מענק פרויקט הבריאות והמחקר הרפואי הלאומי APP1021582 ומענק של מכון המחקר הרפואי האנטר בחסות טריאתלון Sparke Helmore/NBN ועיזבונו של לסלי קנת מקפרלן המנוח.

כל עבודה חיה בפרוטוקול זה מבוצע תוך הקפדה אוניברסיטת ועדת האתיקה Animal ניוקאסל אישרה נהלים. 1. הכנת מכשירים, מדיה ותרבות ומנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם Media 199 (TC199) או בינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) תקשורת ל -37 מעלות צלזיוס. טרום oxygenate המדיום ידי מבעבע עם 95% O 2/5% CO 2. בדוק כי מדיום יש pH סופי של 7.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תפר ידי חיתוך שני סעיפים 5 סנטימטרים לכל צק. Loop התפרים לתוך קשר לא סגור. </li></ol> 2. Dissection הכנה של מערכת העיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משיכת מזון 12 שעות מוצקות לפני המתת החסד. אם תרצה, למקם חיות על תוספי ג&#39;ל מזינים במהלך הזמן הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על ידי יתר נתרן pentobarbitone ([200 מ&quot;ג / ק&quot;ג], זריקה intraperitoneal) ואחריו נקע בצוואר הרחם בהתאם פרוטו האתיקה של המוסד הרפואיcols ולרסס 70% אתנול על הבטן ובית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים, לעשות חתך אופקי באמצע הבטן ולחשוף את הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להפריד ואת להסיר את מערכת העיכול על ידי חיתוך במעי הדק העליון מהקיבה על סוגר השוער וחיתוך המעי גס על סף האנאלי. השתמש במלקחיים כדי להסיר לפדר בעדינות. מניחים את המעיים במדיום מראש חימם, מחומצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את קטע המעי תוערך עבור חדירות (איור 1) וחותכים את החלק הזה בחינם משאר המעי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לשמור על עקביות בין בעלי חיים, למדוד קטעי התריסריון ביחס מְעִי צָם אל הקיבה, ולמדוד קטעי המעי הגס ביחס מעי כדי cecum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת בחירת קטעי רקמה, לציין את נוכחותו של רקמות הלימפה הקשורים ריריות כגון טלאים של Peyer. אלה יכולים להיות מזוהה הנהון קטןules בצד serosal של לומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל, לשטוף את התוכן luminal בעדינות של קטע המעי לתוך צלחת פטרי עם PBS מחומם מראש (37 ° C). תוכן צואתי אלה עשויים להיות מושלכים או לאחסן ב -80 ° C לניתוח בעתיד לפי הצורך. </li></ol></li></ol> 3. הכנת המעיים Sacs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מזרק 1 מ&quot;ל עם נפח 300 μl של המתחם הבדיקה או מולקולה. עבור שלמות הרירית, פתרון 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של FITC-dextran M.Wt. 4,400 ניתן להשתמש. בדיקות החל 4,400-70,000 דה בגודל עשויות לשמש רגישות מוגברת. מאובטח להתאים קטטר וסקולרית חיה קטנה על המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד 5 סנטימטרים מהפתח של קטע המעי ולקשור במגזר סגור היטב עם לולאת תפר בנקודה זו. בעדינות להניח לולאת תפר טרום קשורה סביב פתיחת המעי וכנס קטטר הקהה. משוך את החבל סגור כדי לאבטח את קטע המעיולשחרר את נפח 300 μl מן המזרק לתוך המעי, כדי להבטיח שכל הפתרון מוזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להסיר את הקטטר ובמקביל משיכת החבל תפר לאבטח סגירת שק מעיים. חותכים את שק מעיים רפויים מהמעי ומקום לתוך צינור 50 מ&quot;ל חרוטי מלא 20 מ&quot;ל של מדיום מחומצן, שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. מדידה של חדירות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות חרוטי מקום המכיל את שקי מעיים באמבט מים חמים מוגדר 37 מעלות צלזיוס. ב 0, 30, 60, 90 ו -120 נקודות זמן דק, לקחת דגימת 100 μl מהצינור והעברת החרוטים לצלחת 96 באר, החלפת הנפח עם 100 μl של תקשורת טריה בכל מקרה לגופו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי המדגם הסופי נלקח, לחתוך צקים פתוחים בנקודת התפר לאורך אורכו של הקטע, חשיפת פני הרירית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את האורך והרוחב של כל קטע מעי. אם desiאדום, צמד להקפיא את הפלחים ולאחסן ב -80 ° C עבור חלבון או לאנליזה ביוכימית, או לחלופין, חנות בתמיסת ייצוב RNA עבור מבחנים מולקולריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות עקומת תקן של דילולי יומן עבור מולקולות מתויגות FITC בטווח שבין 1 ל 1 x 10 -6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מדוד ותקנים FITC על הקורא צלחת ניאון, עירור FITC / פליטה: 495 ננומטר / 519 ננומטר. </li></ol> 5. חישוב חדירות לכאורה עבור כל שק הפרט מעיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת יחידות זמן שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל נקודת זמן, לחשב את הריכוז מצטבר, Q Q t = (C * t V r) + (סכום ש t * V ים), איפה: T Q = ריכוז מצטבר בזמן t T C = ריכוז בזמן t V r = נפח בצד המקבל סכום t Q = סכום של כל t Q הקודם S = Vשנדגמו נפח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש Q לעומת הזמן (T) ו לחשב את השיפוע: δQ / δt </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבתי את החדירות לכאורה (אפליקצית P) P האפליקציה = (δQ / δt) / (א Co *), איפה: A = שטח של רקמה C 0 = ריכוז ראשוני </li></ol>

<ol><li>Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+Integrin-Mediated+Epithelial+Restitution+during+Mucosal+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation.</a> Frontiers in immunology. 4, 272(2013).</li>
<li>Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+in+innate+immunity+of+the+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine.</a> Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).</li>
<li>Robinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+protection+by+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition.</a> Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).</li>
<li>Feighery, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intestinal+permeability+in+rats+subjected+to+traumatic+frontal+lobe+percussion+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+trauma%22%5BJournal%5D)">Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury.</a> The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride-led+disruption+of+the+intestinal+mucous+layer+impedes+Salmonella+invasion%3A+evidence+for+an+%27enteric+tear%27+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+physiology+and+biochemistry+%3A+international+journal+of+experimental+cellular+physiology%2C+biochemistry%2C+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an 'enteric tear' mechanism.</a> Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+epithelial+innate+immunity+to+systemic+protection+afforded+by+prolyl+hydroxylase+inhibition+in+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+immunology%22%5BJournal%5D)">Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis.</a> Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).</li>
<li>Sourisseau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+PCNA+and+cyclin+D1+expression+and+epithelial+morphogenesis+by+the+ZO-1-regulated+transcription+factor+ZONAB%2FDbpA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA.</a> Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).</li>
<li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).</li>
<li>Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+everted+gut+sac+as+a+simple+and+accurate+technique+to+measure+paracellular+transport+across+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+drug+metabolism+and+pharmacokinetics%22%5BJournal%5D)">An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine.</a> European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).</li>
<li>Marks, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Delivery+of+Prolyl+Hydroxylase+Inhibitor%3A+AKB-4924+Promotes+Localized+Mucosal+Healing+in+a+Mouse+Model+of+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+bowel+diseases%22%5BJournal%5D)">Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis.</a> Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor-dependent+regulation+of+platelet-activating+factor+receptor+as+a+route+for+gram-positive+bacterial+translocation+across+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia.</a> Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).</li>
<li>Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CriticalSorb+promotes+permeation+of+flux+markers+across+isolated+rat+intestinal+mucosae+and+Caco-2+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers.</a> Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).</li>
<li>Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+of+PAMAM+dendrimers+across+isolated+rat+jejunal+mucosae+in+ussing+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers.</a> Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+intestinal+tissue+models+to+measure+mucoadhesion+of+poly+%28methacrylate%29+and+N-trimethylated+chitosan+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers.</a> Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).</li>
<li>Maher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intestinal+absorption+enhancement+and+local+mucosal+toxicity+of+two+promoters.+I.+Studies+in+isolated+rat+and+human+colonic+mucosae%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+pharmaceutical+sciences+%3A+official+journal+of+the+European+Federation+for+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae.</a> European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).</li>
<li>Balda, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissociation+of+paracellular+permeability+and+transepithelial+electrical+resistance+and+disruption+of+the+apical-basolateral+intramembrane+diffusion+barrier+by+expression+of+a+mutant+tight+junction+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein.</a> The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).</li>
<li>Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+lipophilic+drug+molecules+in+a+new+mucus-secreting+cell+culture+model+based+on+HT29-MTX+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells.</a> Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).</li>
<li>Stefka, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+protect+against+food+allergen+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria protect against food allergen sensitization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+fluid+transport+regulates+bacterial-epithelial+interactions+and+significantly+shifts+the+murine+colonic+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+microbes%22%5BJournal%5D)">Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome.</a> Gut microbes. 3, 250-260 (2012).</li>
<li>Barrett, K. E., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+secretion+by+the+intestinal+epithelium%3A+molecular+basis+and+regulatory+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects.</a> Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).</li>
<li>Soni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat%2C+ovine+and+bovine+Peyer%27s+patches+mounted+in+horizontal+diffusion+chambers+display+sampling+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Rat, ovine and bovine Peyer's patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).</li>
<li>Justino, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+role+of+Lactobacillus+acidophilus+on+inflammation+and+gastric+dysmotility+in+intestinal+mucositis+induced+by+5-fluorouracil+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+chemotherapy+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).</li>
<li>Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+zinc+supplementation+and+methotrexate-induced+small+intestinal+mucositis+in+metallothionein-knockout+and+wild-type+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+biology+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice.</a> Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).</li>
<li>Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lubiprostone+decreases+mouse+colonic+inner+mucus+layer+thickness+and+alters+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+diseases+and+sciences%22%5BJournal%5D)">Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota.</a> Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הנה, יש לנו מפורטי הבידוד והכנה צקי מעיים להעריך תפקוד מחסום רירי vivo לשעבר. הכנות צק מעיים כבר נוצלו בעיקר במחקר של תרופות, בחינת ספיגת תרופות מועמד מעבר במעי. עם זאת, assay זה מתאים היטב באותה מידה לחקר מחלת מעיים. חדירות מעי עשוי להשתנות במידה רבה בהתאם לאזור והערכת אתר הספציפי של חדירות מאפשרות הבנה טובה יותר של החשיבות האזורית של שלמות רירית במחל עיכול. Assay הוא חזק בתנאים הפיסיולוגיים הנכונים, רקמות מבודדות נשארים קיימא עבור מורטם עד 6 שעות שלאחר. בעקבות המתת חסד,...

המכשול אפיתל במעי של מערכת העיכול הוא שטח הפנים הרירית מוערך ב -400 מ &#39;2 ב המבוגר אדם. כתוצאה מכך, היא חשופה כל הזמן לאתגר מחיידקים, תרופות בליעה, חומרים מזינים רעלנים חיידקיים. המארח אסור להבדיל רק בין חיידקי commensal נסבלים פתוגנים פוטנציאליים, אבל חייב למנוע מינים אלה והמולקולות המופרשות שלהם לחצות את מחסום האפיתל, ואילו באותו הזמן המאפשר ספיגת מזון בגוף. לכן, את התפקיד של האפיתל במעי הוא לפעול כמחסום סלקטיבי לתכנים luminal 1. זו המושגת, בין יתר, על ידי מערכת ביטחון אפיתל מולד בבית הרירי, אשר פועלת באמצעות מערכת ביולוגית תגובה המורכבת מנגנוני מכונן מושרים 2. אובדן תפקוד המחסום אפיתל היא פתולוגית אופיינית של מספר מחלות מערכת העיכול. בשנת vivoבחינת תפקוד המחסום אפיתל ניתן להעריך באמצעות gavage הפה של מולקולה נותב וניתוח בסרום לאחר 3. עם זאת, הטכניקה הזו מציעה שום אינדיקציה לגבי האתר של תפקוד מחסום. במבחנה לשעבר vivo הערכת התנגדות transepithelial באמצעות מערכות Transwell 3 ו Ussing תאי 4,5 בהתאמה, מועסקים בכינויו סמנים פונדקאיים של תפקוד מחסום אפיתל, אך חסרים את פיזיולוגית המחלה התורמת של מודלים של בעלי חיים 6. בפרוטוקול זה אנו מתארים מודל הכנת vivo לשעבר רקמות המאפשר הערכה ישירה ונקודות של שלמות מעיים אשר עשוי לשמש כדי להעריך תפקוד מחסום רירי בכמה רמות. חשוב לציין, טכניקה זו ניתן להחיל במודלים של בעלי חיים של מחלה, או עלולה להיות מניפולציות פרמקולוגית לאפשר בחקירה מעמיקה של תפקוד מחסום רירי.

<table><tbody><tr><td>דקנטל&nbsp; תפר משי שאינו נספג</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S 116</td><td></td></tr><tr><td>Media 199 (TC199)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11043-023</td><td>אין פנול אדום מכיוון שהדבר מפריע לפלואורסצנטיות</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Life Technologies</td><td>21063-045</td><td>אין פנול אדום מכיוון שהדבר מפריע לפלואורסצנטיות</td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>שימוש ב-10 מ"מ במדיה</td></tr><tr><td>קתר כלי דם של בעלי חיים קטנים: Physiocath</td><td>Data Sciences International</td><td>277-1-002</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 4,400 מגה-וואט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>FD-4</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 20,000 מגה-וואט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>FD-20</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 70,000 מגה-וואט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>FD-70</td><td></td></tr></tbody></table>

sacs ex vivo המעיים להעריך חדירות ריריות מודלים של מחלות במערכת העיכול

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

המכשול אפיתל היא ההגנה מולדת הראשונה של מערכת העיכול באופן סלקטיבי מסדיר תחבורה מן לומן אל תאי הרקמה הבסיסית, הגבלת התחבורה של מולקולות קטנות יותר ברחבי האפיתל וכמעט לחלוטין האוסר תחבורה macromolecular אפיתל. סלקטיביות זו נקבעת ע&quot;י שכבת ג&#39;ל הרירי, אשר מגביל את התחבורה של מולקולות lipophilic ושניהם הקולטנים הפסגה ומכלולי חלבון junctional ההדוקים של האפיתל. במודלי תרבית תאים במבחנה של האפיתל הם נוחים, אבל כמודל, הם חסרים את המורכבות של האינטראקציות בין החיידקים, ג&#39;ל רירי, האפיתל ואת המערכת החיסונית. מצד שני, in vivo הערכה של קליטה או חדירות מעי עשויה להתבצע, אבל אלה מבחנים למדוד כוללת קליטת עיכול, ללא ציון סגולי אתר. Ex vivo מבחני חדירות באמצעות &quot;צקי מעיים&quot;; הם שיטה מהירה ורגישה למדידת טוהר מידות מעיים הכלל או תחבורה השוואתית של מולקולה מסוימת, עם יתרון נוסף של סגוליות אתר מעיים. כאן אנו מתארים את הכנת שקי מעיים ללימודי חדירות והחישוב של חדירות לכאורה (אפליקציה P) של מולקולה על פני מחסום המעי. טכניקה זו ניתן להשתמש כשיטה ספיגת תרופות בהערכת, או לבחון תפקוד מחסום האזורי אפיתל במודלים של בעלי חיים של מחלות במערכת העיכול.

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבחון שינויים אזוריים בתפקוד מחסום המעי במודלים של בעלי חיים של מחלות במערכת העיכול. באמצעות מדידת השטף של חללית paracellular פני הרירית לעבר שטחים שונים של מערכת עיכול 7, את היושרה של צומת ההדוקים אפיתל ניתן להעריך. בנוסף, על ידי שינוי האופי של חללית paracellular על פי גודלן (איור 2) או הידרופוביות (איור 3), מידת הפרעות אפיתל, או על שלמות שכבת ג&#39;ל הרירית, ניתן למדוד גם. העס...

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בתכשירי רקמת מעיים שנכרתו או "שקי מעיים" כמודל ex vivo של תפקוד מחסום המעי. מודל זה עשוי לשמש להערכת שלמות מחסום האפיתל ושכבת הג'ל הרירית באתרי מעיים ספציפיים במודלים של מחלות עיכול בבעלי חיים.

Sacs Ex Vivo המעיים להעריך חדירות ריריות מודלים של מחלות במערכת העיכול

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך את השלמות המקומית של המעי במודלים של בעלי חיים למחלות של מערכת העיכול. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח לגבי מחלות של מערכת העיכול, כגון האם חלה פגיעה בשלמות הרירית או האם קיימת עלייה בספיגה של מולקולה ספציפית או חיידקים במהלך המחלה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה להערכת אזורים ספציפיים בתוך צינור מערכת העיכול. להכנת צינור מערכת העיכול, התחילו בהרסס של הבטן והבית של העכבר ב-70% ethanol והשתמשו במספריים כדי לבצע חתך אופקי במרכז הבטן, כדי לחשוף את הפריטונאום. לאחר מכן, חתכו את המעי הדק העליון מהקיבה בפיספוס הפילורי (pyloric sphincter) ואת המעי הגס בקו התפר האנאלי (anal verge). לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להסיר בעדינות את הקרום הסרטני (mesentery) והניחו את צינור המעי בתוך מדיום מחומם מראש ומחומצן. זהו את האזור שיש להעריך מבחינת חדירות, תוך מדידת מקטעי התריסריון והמעי הצם (jejunum) ביחס לקיבה, או מקטעי המעי הגס והמעי העקום (ilium) ביחס למעי העיוור (cecum), כדי לשמור על עקביות בין בעלי החיים בניסוי. שימו לב לנוכחות של רקמות לימפואידיות המשויכות לרירית, כגון לוחות פייר (Peyer's patches), שניתן לזהות כקשריים קטנים בצד הסרוסלי של הלומן. לאחר מכן, חתכו את המקטע שנבחר והשתמשו במזרק של 1 ml כדי לשטוף בעדינות את תכולת הלומן של

ex-vivo-intestinal-sacs-to-assess-mucosal-permeability-models

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

טיפולים עכשוויים של מחלות מעי דלקתיות (IBD) מכוונים להקל תסמיני מחלה אך הוא עשוי לגרום לתופעות לוואי חמורות. לכן, אסטרטגיות חלופיות נחקרות במודלי קוליטיס חיה. הנה, נסביר כיצד את ההשפעות המיטיבות של תוספי תזונה על סימנים קליניים IBD מנותחים כגון מודל קוליטיס.

ניתוח מועיל אפקטים של תוספי תזונה על פונקציות מעיים אפיתל מכשול במהלך ניסיוני קוליטיס

שתי שיטות מוצגים כאן כדי לקבוע פונקציה מכשול המעי. מטר אפיתל (וולט/אוהם) משמש עבור מדידות של ההתנגדות החשמלית transepithelial של epithelia בתרבית ישירות בבארות תרביות רקמה. בעכברים, שיטת gavage FITC-לתוספי משמשת כדי לקבוע את חדירות המעי ויוו.

במבחנה , גישות In Vivo כדי לקבוע חדירות תאים אפיתל המעי

הגישה של חומרים מזינים, microbiota מטבוליטים ותרופות אל מחזור הדם נשלטת על ידי למכשול בטן-דם (GBB). אנו מתארים שיטה ישירה למדידת ה GBB חדירות ויוו, אשר, בניגוד נפוץ שיטות עקיפות, כמעט אינה מושפעת פונקציות כבד וכליות.

שיטת In Vivo להערכת את מחסום הדם-הבטן ואת חילוף החומרים בכבד של מוצרים Microbiota

כאן אנו מתארים טכניקה כדי לכמת את שלמות המכשול של אורגנואידים מעיים קטנים. העובדה כי השיטה מבוססת על אורגנואידים חיים מאפשר חקירה רציפה של שלמות מכשול שונים חומרים מודולים או שילובים אותם באופן שנפתר בזמן.

חקירת פירוק מחסום המעיים באורגנואידים חיים

תוך ניצול של מיקרוסקופ תוך-ויטאל, השיטה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה בזמן אמת של שפיכת תאי אפיתל במעיים בבעלי חיים חיים. לכן, רירית מעיים מוכתמת topically (acriflavine ו rhodamineB-dextran) של עכברים מרדימים הוא תמונה עד רזולוציה של תא יחיד באמצעות מיקרוסקופית confocal.

גישה תוך-ויטאלית המבוססת על מיקרוסקופיה להערכת חמלה במעיים וביצועי שפיכת תאים אפיתל

תפקוד מחסום אפיתל מעיים Dysregulated ותגובות חיסוניות הם סימני היכר של מחלות מעי דלקתיות שנותרו נחקרות בצורה גרועה בשל מחסור במודלים פיזיולוגיים. כאן, אנו מתארים מודל לולאת מעיים של עכברים המעסיק מקטע מעיים בעל כלי דם וחיצוניים כדי לחקור חלחיליות רירית וגיוס לויקוציטים ב- vivo.

הערכה תפקודית של חלחיליות מעיים ונדידה טרנס-אפיתלית נויטרופילית בעכברים באמצעות מודל לולאת מעיים מתוקננת

הפרוטוקול הנוכחי מתווה שיטה המשתמשת בצהוב לוציפר במודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט כדי לקבוע חדירות מעיים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע חדירות paracellular ב enteroids כי מודל מחלות מעי דלקתיות כגון דלקת אנטרוקוליטיס נמקית.

קביעת חדירות מעיים באמצעות לוציפר צהוב במודל אנטרואיד אפיקל-אאוט

כאן אנו מתארים בניית מערכת מודל בסיסית תלת ממדית (3D) של קו תאי מעי ופרוטוקול הטמעת פרפין להערכה מיקרוסקופית קלה של מקבילות מעיים קבועות. צביעה של חלבונים נבחרים מאפשרת ניתוח של פרמטרים חזותיים מרובים מניסוי יחיד לשימוש פוטנציאלי במחקרי סינון תרופות פרה-קליניים.

מערכת מודל מעי תלת-ממדית בסיסית (3D) עם מרכיב חיסוני

פרוטוקול זה מתאר פלטפורמת סקר המשתמשת ברירית רקמת אפיתל בוקאלית חזיר מבודדת טרייה להערכת חדירות פפטידים. השיטה משלבת חדירה של GLP-1RA בנוכחות משפר חדירות מתמיסות, תאי Hilltop וסרטים בתאי הדיפוזיה של פרנץ, והכנסות מודפסות בתלת-ממד, בליווי הערכה רירית היסטולוגית.

מודל אורומוקוסלי תקן של חזיר ex vivo להערכת זרמי פפטידים

<em&gt; In vivo</em&gt; Assay לבדיקת חדירות כלי דם

למדו להכין שקי מעיים אקס ויו להערכת שלמות המחסום האפיתליאלי והשכבה הג'לית הרירית במודלים של מחלות מערכת העיכול. שיטה זו מאפשרת מחקר ממוקד של פיזיולוגיית המעי.

Sacs Ex Vivo המעיים להעריך חדירות ריריות מודלים של מחלות במערכת העיכול

גלה סרטונים נוספים