מהיר וכמוני Fluorimetric שיטה להקרנת סמים מיקוד-חלבון מולקולה קטנה

המטרה הכוללת של שיטת סינון תרופות פלואורומטרית חדשה זו היא לקבוע את זיקת הקישור של מולקולות תרופות קטנות לחלבון מטרה על ידי יצירת אשכולות ננו זהב פלואורסצנטיים בתוך תבנית החלבון העמוסה בתרופות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תגליות תרופות המכוונות לחלבונים, כגון כיצד חוזק הווידינג של מולקולות תרופות יכול להשפיע על יציבות החלבונים מהתפתחות, מה שמוביל להיווצרות של ננו זהב פלואורסצנטי בעוצמות שונות. היתרון העיקרי של טניקס זה הוא שאנו יכולים להפוך מטרה חלבונית לחיישן ביולוגי פלואורסצנטי כדי לאפשר סינון מהיר של תרופות מולקולריות קטנות ללא צורך במכשירים מתוחכמים ושלבי תיוג מייגעים.

לשילוב של הידע שלי כמו גם מחבר שותף, היא גילתה שהעמיס את החלבון, יש אפקט ייצוב מובהק על פלזמונית. ננו-חלקיקים נתנו השראה לרעיון לשיטה זו. התחל הליך זה בהכנת הריאגנטים הכימיים לסינון תרופות כמפורט בפרוטוקול הטקסט להכנת אלבומין הסרום האנושי או אשכולות ננו זהב בתבנית HSA, הניחו שני בקבוקוני זכוכית שכל אחד מהם מכיל מוט ערבוב מיקרו מגנטי על שני ערבובים מגנטיים נפרדים הניתנים לבקרת טמפרטורה.

הגדר את הטמפרטורה של ערבוב מגנטי אחד ל 60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת אלבומין בסרום אנושי, 200 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד ו-200 מיקרוליטר תמיסת זהב כלוריד לכל בקבוקון תוך ערבוב מתמיד כדי לאפשר עטיפה של יוני זהב בתוך תבנית החלבון, שתי דקות לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת נתרן הידרוקסיד לכל בקבוקון כדי להפעיל את יכולת ההפחתה של אלבומין בסרום אנושי המודיע על אשכולות ננו זהב. התחל לתעד את זמן התגובה באפס דקות כל 20 דקות.

שואבים 50 מיקרוליטר מכל דגימה ומעבירים לצלחת שחורה של 384 באר. מדוד את ספקטרום הפליטה באמצעות קורא מיקרו-פלטות. הפסק את הערבוב המגנטי לאחר 100 דקות.

מצננים את בקבוקוני הזכוכית מתחת למים זורמים בכיור. שרטט את ספקטרום פליטת הצילום בכל עת עבור כל דגימה כדי לרכוש את קינטיקה של היווצרות צבירי ננו זהב בתנאי טמפרטורה שונים. להכנת אלבומין בסרום בקר או אשכולות ננו זהב בתבנית BSA, הנח בקבוקון זכוכית המכיל מוט ערבוב מיקרו מגנטי על גבי ערבוב מגנטי.

השאירו את הטמפרטורה כטמפרטורת החדר. מערבבים 200 מיקרוליטר תמיסת BSA, 200 מיקרוליטר אוריאה ו-200 מיקרוליטר תמיסת זהב כלוריד בבקבוקון הזכוכית תוך ערבוב מתמיד. שתי דקות לאחר מכן ב -20 מיקרוליטר של תמיסת נתרן הידרוקסיד.

להפעיל את יכולת ההפחתה של BSA ליצירת אשכולות ננו זהב ולהתחיל לרשום את זמן התגובה כאפס דקות. מדוד את ספקטרום פליטת הצילום של תערובת התגובה מדי שעה. הנח חמישה בקבוקוני זכוכית שכל אחד מהם מכיל מוט ערבוב מגנטי ומסומן מראש בתרופה או HSA טהור על גבי ערבוב מגנטי רב-נקודתי הניתן לבקרת טמפרטורה.

הוסף 200 מיקרוליטר HSA לכל בקבוקון. לאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד מכל תמיסת תרופה שהוכנה בעבר לארבעת הקבצים המתאימים. כמו כן, הוסף מיקרוליטר אחד של DMSO למתג הבקרה במערבל.

הגדר את מהירות הסחיטה ל-360 סל"ד ודגר למשך שעה אחת כדי לאפשר לתרופה להיקשר ל-HSA שעה לאחר מכן ב-200 מיקרוליטר מים מילי-Q ו-200 מיקרוליטר תמיסת זהב כלוריד לכל בקבוקון תוך ערבוב מתמיד. הגדר את הטמפרטורה ל 60 מעלות צלזיוס תוך ערבוב מתמיד למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות ב-20 מיקרוליטר של 1.5 נתרן הידרוקסיד מולארי לכל קובץ ולהתחיל לרשום את זמן התגובה באפס דקות.

פתרונות תגובה משותפים למדידה צריכים לעקוב אחר אותו רצף של הוספת תרופות ויש לתרגל אותם במהירות האפשרית כדי למזער את אפקט פיגור הזמן לשאוב במהירות 50 מיקרוליטר של תמיסה מכל בקבוקון. מעבירים לצלחת שחורה של 384 באר ומודדים את ספקטרום הפליטה. רשום את ספקטרום הפליטה של כל דגימה כל 10 דקות, ואסוף לפחות ארבעה ספקטרומים בארבעה זמנים שונים.

חזור על שלבים אלה מספר פעמים כדי להשיג תוצאות עם מגמה עקבית. שרטט את ספקטרום פליטת התמונות שנפתר בזמן עבור כל דגימה. זהה את עוצמת השיא של כל הדגימות ותווה כנגד הזמן כדי להשוות את קינטיקה של היווצרות אשכולות ננו זהב בתבניות חלבון שונות טעונות תרופות כדי למדוד את קבוע הקישור בין כל תרופה ל-HSA.

החלף את תמיסות התרופה בתמיסות איבופרופן בארבעה ריכוזים שונים. 10 דקות לאחר מכן, יש לקרר את בקבוקוני הזכוכית מתחת למים זורמים בכיור. שאב 50 מיקרוליטר מהתמיסות הנ"ל מכל בקבוקון לצלחת שחורה של 384 באר ומדוד את ספקטרום הפליטה.

חזור על שלבים אלה פעמיים נוספות כדי לקבל שתי קבוצות נוספות של תוצאות בריכוזי תרופות שונים לפני הפסקת הערבוב המגנטי. לאחר מכן שרטט את ספקטרום פליטת הצילום ונתח את התוצאות עבור הגלם המתקבל בכל אצווה בודדת. שרטט את ספקטרום פליטת הצילום של כל דגימה בתוכנה כגון Origin Pro וקבע את עוצמת השיא.

חשב ושרטט את עוצמת הקרינה היחסית מול ריכוז התרופה. לאחר מכן חשב את קבוע הכריכה על ידי התאמת הנתונים למודל כריכת אתר יחיד. שימוש במשוואת הצמנטין של מיקרופונים כדי לעשות זאת בתוכנה כמו Origin Pro.

בחר את ניתוח התפריט המתאים להתאמת עקומה לא ליניארית, ולאחר מכן בחר פונקציית ברד מהקטגוריה סיגמואידית צמיחה בדף בחירת פונקציית ההגדרות. לחץ על התאם כדי להציג. התוצאות המותאמות המוצגות כאן הן תוצאות מייצגות של ספקטרום פליטת הפוטו שנפתר בזמן של צבירי ננו זהב המיוצרים בתנאי דנטורציה שונים של חלבונים.

ניתן לראות אותו בצבירי ננו זהב נוצרים מהר יותר בטמפרטורה גבוהה יותר. מצב דנטורציה של אוריאה יכול גם להקל על סינתזה ישירה של אשכולות ננו זהב באמצעות חלבון BSA כתבנית. תוצאות אופייניות של סינון תרופות פלואורומטרי מהיר המבוסס על עוצמת הקרינה של אשכולות ננו זהב באמצעות HSA טעון תרופות כתבנית מוצגות כאן.

ככל שעוצמת הפלואורסצנט גבוהה יותר, כך חוזק הקישור של מולקולת תרופה ל-HSA חלש יותר. ספקטרום זה מראה את ההשפעה של ריכוז העמסת תרופות על קצב היווצרותם של ננו זהב פלואורסצנטי בתוך HSA טעון איבופרופן. ככל שריכוז התרופה גבוה יותר, כך האות הפלואורסצנטי של צבירי ננו הזהב המתקבלים המוצגים כאן נמוך יותר הוא תוצאה מייצגת של קביעת קבוע קשירת תרופות חלבון.

זה מחושב על ידי התאמת עוצמת הקרינה היחסית של אשכולות ננו זהב המסונתזים בתבנית HSA טעונה מראש בתרופת איבופרופן בריכוזים שונים באמצעות משוואת צמנטין לטיפול נמרץ לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך 30 דקות לבדיקת תרופות מרובות במקביל אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, כעת אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד לסנתז רסן, לעבור לאשכול ננו בחלבון טעון תרופות, ולקבוע את זיקת הקישור של תרופות לחלבון מטרה כפי שניתן לזהות על ידי האות הפלואורסצנטי הנפלט מצבירי ננו הזהב המתקבלים.