מהיר וכמוני Fluorimetric שיטה להקרנת סמים מיקוד-חלבון מולקולה קטנה

המטרה הכוללת של שיטה חדשה זו לסריקת תרופות פלואורומטרית היא לקבוע את זיקת הקישור של מולקולות תרופה קטנות לחלבון מטרה, וזאת על ידי יצירת ננו-צברים של זהב פלואורסצנטיים בתוך תבנית החלבון הטעונה בתרופה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום גילוי תרופות המכוונות לחלבונים, כגון כיצד עוצמת הקישור של מולקולות תרופה יכולה להשפיע על יציבות חלבונים מפני פריסה (unfolding), מה שמוביל ליצירת ננו-צברים של זהב פלואורסצנטיים בעצמות שונות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להפוך חלבון מטרה לביוסנסור פלואורסצנטי, המאפשר סריקה מהירה של תרופות מולקולריות קטנות ללא צורך במכשור מתוחכם ובשלבי סימון מתישים.

השילוב של הידע שלי ושל השותפה לכתיבה, שהגילה כי טעינת החלבון בעלת השפעה מייצבת מובחנת על ננו-חלקיקים פלסמוניים, היוהו את ההשראה לרעיון לשיטה זו. התחילו את הפרוצדורה בהכנת הרכיבים הכימיים לסריקת תרופות כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט; כדי להכין ננו-צבירי זהב המבוססים על תבנית של albumin סרום אנושי או HSA, הניחו שני מבחנות זכוכית, שכל אחת מהן מכילה מקל ערבוב מגנטי מיקרוסקופי, על שני ערבבים מגנטיים נפרדים בעלי בקרת טמפרטורה.

הגדירו את הטמפרטורה של בוחש מגנטי אחד ל-60 °C. לאחר מכן, הוסיפו לכל מבחנה 200 µL של תמיסת human serum albumin, 200 µL של מים מזוקקים (ultrapure water) ו-200 µL של תמיסת gold chloride, תוך כדי ערבוב רציף, כדי לאפשר את הכליאה של יוני הזהב בתוך תבנית החלבון. לאחר שתיים דקות, הוסיפו לכל מבחנה 20 µL של תמיסת sodium hydroxide כדי להפעיל את יכולת ההחזר של ה-human serum albumin ליצירת מקבצי ננו של זהב (gold nano clusters). התחילו לתעד את זמן התגובה החל מדקה אפס ובכל 20 דקות.

שאבו 50 µL מכל דגימה והעבירו לפלטה שחורה בעלת 384 בארות. מדדו את ספקטרום הפליטה באמצעות קורא מיקרופלטה. הפסיקו את הערבוב המגנטי לאחר 100 דקות.

קררו את מבחנות הזכוכית תחת זרם מים בכיור. רשמו את ספקטרומי פליטת הפוטונים באופן רציף עבור כל דגימה כדי לקבוע את קינטיקת ההיווצרות של ננו-צבירי זהב בתנאי טמפרטורה שונים. להכנת ננו-צבירי זהב המבוססים על תבנית של bovine serum albumin או BSA, הניחו מבחנת זכוכית המכילה מקל בחישה מגנטי מיקרוסקופי על גבי בוחש מגנטי.

השאר את הטמפרטורה בטמפרטורת החדר. ערבב 200 µL של תמיסת BSA, 200 µL של urea ו-200 µL של תמיסת gold chloride בתוך מבחנת זכוכית תחת ערבוב קבוע. לאחר שתיים דקות, הוסף 20 µL של תמיסת sodium hydroxide.

כדי להפעיל את יכולת החיזור של BSA ליצירת אשכולות ננו-זהב, יש להתחיל את מדידת זמן התגובה מאפס דקות. יש למדוד את ספקטרום פליטת הפוטונים של תערובת התגובה מדי שעה. הניחו חמישה מבחנות זכוכית, בכל אחת מהן מוט ערבוב מגנטי וסימון מראש של תרופה או HSA טהור, על מכשיר ערבוב מגנטי רב-נקודתי בעל בקרת טמפרטורה.

הוסף 200 microliters של HSA לכל מבחנה. לאחר מכן, הוסף microliter אחד מכל תמיסת תרופה שהוכנה קודם לכן לארבעת הקבצים המתאימים. כמו כן, הוסף microliter אחד של DMSO לבקרת המתג במערכת הערבוב.

הגדירו את מהירות הסבב ל-360 RPM והדגירו למשך שעה אחת כדי לאפשר את קישור התרופה ל-HSA; שעה לאחר מכן, הוסיפו 200 microliters של milli Q water ו-200 microliters של תמיסת gold chloride לכל מבחנה תחת ערבוב רציף. הגדירו את הטמפרטורה ל-60 degrees Celsius תחת ערבוב רציף למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, הוסיפו 20 microliters של sodium hydroxide בריכוז 1.5 molar לכל מבחנה והתחילו לתעד את זמן התגובה החל מדקה אפס.

מטריצות של תמיסות תגובה משותפות למדידה צריכות לעקוב אחר אותו רצף הוספה של תרופות, ויש לבצען במהירות מרבית כדי למזער את השפעת השיהוי בזמן. שאבו במהירות 50 µL של תמיסה מכל מבחנה. העבירו לפלטה שחורה בעלת 384 בארות ומדדו את ספקטרום הפליטה. רשמו את ספקטרום הפליטה של כל דגימה בכל 10 דקות, תוך איסוף של לפחות ארבעה ספקטרומים בארבעה זמנים שונים.

חזור על שלבים אלו מספר פעמים כדי לקבל תוצאות בעלות מגמה עקבית. שרטט את ספקטרום פליטת הפוטונים הרזולוציוני בזמן עבור כל דגימה. זהה את עוצמת השיא של כל הדגימות ושרטט אותה כנגד הזמן כדי להשוות את קינטיקת ההיווצרות של ננו-צבירי זהב בתבניות חלבוניות טעונות תרופות שונות, לצורך מדידת קבוע הקשירה בין כל תרופה ל-HSA.

החליפו את תמיסות התרופות בתמיסות איבופרופן בארבעה ריכוזים שונים. לאחר 10 דקות, קררו את מבחנות הזכוכית תחת מים זורמים בכיור. העבירו 50 µL מהתמיסות הנ"ל מכל מבחנה לפלטה שחורה בעלת 384 בארות ומדדו את ספקטרום הפליטה.

חזור על שלבים אלה פעמיים נוספות כדי לקבל שני סטים נוספים של תוצאות בריכוזי תרופה שונים לפני הפסקת ערבוב המגנטית. לאחר מכן, שרטט את ספקטרומי פליטת הפוטונים ונחח את התוצאות עבור הנתונים הגולמיים שהתקבלו בכל סבב בודד. שרטט את ספקטרומי פליטת הפוטונים של כל דגימה בתוכנה כגון Origin Pro וקבע את עוצמת השיא.

חשבו ושרטטו את עוצמת הפלואורסצנציה היחסית לעומת ריכוז התרופה. לאחר מכן, חשבו את קבוע הקישור על ידי התאמת הנתונים למודל קישור לאתר יחיד. השתמשו במשוואת Mics cementin כדי לבצע זאת בתוכנה כגון Origin Pro.

בחר בתפריט ניתוח בהתאמת עקום לא לינארית (non-linear curve fit), ולאחר מכן בחר בפונקציית hill מקטגוריית growth sigmoidal בדף בחירת פונקציית ההגדרות. לחץ על fit כדי להציג. תוצאות ההתאמה המוצגות כאן הן תוצאות מייצגות של ספקטרומי פליטה פוטונית ברזולוציית זמן של ננו-צברי זהב שהופקו בתנאי דנטורציה שונים של חלבונים.

ניתן להבחין כי מקבצי ננו של זהב נוצרים מהר יותר בטמפרטורה גבוהה יותר. תנאי דנטורציה של Urea יכולים גם להקל על הסינתזה הישירה של מקבצי ננו של זהב תוך שימוש בחלבון BSA כתבנית. תוצאות טיפוסיות של סריקת תרופות פלואורומטרית מהירה, המבוססת על עוצמת הפלואורסצנציה של מקבצי ננו של זהב תוך שימוש ב-HSA טעון בתרופה כתבנית, מוצגות כאן.

ככל שעוצמת הפלואורסצנציה גבוהה יותר, כך חלשה יותר עוצמת הקישור של מולקולת התרופה ל-HSA. ספקטרומים אלו מראים את השפעת ריכוז טעינת התרופה על קצב ההיווצרות של ננו-צבירי זהב פלואורסצנטיים בתוך HSA הטעון באיבופרופן. ככל שריכוז התרופה גבוה יותר, כך נמוך יותר אות הפלואורסצנציה של ננו-צבירי הזהב שנוצרו; התוצאות המוצגות כאן הן תוצאה מייצגת של קביעת קבוע הקישור של תרופה לחלבון.

החישוב מתבצע על ידי התאמה של עוצמת הפלואורסצנציה היחסית של ננו-צבירי זהב שסונתזו בתבנית HSA שהועמסה מראש בתרופת ibuprofen בריכוזים שונים, תוך שימוש במשוואת cementin של MICUs. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 30 דקות לסריקה מקבילה של תרופות מרובות, במידה והיא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן הסינתזה של ננו-צבירי זהב בחלבון טעון בתרופה, וכיצד לקבוע את זיקת הקישור של תרופות לחלבון מטרה כפי שניתן לזהות באמצעות אות הפלואורסצנציה הנפלט מננו-צבירי הזהב שהתקבלו.