Name: שימוש Ex Vivo תרבויות הזקופה טיפה של איברים העובר שלמים לחקר תהליכים התפתחותיים בעכבר organogenesis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: חקור תהליכי אורגנוגנזה בעכברים באמצעות שיטת תרבית טיפה אקס ויו. טכניקה זו מאפשרת בחינת השפעת מעכבי מולקולות קטנות על התפתחות איברים עובריים תוך שימוש בכמויות קטנות של ריאגנטים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים נתמכו על ידי: מענק מחקר KIDS ללא סרטן, פרס מלגת המתחילים של מצעד הדימס בזיל או'קונור (#5-FY14-32), פרס מענק נאמן של המרכז הרפואי לילדים בסינסינטי (CCHMC); פרס חדשנות במחקר ומימון פיילוט של CCHMC; וקרנות פיתוח של CCHMC. המחברים גם מודים למעבדת קאפל על האופטימיזציה הראשונית של טכניקה זו.

<ol><li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> J. Vis. Exp. (85), e50803(2014).</li>
<li>Maatouk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+beta-catenin+in+XY+gonads+causes+male-to-female+sex-reversal%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).</li>
<li>DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yolk-sac-derived+macrophages+regulate+fetal+testis+vascularization+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).</li>
<li>Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+analysis+of+vascularization+during+primary+development+of+an+organ%2C+the+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).</li>
<li>Walton, K. D., Kolterud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+fetal+whole+intestine+culture+system+for+ex+vivo+manipulation+of+signaling+pathways+and+three-dimensional+live+imaging+of+villus+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development.</a> J. Vis. Exp. (91), e51817(2014).</li>
<li>Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+culture+system+to+study+thyroid+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An ex vivo culture system to study thyroid development.</a> J. Vis. Exp. (88), e51641(2014).</li>
<li>Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+embryonic+mouse+kidney%2C+culture+in+vitro%2C+and+imaging+of+the+developing+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).</li>
<li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+ex+vivo+culturing+of+embryonic+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. (66), e3979(2012).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720(2011).</li>
<li>Combes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Endothelial+cell+migration+directs+testis+cord+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation.</a> Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).</li>
<li>Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+and+kinase+domain+region+receptor+are+involved+in+both+seminiferous+cord+formation+and+vascular+development+during+testis+morphogenesis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat.</a> Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).</li>
<li>Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular-mesenchymal+cross-talk+through+Vegf+and+Pdgf+drives+organ+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).</li>
<li>Clapcote, S. J., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplex+PCR+assay+for+sex+determination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Simplex PCR assay for sex determination in mice.</a> BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).</li>
<li>Nel-Themaat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Morphometric+Analysis+of+Testis+Cord+Formation+in%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in.</a> Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).</li>
<li>Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+male-specific+role+for+SOX9+in+vertebrate+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination.</a> Development. 122, 2813-2822 (1996).</li>
<li>Morais da Silva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Sox9+expression+during+gonadal+development+implies+a+conserved+role+for+the+gene+in+testis+differentiation+in+mammals+and+birds%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds.</a> 14, 62-68 (1996).</li>
<li>Rockich, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9+plays+multiple+roles+in+the+lung+epithelium+during+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).</li>
<li>Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+and+development+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Organogenesis and development of the liver.</a> Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).</li>
<li>Brennan, J., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+tissue%2C+two+fates%3A+Molecular+genetic+events+that+underlie+testis+versus+ovary+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development.</a> Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).</li>
<li>Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-specific+cell+migration+into+the+developing+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Male-specific cell migration into the developing gonad.</a> Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).</li>
<li>Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+spermatogenesis+using+an+organ+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro spermatogenesis using an organ culture technique.</a> Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471, 504-507 (2011).</li>
<li>Gohbara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+murine+spermatogenesis+in+an+organ+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system.</a> Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מחקר זה מדגים שיטת vivo לשעבר איבר שלמה טיפה שיש יישומים פוטנציאליים רבים ללימוד התפתחות העובר. טכניקה זו יכולה לשמש לאיברים מרובים, ומאפשרת לחוקר לענות על שאלות ביולוגיות שקשה לבחון באמצעות in vivo גישות בשל חוסר נגישות של עוברים וקטלניים עובריים פוטנציאל. יש שיטה זו תרבות הטבות נוספות על אחר במבחנה גישות כגון שורות תאי יונקים: ניתן להשתמש בכל איברים, ולכן שמירה על יחסי גומלין בין תאית קריטית שנמצאים ברחם; ותרבות הנפח קטן מאוד (~ 30 μl), ולכן ש...

התחדשות איברים in vivo בבני האדם היא מוגבלת מאוד; לכן, הנדסת רקמות, התפתחות רקמות ואיברים מהתאים בודדים שנתרמו על ידי מארח, הופכת טיפול פוטנציאלי אטרקטיבי להחלפת איברים. עם זאת, לאסטרטגיה טיפולית זו כדי להצליח, גורמים ואינטראקציות הסלולר מעורבות בהמורפוגנזה של האיבר יש ללמוד ביסודיות והבינו היטב. בשל חוסר היכולת ללמוד פיתוח של איברים ספציפיים עם גישות מסורתיות, חוקרים פנו לעובר כל חלופה או תרבויות איבר שלמות. Kalaskar et al. 1 הראה כי תרבות עובר כל vivo לשעבר מניבה תוצאות דומות (58% בעוברים בתרבית) בפיתוח הרחם, המצביע על כך שיטות תרבות vivo לשעבר הן אלטרנטיבה אפשרית ללימודי organogenesis. מערכת אישית איבר תרבות, כגון זה vivo לשעבר droplet מערכת התרבות, מאפשרת לעצמאית ניתוח איבר שלם של השפעות מערכתיות, תוך התרת מניפולציה של מסלול איתות ספציפי או אינטראקציות הסלולר באמצעות תוספת של חומרים כימיים או נוגדנים תרופתיים. באופן מסורתי, המחקר של פיתוח איבר העוברי היה מוגבל לטכנולוגיות מהונדסים ועכבר נוקאאוט, בנוסף לחומרים כימיים תרופתיים נמסרו אימהי. עם זאת, יש בעיות טכניות הכרוכות בטכניקות אלה וטיפולים בvivo; רוב החששות סובבים סביב תופעות של השפעה על איברים שונים בו זמנית אשר לעתים קרובות תוצאות קטלניות עוברי. חשש נוסף של מחקרי מניפולציה התפתחות עוברים פרמקולוגית הוא ההשפעה האימהית של תרופות על התפתחות עוברית ברחם (למשל, חילוף חומרים אימהיים של התרופה לפני שהוא מגיע לעובר) ואם ריאגנטים כזה יכול לעבור את מחסום השליה. טכניקת תרבות איבר השלמה תיארהכאן הותאם מפרוטוקול שתואר לראשונה על ידי Maatouk et al. 2, שבו בלוטות מין העובר כל מודגרת בתרבויות טיפה זקופות vivo לשעבר. יתרון משמעותי אחד culturing בלוטות מין העובר הוא שמעכבי מולקולה קטנה יכולים בקלות לגשת לכל האיבר בדיפוזיה פשוטה. . DeFalco et al הראה כי ניצול vivo לשעבר שיטת תרבות אגל זה בשיתוף עם מעכבי מולקולה קטנה יכול לשמש כדי לחקור תהליכי איתות ואינטראקציות המתרחשות במהלך התפתחות בלוטת מין 3; תהליכים אלה יהיו קשים לבחון in vivo בשל אתגרים טכניים (למשל, מעבר של תרופות דרך השליה או הקטלני של איברים המשפיעים מרובים באמצעות גישות גנטיות או תרופתיות). תרבות רביב היא לא רק שיפור בהיבטים מסוימים על בניסויים ברחם, אבל גם את זה הוא שיפור לעומת במבחנה ולשעבר viמערכות VO גם כן. השימוש בשורות תאים ללמוד המורפוגנזה קשה מאוד כי חסרים להם הסוגים השונים של תאים, חסרי רכיבים קריטיים מטריצה ​​תאית (ECM) המאפשרים את היווצרותה של אדריכלות איבר, ויכול להציג חפצים באיתות מפלים. למרות הנדסת רקמות עשתה שיפורים משמעותיים ביצירת פיגומי הדמית ECM, חוסר הידע לגביהם אותות נדרשים על ידי כל סוג תא בorganogenesis עושה את זה מאתגר לבנות מערכת איברים במבחנה. מערכות אחרות vivo לשעבר כבר הוקמו בעבר ללמוד organogenesis, או לייתר דיוק המורפוגנזה, והיו מוצלח מאוד עבור הדמיה חיה של איברי העובר באגרו 4, 5 Transwells, מסננים 6, ומטריצות פיגום אחרות 7,8. היתרון של מערכת תרבות הטיפה הוא שהיא מאפשרת המחקר של המורפוגנזה על ידי מתן האפשרות לניצול פחות חומרים כימיים, אשר often יקר, אלא גם נותן את מתח פן איבר, וזה חשוב ליכולות צמיחה ואיתות 9. בעכבר, המורפוגנזה אשך ראשונית מתרחשת בין העוברית (E) בשלבי E11.5 וE13.5; שלבים אלה מהווים את חלון הזמן האופטימלי לבחינת גורמים המשפיעים על התמיינות מין ספציפי. בין התהליכים הקריטיים המתרחשים במהלך היווצרות אשך הדור של אדריכלות כבל אשך ויצירת רשת כלי דם אשך ספציפי הם. ניצול לשעבר מערכת תרבות אגל זה vivo כל איבר, אחד הוא מסוגל לשנות כלי דם זכר ספציפי ומעכבים המורפוגנזה אשך באמצעות מעכבי מולקולה קטנה שחוסם את הפעילות של הקולטנים לגורם גדילה של אנדותל כלי דם (VEGF); שיפוץ של כלי דם בתיווך VEGF הוא קריטי להתפתחות אשכים 10-12. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת בהצלחה לאיברים אחרים ויכולה למקד את הזמן ספציפיחלונות של פיתוח. כל הר ההדמיה האיבר מאפשרת ההדמיה של מבנים חיוניים, כמו גם שינויים מבניים וסלולריים כתוצאה מהממשל של מעכבים שונים. חשוב לציין, מערכת זו יש יתרון בכך שהחוקר יכול לעקוף תופעות בלבול פוטנציאליות מממשל תרופה אימהי או שיבוש מערכתי בin vivo אסטרטגיות גן ממוקד. כך, מערכת כולה תרבות אגל vivo לשעבר איבר זה יכול לשפר באופן משמעותי את היכולת להבין את יחסי הגומלין והאיתות שמתרחשים במיוחד באיברים מסוימים במהלך התפתחות עוברית.

<table><tbody><tr><td>Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישרברנד</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>משקפי כיסוי: ריבועים (22 מ"מ x 22 מ"מ, מס' 1.5)</td> <td>פישרברנד</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>סאלי הנסן אקסטרים ללבוש לק, בלתי נראה</td><td>סאלי הנסן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 רצועות 0.2 מ"ל צינורות PCR & כובעים שטוחים מנותקים</td><td>GeneMate</td><td>T3218-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>דנוויל</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 0.6 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>דנוויל</td><td>C2176</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l טיפים למחסום דיוק של SHARP</td><td>דנוויל</td><td>P1096FR</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l טיפים למחסום דיוק של SHARP</td><td>דנוויל</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l טיפים למחסום דיוק SHARP</td><td>דנוויל</td><td>P1122</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu; l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1126</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל עם 27 מחטים מד</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 10 מ"ל</td><td>BD</td><td>305559</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; מסנן מזרק M PES</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>דרגה 3 נייר סינון איכותי כיתה סטנדרטית, מעגל, 185 מ"מ</td><td>Whatman</td><td>1003-185</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 35 מ"מ Easy Grip Style צלחת תרבית תאים</td><td>פלקון/קורנינג</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי, סטרילי (100 מ"מ x 15 מ"מ)</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>ניו ברונסוויק גלקסי 14 S CO2</td><td>Eppendorf</td><td>CO14S-120-0000</td><td></td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגית</td><td>Nuare</td><td>NU-425-400</td><td></td></tr><tr><td>מיני צנטריפוגה&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>BioExpress GyroMixer משתנה XL</td><td>GeneMate</td><td>R-3200-1XL</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermal Cycler עם לוח בקרה</td><td>Eppendorf</td><td>950040015</td><td></td></tr><tr><td>SMZ445 סטריאומיקרוסקופ</td><td>Nikon</td><td>SMZ445</td><td></td></tr><tr><td>MultiImage Light Cabinet עם תוכנת AlphaEase</td><td>Alpha Innotech Corporation</td><td>הופסק</td><td></td></tr><tr><td>הוכחה מוחלטת 200 אתנול</td><td>פישר</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>פישר</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט (דיבאסיק MW 142) Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>S374-1</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט (מונו-בסיסי MW 136) KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-1KG</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>פישר</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3911-1KG</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>M2393-100g</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>אמביון טכנולוגיות חיים ללא נוקלאז</td><td></td><td>AM9938&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>פריימר XY PCR&nbsp;</td><td>IDT</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>פישר</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>אתילנדיאמין חומצה טטראצטית (EDTA)</td> <td>פישר</td><td>BP2482-1</td><td></td></tr><tr><td>1% תמיסת אתידיום ברומיד</td><td>פישר</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td> רעיל <td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>367176-2.5 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>Trizma בסיס</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>dNTP סט, 100 מ"מ פתרונות</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td></td></tr><tr><td>DNA Choice Taq פולימראז עם 10x מאגר</td><td>דנוויל</td><td>CB-4050-3</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>פישר</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>FluorMount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>מימן כלורי ( HCl)</td><td>Fisher</td><td>A144212</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA), אבקה, Fraction V, בידוד הלם חום</td><td>Bioexpress</td><td>0332-100g</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS), משולש 100 ננומטר מסונן</td><td>פישר</td><td>03-600-511</td><td>השבתה בחום לפני השימוש</td></tr><tr><td>בפניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>שימוש ב-1:100</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO), Hybri-max, סיגמא</td><td></td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VEGFR מעכב טירוזין קינאז II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem</td><td>EMD Millipore</td><td>676481</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Sox9 נוגדן</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>שימוש בדילול: 1:4,000</td></tr><tr><td>חולדה נגד עכבר PECAM1 (CD31) נוגדן</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>שימוש בדילול: 1:250</td></tr><tr><td>ארנב שסוע Caspase-3 (ASP175) איתות</td><td>תאי</td> נוגדן <td>9661S</td><td>שימוש בדילול: 1:250</td></tr><tr><td>חולדה E-cadherin / CDH1 נוגדן (ECCD-2)</td><td>Life Technologies</td><td>13-1900</td><td>שימוש בדילול: 1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate</td><td>Invitrogen (בדיקות מולקולריות)</td><td>H1399</td><td>שימוש ב-2 ug/ml</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-165-153</td><td>שימוש בדילול: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-605-153</td><td>שימוש ב דילול: 1:500</td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד ארנב חמור IgG (H+L), אלקסה פלואור 555 מצומד</td><td>Life Technologies</td><td>A31572</td><td>שימוש בדילול: 1:500</td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד ארנב חמור IgG (H+L), אלקסה פלואור 488 מצומד</td><td>Life Technologies</td><td>A21206</td><td>שימוש בדילול: 1:500</td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד חולדות חמור (H+L), אלקסה פלואור 488 מצומד</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td>שימוש בדילול: 1:500</td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד ארנב חמור IgG (H+L), Alexa Fluor 647 Conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>שימוש בדילול: 1:500</td></tr></tbody></table>

שימוש<em&gt; ex vivo</em&gt; תרבויות הזקופה טיפה של איברים העובר שלמים לחקר תהליכים התפתחותיים בעכבר organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

חוקר organogenesis ברחם הוא תהליך מאתגר מבחינה טכנית ביונקי שליה בשל חוסר נגישות של חומרים כימיים לעוברים המתפתחים בתוך הרחם. שיטה חדשה שפותחה תרבות אגל vivo לשעבר זקופה מספקת חלופה אטרקטיבית למחקרים שבוצעו ברחם. תרבות אגל vivo לשעבר מספקת את היכולת לבחון ולטפל אינטראקציות הסלולר ומסלולי איתות מגוונים באמצעות שימוש בחסימה שונות ותרכובות הפעלה; בנוסף, את ההשפעות של חומרים כימיים תרופתיים שונים על התפתחות איברים ספציפיים ניתן ללמוד ללא תופעות לוואי בלתי רצויות של אספקת סמים מערכתית ברחם. בהשוואה לאחרים במערכות חוץ גופית, תרבות אגל לא רק מאפשרת ליכולת ללמוד אינטראקציות תלת-ממדי המורפוגנזה ותאי תאים, שלא יכול להיות מועתקות בשורות תאי יונקים, אלא גם דורשת פחות משמעותי reagents מאשר אחר vivo לשעבר ובפרוטוקולי מבחנה. מסמך זה מדגים נתיחה נכונה עכבר עוברית איבר וטכניקות תרבות טיפה זקופות, ואחריו immunofluorescence איבר השלם כדי להדגים את היעילות של השיטה. Vivo לשעבר שיטת תרבות אגל מאפשרת ההיווצרות של אדריכלות איבר דומה למה שרואה בvivo ויכול להיות מנוצל כדי ללמוד תהליכים קשים למחקר אחר בשל קטלני עוברית במודלי in vivo. כמערכת יישום מודל, מעכב מולקולה קטנה ישמש לחקור את התפקיד של כלי דם בהמורפוגנזה אשכים. vivo לשעבר שיטת תרבות אגל זה ניתנת להרחבה למערכות אחרות של העובר איברים, כגון ריאות ואפשרות אחרות, אם כי כל איבר חייב להיות בהרחבה למד לקבוע שינויים איבר ספציפי לפרוטוקול. מערכת תרבות איבר זה מספקת גמישות בניסויים עם איברי העובר, ותוצאות obtaineד באמצעות טכניקה זו תסייע לחוקרים להרוויח תובנות בהתפתחות עוברים.

תרבות אגל vivo לשעבר מאפשרת לתמרן איברים שלמים, כגון בלוטת המין, ללמוד אינטראקציות ודינמיקה סלולריות. איור 1 מדגים בצורה צעד חכם כיצד להכין תרבות אגל האשכים E11.5. הצעדים הראשונים בפרוטוקול התרבות כוללים את ההסרה הראשונית של הרחם המכיל עובר מעכבר האמא (איור 1 א ו -1 B). לאחר הסרת הרחם מהאם, דופן הרחם היא לחתוך והעוברים שוחררו מצק החלמון לתוך PBS לנתיחה נוספת (איור 1 ג-ה). לאחר הסרת האיברים פנימיים, הרכס ואברי המין נראה בב...

תרבית הטיפות הזקופות ex vivo היא אלטרנטיבה לטכניקות הניסוי הנוכחיות in vitro ו-in vivo. פרוטוקול זה קל לביצוע ודורש כמויות קטנות יותר של ריאגנטים, תוך מתן אפשרות לתפעל ולחקור כלי דם עובריים, מורפוגנזה ואורגנוגנזה.

שימוש<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות הזקופה טיפה של איברים העובר שלמים לחקר תהליכים התפתחותיים בעכבר organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבחון את ההשפעות של מעכבים מולקולריים קטנים על התפתחות איברים עובריים באמצעות טכניקת תרבית טיפות ex vivo. הדבר מתבצע תחילה על ידי פתיחת הפריטונאום של עכברה ההרה והוצאת הרחם המכיל את העוברים. לאחר מכן, העוברים מוצאים מהרחם ומשוחררים משקי החלמון והשליה.לאחר מכן, קומפלקס ה-goad me neph מופרד ומבודל מהעובר. לבסוף, קומפלקס ה-goad Meris מותיר בטיפוח בתוך טיפה עם או ללא מעכב של מולקולה קטנה. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית כדי להראות שינויים במבנה האיבר באמצעות נוגדנים ספציפיים לסוג התא.היתרון של שיטת תרבית הטיפות האנכית של איבר שלם ex vivo, בהשוואה למשל לקווי תרביות תאים, הוא היתרון שבמבנה תלת-ממדי המאפשר אינטראקציות תאיות הנובעות ממיקום, כמו גם סיגנלציה של המטריקס החוץ-תאי שעשויה להיות חשובה להיווצרות האיבר ולדפוסי התפתחותו. יתרה מכך, טכניקת הטיפות האנכיות שלנו מאפשרת שימוש בכמות מופחתת של ריאגנטים, ובכך מפחיתה עלויות ורעילות פוטנציאלית עקב תופעות לוואי. זהו יתרון על פני טכניקות אחרות של איברים שלמים, ועם זאת היא עדיין מאפשרת דיפוזיה של סוכנים פרמקולוגיים אל האיבר המטרה.למרות שטכניקה זו יכולה לספק תובנות לגבי ההתפתחות של מערכת כלי הדם באשכים עובריים, ניתן להחיל אותה גם על איברים עובריים אחרים כמו הריאה, ואנו יכולים להשתמש בה גם כדי לחקור תהל

using-ex-vivo-upright-droplet-cultures-whole-fetal-organs-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

וידאו זה מדגים את פרוטוקול עבור בידוד explants culturing של forebrain העכבר מיום embyonic 12 עכברים. נהלים להסרת הרחם, עוברים מן הרחם, ואת ביתור של עוברים מקבלים. בנוסף המתודולוגיה להעברת אלה explants על ממברנות המקצועית שעליו הם מתורבתים מודגם. התפתחות של המוח הקדמי ניתן ללמוד במבחנה באמצעות ההכנות וכן שינויים בביטוי הגנים.

Forebrain הגב עכבר Explant בידוד

כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד, תרבות ומניפולציה של לבלב העוברי של עכבר. זה מייצג...

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

מחקרים התפתחותיים בעכבר הם הקשו על ידי חוסר הנגישות של העובר במהלך הריון. על מנת לקדם את התרבות לטווח הארוך של הלב העוברי בשלבים מאוחרים של הריון, פיתחנו פרוטוקול בו הלב נכרת הוא בתרבית Matrigel חצי מוצק, לדלל.

רומן<em&gt; Ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

סרום מנוצל בתרבויות עובר מכיל מרכיבים לא ידועים שיכול להשפיע על התוצאה של ניסויים במיוחד במחקרים שכלל אינטראקציות איתות. כאן אנו מנוצלים מערכת תרבות מחומצן בסרום ללא ולהראות שעוברי עכברים באמצע ההריון תרבותי ל16-40 שעה להפגין פיתוח מורפולוגיים דומה לעוברים המתפתחים ברחם.

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

טכנולוגיית הדמיה משופרת מאפשרת הדמיה תלת מימדית של איברים במהלך ההתפתחות. כאן אנו מתארים מערכת תרבית איברים שלמה המאפשרת הדמיה חיה של הווילי המתפתח במעי העכבר העוברי.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל Ex Vivo מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

שיטה פשוטה להקים השליה אדם מן המעלה הראשונה (villous) ותרבויות איבר decidual מתואר. תרבויות איבר Villous ו decidual הם כלי שלא יסולא בפז ללימוד בפתוגנזה בממשק האם והעובר האדם. זיהום עם חיידקים ליסטריה חיידק תאי פקולטטיבי מודגם.

שלית Decidual אדם תרבויות איברים ללמוד זיהומים בבית הממשק האם והעובר

אנו מציגים שיטה בידוד והתרבות של צינור העכבר Wolffian (WD). אנחנו גם מדגימים נוהל מפורט immunostaining הר שלם של WDS תרבותי / טרי מבודד עם נוגדנים מתויג fluorescently. יחד, טכניקות אלו מאפשרים את חקר התפתחות WD, התפתלות, והבחנה.

תרבות איברים שלמים הר Immunofluorescence מכתים של עכבר Wolffian צינוריות

כאן, אנו מספקים שיטה נמוכים ואמין כדי ליצור electroporated המוח organotypic פרוסה תרבויות מעוברים עכבר מתאים מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות הדמיה לחיות.

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

אנו מציגים את הפרוטוקולים לבחון התפתחות הלב העכבר באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי הר שלם על העכבר עוברי גזור מן חדרית ספציפי MLC-2v-tdTomato כתב טוק-אין עכברים. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע בכל שלב של היווצרות חדרית במהלך התפתחות הלב העכבר מבלי מהגידולים שיטות מעבדה הומנית.

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

פלטפורמה משופרת לתרבות העוברים המלאים מאפשרת פיתוח רחם אקס רציף וחזק של עוברי עכבר לאחר ההשתלה עד שישה ימים, משלבי טרום ההדבקה ועד לאורגנוגנזה מתקדמת. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים את ההליך הסטנדרטי לתרבות עוברית מוצלחת באמצעות לוחות סטטיים ומערכות בקבוק מסתובבות.

רחם לשעבר תרבות של עוברי עכבר מ pregastrulation כדי Organogenesis מתקדם

חקור תהליכי אורגנוגנזה בעכברים באמצעות שיטת תרבית טיפה אקס ויו. טכניקה זו מאפשרת בחינת השפעת מעכבי מולקולות קטנות על התפתחות איברים עובריים תוך שימוש בכמויות קטנות של ריאגנטים.

שימוש

גלה סרטונים נוספים