הערכה של מאפייני המערכת החיסוניים של תאי גזע mesenchymal האדם (MSCs)
24 בדצמבר 2015
תכונות המערכת החיסונית של תאים האנושיים mesenchymal גזע (MSC) מופיעות רלוונטיות יותר ויותר ליישום קליני. באמצעות מערכת שיתוף התרבות של תאי גזע ולויקוציטים דם ההיקפי מראש צבעונית עם succinimidyl אסתר carboxyfluorescein צבע הניאון (CFSE), אנו מתארים את ההערכה במבחנה של תפקוד מערכת חיסון MSC על התפשטות יקוציט מפעיל ותת-אוכלוסיות ספציפיות.
המטרה הכללית של ניסוי זה היא להעריך את התכונות האימונומודולטוריות של תאי גזע מזנכימליים אנושיים או msc. שיטה זו יכולה לסייע בהבהרת המנגנונים המעורבים באימונומודולציה של תאי גזע מזנכימליים אנושיים, תהליך שעשוי להיות בעל רלוונטיות טיפולית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להעריך הן את התרחשות השכפול של לוקוציטים אפקטורים והן את מספר חלוקות התאים, ובכך להדגים את מהלך הפרוצדורה.
טכנאי מהמעבדה שלי: כדי לבודד pbmc, התחילו בדילול של 25 milliliters של דגימת דם מלאה עם הפרינה ב-25 milliliters של PBS בתוך מבחנה קונית של 50 milliliter. לאחר מכן, הוסיפו 15 milliliters של phi, call pack density gradient למבחנה חדשה של 50 milliliter. לאחר מכן, תוך החזקת המבחנה בזווית, שכבו באיטיות את תרחיף התאים המדולל מעל מדרג הצפיפות.
במידה ונדרש טיפול כזה, לא יתרחש ערבוב בין השכבות. אחד השלבים הקריטיים ביותר בניסוי זה הוא השכבת הדם ללא הפרעה למדרג הצפיפות. זאת כדי להבטיח טהרה גבוהה וזיהום נמוך של תאי דם אדומים ב-pbmc המבודדים.
כעת, יש להפריד את התאים באמצעות צנטריפוגציה. שלוש שכבות נפרדות אמורות להיות גלויות: שכבת הפלסמה העליונה, שכבת מדרג הצפיפות של ה-fial בבסיס, ושכבה דקה של PBMC במרכז.
בעזרת פיפטת PE, הסר את השכבה העליונה תוך הקפדה שלא לשאוב את שכבת הביניים (interphase). לאחר מכן, השתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי להעביר בזהירות את ה-pbmc לפרוקת קונית של 50 מיליליטר. ערבב את התאים עם 20 מיליליטר של PBS ולאחר מכן סבב אותם בצנטריפוגה כדי להסיר שאריות של מדרג הצפיפות.
לאחר מכן, שטפו את המשקע ב-20 milliliters נוספים של PBS כדי להסיר את הפלטלטים. השעיקו את המשקע השני במצע לוקוציטים מלא בריכוז של 1 × 10⁷ תאים למילילטר. להקמת שבילי תרבית משותפת (co-culture) של MSC ולוקוציטים, חממו מראש מצע MSC מלא ל-37 °C למשך לא יותר מ-30 דקות.
לאחר מכן, זרעו 5×10⁴ MSC לכל מיליליטר של מצע MSC מלא לכל באר בלוחות של 24 באערים לצורך היצמדות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C, כדי לאפשר לתאים להגיע ל-80% confluence. למחרת בבוקר, שאבו את המצע והוסיפו את המספר המתאים של PBMC מסומנים ב-CFSE ל-MSC בתוך מיליליטר אחד של מצע לוקוציטים מלא. ביחס של 1:10 של MSC ל-PBMC, הפעילו את התאים באמצעות 10 µg של PHA למילליטר של מצע לוקוציטים מלא.
לאחר מכן, בימים השלישי והחמישי של התרבית המשותפת, העבירו את מספר התרביות המשותפות המתאים למבחנות בעלות תחתית עגולה ובחנו את השכפול של הלוקוציטים המסומנים ב-CFSE באמצעות אנליזה של ציטומטריה זרימתית לביצוע בדיקת דיכוי אפקטורית. התחילו בהקמת תרבית משותפת של MSCs ו-pBMCs כפי שהודגם זה עתה, עם 2.5 × 10⁶ pBMCs בתרבית משותפת עם 250,000 MSCs, כדי להבטיח כמות מספקת של pBMCs בתרבית משותפת עם MSCs לצורך בחירת תת-אוכלוסיות.
לאחר 48 עד 72 שעות ב-37 degrees Celsius, בצעו סלקציה של הלוקוציטים בעלי הפעילות האימונומודולטורית שהשראו ה-MSC באמצעות חרוזי מגנט מתאימים. לאחר מכן, הוסיפו תאי T אלוגנאיים CD4-positive המסומנים ב-CFSE, בנפח של one milliliter של מצע לוקוציטים מלא לכל באר, ביחסים ניסיוניים שונים. לאחר מכן, הוסיפו מיקרו-חרוזים מצומדים ל-anti-CD3 בערך של יחס B לתא של one-to-one, כדי לעורר את תאי ה-T ה-CD4-positive.
ביום השלישי של התרבית המשותפת (co-culture), העריכו את השגשוג של תאי T חיוביים ל-CD4 המסומנים ב-CFSE באמצעות ציטומטריה של זרימה. MSCs הם תאים דבקים בעלי מורפולוגיה של כישכס בצורת צמיג. PBMC ולוקוציטים הם תאים קטנים, עגולים ולא דבקים, מה שמאפשר הבחנה ברורה בין שתי אוכלוסיות תאים אלו. בתרבית משותפת, כאשר אין שגשוג, תאים המסומנים ב-CFSE נצפים כשיא פלואורסצנטי חד ובעל חיוביות גבוהה כאשר התאים הופעלו.
שגשוג מתבטא במספר שיאים קטנים יותר עם איבוד והסטה שמאלה של עוצמת הפלואורסצנציה כאשר חלה דיכוי של השגשוג. לדוגמה, בתרבית משותפת של MSC, מספר השיאים הקטנים פוחת עם עלייה נלווית בעוצמת הפלואורסצנציה, כפי שבא לידי ביטוי בהסטת השיאים ימינה ובעלייה בחדות של השיא הימני ביותר, המייצג את התאים שאינם מתחלקים בבדיקת דיכוי אפקטורית. ניתן להעריך עוד את ההשפעה המדכאת של MSC על שגשוג של תאי T חיוביים ל-CD4 באופן תלוי מינון.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעריך את האימונומודולציה של תאי גזע מזנכימליים אנושיים. זכור כי עבודה עם תאים אנושיים עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את התכונות האימונו-מודולטוריות של תאי גזע מזנכימליים אנושיים (MSCs) באמצעות מערכת של תרבית משותפת (co-culture) עם לוקוציטים של דם פריפריאלי. ההערכה מתמקדת בשגחה (proliferation) של לוקוציטים אפקטורים ושל תת-אוכלוסיות ספציפיות, תוך הדגשת הרלוונטיות הטיפולית הפוטנציאלית של MSCs.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- מחקר תאי גזע
- שגשוג תאים
רקע
- לתאי גזע מזנכימליים של בני אדם (MSCs) יש תכונות של ויסות חיסוני.
- הבנת האינטראקציות של MSCs עם לוקוציטים היא קריטית עבור יישומים טיפוליים.
- שגשוג של לוקוציטים אפקטורים הוא היבט מרכזי של התגובה החיסונית.
- מערכות של תרבית משותפת (Co-culture) יכולות לדמות ביעילות אינטראקציות אלו in vitro.
מטרת המחקר
- להערכת ההשפעות האימונומודולטוריות של MSCs על ת proliferation של לוקוציטים.
- להבהרת מנגנוני האימונומודולציה של MSCs.
- לבחינת הרלוונטיות הטיפולית של MSCs ביישומים קליניים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מערכת תרבית משותפת של MSCs ולוקוציטים מדם פריפריאלי.
- שימוש ב-carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) למעקב אחר תאים.
- הערכת שגשוג של לוקוציטים אפקטוריים.
- ניתוח של תתי-אוכלוסיות ספציפיות של לוקוציטים.
תוצאות עיקריות
- הדגמה של ויסות הפרייה של לוקוציטים המושרה על ידי MSCs.
- זיהוי תתי-אוכלוסיות ספציפיות המושפעות מ-MSCs.
- אספקת תובנות לגבי מנגנוני האימונו-מודולציה של MSCs.
- הדגשת הפוטנציאל של MSCs בהקשרים טיפוליים.
מסקנות
- תאי גזע מזנכים (MSCs) מראים השפעות אימונומודולטוריות משמעותיות על לוקוציטים.
- הממצאים תומכים בשימוש טיפולי ב-MSCs במסגרות קליניות.
- דרוש מחקר נוסף כדי להבין במלואו את המנגנונים המעורבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכת התפקוד האימונומודולטורי של MSC באמצעות בדיקות פרוליפרציה של לוקוציטים המבוססות על CFSE מספקת שיטה כמותית וניתנת לשחזור להערכת פוטנציאל טיפולי במחלות תיווך חיסוני. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות (target validation) על ידי אפשור הפחתת סיכונים מכניסטית של דיכוי חיסוני המתווך על ידי MSC לפני השקעה פרה-קלינית. יכולת ההסתגלות של הבדיקה לתתי-אוכלוסיות ספציפיות של לוקוציטים מגבירה את הביטחון החזוי בבחירת מועמדים מובילים עבור מסלולי פיתוח של תרופות אימונומודולטוריות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של דיכוי proliferace של לוקוציטים אפקטורים המתווך על ידי MSC כקריאה פונקציונלית של פעילות אימונומודולטורית.
- ערך תפעולי: מספק שיטה סטנדרטית מבוססת סימון לכימות היסטוריית חלוקה וקינטיקה של proliferace ללא שימוש ברדיואקטיביות.
- ערך מדעי: תומך בסריקה פנוטיפית של תורמי MSC או אסטרטגיות התנייה מוקדמת (pre-conditioning) באמצעות מדידת דיכוי של proliferace של לוקוציטים המסומנים ב-CFSE.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מאפשר בידוד ומעקב אחר תתי-אוכלוסיות ספציפיות של לוקוציטים (למשל, תאי T מסוג +CD4) באמצעות ברירה באמצעות חרוזי מגנט לפני תרבית משותפת, ובכך מאפשר פרופיל של אימונומודולציה ספציפי לתתי-אוכלוסיות.
- ערך תפעולי: פרופילי דילול של CFSE המופקים באמצעות ציטומטריה של זרימה מספקים נתונים כמותיים ומולטי-פרמטריים על דיכוי פרוליפרציה והיסטוריית חלוקה.
- ערך מדעי: מקל על הערכת תגובת מינון של אימונומודולציה של MSC ביחסים משתנים של MSC:לוקוציטים ותנאי הפעלה שונים (למשל, גירוי באמצעות PHA).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין עוצמה אימונומודולטורית in vitro לבין יעילות קלינית פוטנציאלית במחלות הקשורות למערכת החיסון, באמצעות מידול של תקשורת (crosstalk) בין MSC ללוקוציטים.
- ערך תפעולי: מאפשר דגימה לאורך זמן (למשל, בימים 3 ו-5) להערכת הדינמיקה הזמנית של דיכוי והתאוששות.
- ערך מדעי: תומך בהערכה התואמת לסמנים ביולוגיים על ידי קורלציה בין דיכוי פרוליפרציה לבין ביטוי ציטוקינים תוך-תאי בלוקוציטים בשיטחה של תרבית משולבת (co-culture).
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
בדיקת התרבדות לוקוציטים המבוססת על CFSE משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים ככלי לסריקה אימונומודולטורית פונקציונלית, המגשרת בין שלבי תיקוף המטרה לאופטימיזציית המועמדים עבור תרפיה מבוססת MSC.
- ביולוגיה של התגליות: בוחן את ההיפותזה ש-MSCs מדכאים פרוליפרציה של לוקוציטים, ומספק תובנה מכניסטית לגבי מסלולים של דיכוי חיסוני.
- סינון: מספק קריאות פרוליפרציה כמותיות וניתנות לשחזור, המאפשרות השוואה בין מנות MSC, תורמים או תנאי הטרייה (priming).
- אנליזה: מייצר נתוני ציטומטריה של זרימה המסוגלים להבחין בפיקי פרוליפרציה, מעקב אחר חלוקות ותגובות ספציפיות לתתי-אוכלוסיות בתוך אוכלוסיות לוקוציטים הטרוגניות.
- מחקר תרגומי: ממדל אינטראקציות בין תאי מערכת החיסון של בני אדם ל-MSC בתנאי in vitro, ובכך תומך בהכללה להקשרים קליניים של ויסות חיסוני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה מודולרית וניתנת להתאמה, הישימה על סוגי תאי חיסון שונים ותנאי גרייה הרלוונטיים למחלות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי אספקת ראיות ישירות וכמותיות לדיכוי לוקוציטים המתווך על ידי MSC.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות יחסי MSC:לוקוציטים מוגדרים, פרוטוקולי סימון CFSE ואסטרטגיות gating של ציטומטריית זרימה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי זיהוי MSC בעלות פעילות אימונו-מודולטורית חזקה וניתנת לשחזור בשלב מוקדם של הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדי MSC בהתבסס על חוזק אימונו-מודולטורי תפקודי ולא רק על סמננים פנוטיפיים.
שיקולי יישום
- נדרש מומחה בבידוד לוקוציטים ראשוניים, סימון ב-CFSE ואנליזה של ציטומטריית זרימה רב-צבעית.
- תלוי בגישה לציטומטרים של זרימה המסוגלים להבחין בשיאי דילול של CFSE ובמערכות הפרדה באמצעות חרוזי מגנט לבידוד תתי-אוכלוסיות.
- מחייב סטנדרטיזציה של תנאי הפעלת הלוקוציטים (למשל, ריכוז PHA) ופרוטוקולי תרבית מקדימה של MSC בין אתרים שונים.
- דורש אופטימיזציה של יחסי MSC:לוקוציטים ושל משך זמן השילוב בתרבית (co-culture) כדי למנוע ארטיפקטים של צמיחת יתר או דלדול חומרי תזונה.
- מוגבל על ידי שונות בין תורמים בתגובתיות הלוקוציטים, דבר המחייב שימוש בביקורות של תורמים מאוחדים (pooled) או תורמים תואמים לצורך קבלת מדדי דיכוי הדירים.
