המצאה של מכאני מתכוונן ויו מתכת פיגומים עבור יישומים ביו

המטרה הכללית של הליך זה היא לייצר פיגומים מתכתיים ביו-אקטיביים בעלי תכונות מכניות ניתנות לכיוון עבור יישומים ביו-רפואיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום השתלים האורתופדיים, כגון ההיתכנות של פיגום מתכתי בעל תכונות מכניות ניתנות לכיוון המסוגל להוביל תרופות. שיטת התהליך זו פשוטה מכיוון שהיא דורשת בקרה אחת בלבד.

הפרמטרים מובילים הן לשיפור מכני והן לשחרור תרופות בר-קיימא, ומאפשרים ייצור של נקבוביות פונקציונליות. ראשית, ערבבו את הכמויות המתאימות של אבקת טיטניום, קפאין ו-KD four עבור פיגומים של טיטניום נקבובי בעלי ארבע נקבוביות ראשוניות בתוך בקבוקי פוליאתילן של 500 milliliters. סובבו את הבקבוקים בתנור כדורית (ball mill oven) במהירות של 30 RPM בטמפרטורה של 55 °C למשך 30 דקות. שפכו את התמיסות מהבקבוקי הפוליאתילן אל תוך תבניות אלומיניום גליליות בעלות קוטר וגובה של 60 millimeters.

לאחר איטום כל תבנית אלומיניום באמצעות כיסוי אלומיניום, סובב את התבניות בתנור כדורית (ball mill oven) במהירות של 30 RPM בטמפרטורה של 55 °C למשך 10 דקות. לאחר מכן, הנמך את הטמפרטורה של תנור הכדורית ל-44 °C וסובב את התבניות ברציפות במהירות של 30 RPM ובטמפרטורה של 44 °C למשך 12 שעות. לאחר קירור התבניות באמצעות סיבוב בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, הוצא אותן מתנור הכדורית.

לאחר מכן, הוצא את גוף הירוק (green body) המוצק של טיטניום-קפאין מכל תבנית אלומיניום באמצעות דחפן אלומיניום. לאחר מכן, הנח את גוף הירוק המוצק של טיטניום-קפאין בתוך שקית גומי ואטום את השקית לחלוטין על ידי קשירתה בחוט.

הניחו את שקית הגומי במיכל המים של מכונת דחיסה איזוסטטית קרה והפעילו לחץ איזוסטטי של 200 megapascals למשך 10 דקות. לאחר הוצאת שקית הגומי מהמכונה, הוציאו את הגוף הירוק הדחוס משקית הגומי. העבירו את הגוף הירוק של הטיטניום-קפאין לכור של Illumina.

הניחו את כור ההיתוך במכשיר לייבש קיפאון (Freeze dryer) והקפיאו לייבוש את הגוף הירוק כדי להסביג את פאזת הקפאין בטמפרטורה של 40- מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר ייבוש הקיפאון, סגרו את כור ההיתוך באמצעות זכוכית כיסוי של Illumina. הניחו את כור ההיתוך הסגור בתנור ואקום בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן העלו את טמפרטורת הכבשן ל-1300 °C בקצב חימום של 5 °C לדקה. דגימות של גוף ירוק שיבשו באוויר הן בדרך כלל חלשות ועשויות לקרוס. יש לנקוט משנה זהירות במהלך הטיפול.

לאחר השהייה בטמפרטורה של 1300 degrees Celsius למשך שעתיים, השאירו את הטיטניום נקבובי הממורכז בתנור למשך שש עד שבע שעות עד שיתקרר התנור לחלוטין לטמפרטורת החדר. לאחר הוצאת הדגימות מהתנור, בצעו עיבוד מכני של הדגימות ליצירת דגימות קטנות יותר והעבירו אותן לכלי זכוכית (beaker). הניחו את הכלי באוטוקלבה ועקרו את הדגימות בטמפרטורה של 121 degrees Celsius למשך 15 דקות.

עם סיום הפעולה, שטפו את הדגימות הסטריליות פעמיים במים מזוקקים ופעמיים ב-70% ethanol. לאחר מכן, הניחו את הטיטניום נקבובי בתוך צלחת פטרי וייבשו את הדגיים באוויר בטמפרטורת החדר תחת תאורת UV. בשלב זה, דללו חלבון פלואורסצנציה ירוק או GFP לריכוז של 100 µg/mL על ידי ערבוב של 1 mL עם 9 mL של תמיסת phosphate buffered saline של ECCOs. בתוך מבחנה פוליסטירן סטרילית של 50 mL, טבלו את הטיטניום נקבובי בתמיסת ה-GFP המדוללת בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, העבירו מיד את הדגימה למייבש ואקום (vacuum desiccator) ושאבו את האוויר מהמייבש למשך 10 דקות. כדי להבטיח שמי solução ה-GFP תחלחל למנקבי הטיטניום הפורוסי ביעילות רבה יותר, הוציאו את כלי הזכוכית מהמייבש. לאחר מכן, הוציאו את הטיטניום הפורוסי מכלי הזכוכית באמצעות פינצטה.

הניחו את הטיטניום נקבובי המצופה ב-GFP בתוך צלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטרים והניחו לו להתייבש באוויר למשך לילה בטמפרטורת החדר בתוך תא עבודה סטרילי (clean bench); למחרת, שטפו את הטיטניום הנקבובי פעמיים עם 10 מיליליטר של ECCOs phosphate buffered saline בתוך כלי זכוכית. לאחר מכן, העבירו את הטיטניום הנקבובי אל צלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטרים באמצעות פינצטה והניחו לו להתייבש באוויר למשך לילה בטמפרטורת החדר בתא עבודה סטרילי. לאחר מכן, הניחו את דגימות הטיטניום הנקבובי המצופות ב-GFP בגבהים שונים בתוך תבנית פלדה גלילית, והכניסו סט של מחוררים (punches) לחורי העליון והתחתון של תבנית הפלדה.

דחסו את הטיטניום נקבובי בתוך מכל התבנית מפלס בטמפרטורת החדר בכיוון Z של הדגימה. השתמשו במכונת לחיצה בקצבי מאמץ ביניים של 0.05 עד 0.1 inverse seconds מול המאמצים המופעלים שנקבעו מראש. השאירו את הלחץ למשך דקה אחת.

הוציאו את התבנית ממכונת הלחיצה. הניחו את טבעת הפלדה על תחתית גוף התבנית והחזירו את התבנית למכונת הלחיצה. לאחר היפוך התבנית, הפעילו לחץ באיטיות עד שהבוכנה תדחף את הדגימות הדחוסות החוצה מחור ה-D והוציאו את התבנית מהמכונה.

הוציאו את דגימות הטיטניום שעברו דחיסה מהתבנית פלדה. לבסוף, שטפו את הדגימות הדחוסות פעמיים עם 10 milliliters של phosphate buffered saline מבית ECCOs בתוך כוס כימית, והניחו להן להתייבש באוויר למשך לילה בטמפרטורת החדר על גבי בנץ' נקי. מבנה הנקבים בטיטניום שהוכן בשיטת freeze casting קונבנציונלית מראה יישור נקבים כיווני עם נקבים בעלי צורה לא סדירה, וזאת בשל הגדילה הדנדריטית של הקפאין.

במהלך הקפאת הדגימה בשיטת יציקה בהקפאה דינמית (dynamic freeze casting), נצפים נקבוביות כמעט ספריות עם התפלגות נקבוביות אקראית; צורת הנקבוביות הופכת שטוחה יותר ככל שדרגת הדחיסות עולה, והנקבוביות כמעט ונעלמות בדחיסות הגבוהה ביותר מכיוון שנקבוביות שכנות באות במגע זו עם זו. ארבעה דגימות בעלות נקבוביות משתנות הראו גבהים ראשוניים שונים לפני הדחיסות וגבהים כמעט זהים לאחר הדחיסות. נמצא כי הן השקעים והן הטיטניום הנקבובי מפגילים התנהגות של שחרור מהיר של GFP, עם אפקט של פריצה ראשונית שבה רוב החומר משתחרר בתוך שבוע אחד.

טיטניום נקבובי דחוס מראה שחרור רציף עד חודש אחד, כאשר GFP נראה בבירור על פני השטח גם לאחר חודש. עבור הפיגום בעל הליבה הדחוסה יותר, החלק החיצוני קוצר באמצעות עיבוד מכני. תמונת ה-micro CT לאחר דחיסה סלקטיבית של החלק הפנימי הגבוה יותר מראה את החלקים הפנימיים והחיצוניים של הפיגום עם נקבוביות שונות; טיטניום נקבובי עם חלקים חיצוניים גבוהים יותר וחלקים פנימיים נמוכים יותר מוביל לחלק חיצוני דחוס יותר לאחר הדחיסה, שבו הנקבוביות של החלק החיצוני הופחתו בעוד שהחלק הפנימי שימר את הנקבוביות הראשוניות לאחר השליטה בתהליך.

ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 72 שעות אם היא מבוצעת כראוי לאחר פיתוח. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הביומטריאלים לבחון את ההיתכנות של ייצור מטא-מתכת בעלת תכונות מכניות משופרות ויכולות לשחרור תרופות לטיפול בפגיעות בעמוד השדרה. ההשלכות של טכניקה זו חוללות על הטיפול בפגיעות בעמוד השדרה, מכיוון שהפיגום המיוצר יכול לשמש כהחלפה מלאכותית של דיסק בשילוב עם מערכת להולכת תרופות.