דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור תרביות עור אורגנוטיפיות מהונדסות גנטית באמצעות דרמיס אנושי מחודש כדי לקבוע את ההשפעה של ביטוי גנים משתנה על צמיחת האפידרמיס והתמיינותו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הדרמטולוגיה, כגון קביעת אילו גנים אחראים לצמיחת אפי, התמיינות והתקדמות למחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שעור אנושי שעבר שינוי גנטי נוצר תוך מספר ימים, מה שמאפשר מחקר של דגימות אנושיות שעשויות להיות רלוונטיות מבחינה קלינית.

הדגמת ההליך תהיה בבדיחות הדעת מהמעבדה שלי. אם מקבלים עור אנושי קפוא, הנח את הרקמה במכסה המנוע של תרבית הרקמה למשך שלוש עד חמש דקות להפשרה. לאחר ההפשרה, העבירו את הרקמה לצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר או לבקבוק של 125 מיליליטר, תלוי בגודל.

לאחר מכן, הוסף ארבעה x פניצילין וסטרפטומיצין ב-XPBS אחד עד שהמיכל מלא ב-75%. מכסים את המיכל ומנערים במרץ במשך חמש דקות. הסר את תמיסת האנטיביוטיקה וחזור על כך.

שלב שלוש פעמים נוספות לאחר הכביסה האחרונה, העבירו את הרקמה למיכל חדש והוסיפו תמיסת אנטיביוטיקה טרייה. דגרו תערובת זו באינקובטור תרבית רקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שבועיים כדי לאפשר הפרדת הדרמיס מהאפידרמיס. לאחר שחלפו שבועיים, השתמש במלקחיים כדי לקלף את האפידרמיס מהדרמיס.

יש להשליך את האפידרמיס על פי פרוטוקול המוסד לטיפול ברקמות אנושיות. מניחים את הדרמיס במיכל של תמיסת אנטיביוטיקה ושוטפים בניעור נמרץ כמו קודם. לאחר השטיפה האחרונה, העבירו את הדרמיס למיכל חדש של תמיסת אנטיביוטיקה ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לשימוש יום לפני העברת תאי עוף החול במדיה שלמה לצלחת של שש בארות בצפיפות של 800,000 תאים לבאר.

ביום הטרנספקציה, מערבבים שישה מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה עם 100 מיקרוליטר dmm. כדי שכל באר תועבר ותדגור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, הוסף את התערובת לצינור המכיל שלושה מיקרוגרם של וקטור רטרו-ויראלי עבור כל באר שתעבור ותדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, הוסף את כל התערובת הזו טיפתית לכל באר של תאי הפניקס ודגר את התאים למשך הלילה יום לאחר הטרנספקציה. הסר את המדיה מתאי עוף החול והוסף שני מיליליטר של מדיה שלמה טרייה באותו יום.

השעו מחדש קרטינוציטים אנושיים ראשוניים במדיום נטול סרום קרטינוציטים עם אנטיביוטיקה וזרעים לשש צלחות דופן בצפיפות של 75,000 תאים לבאר. למחרת, קצרו את המדיה המכילה כעת חלקיקים נגיפיים מתאי הפניקס שעברו טרנספטציה. העבירו את המדיה דרך מסנן 0.45 מיקרון באמצעות מזרק כדי להסיר תאים מזהמים.

הוסף חמישה מיקרוגרם למיליליטר של הקסיה דימתיל ברומיד לנגיף המסונן המכיל מדיה כדי לסייע בתיווך תהליך ההדבקה. לאחר מכן פיפטה שני מיליליטר של הנגיף על הקרטינוציטים שצופו ביום הקודם. לאחר מכן, סובב את ששת לוחות הקיר בצנטריפוגה בטמפרטורה של 200 גרם למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר הסיבוב, הסר והשליך את המדיה המכילה וירוס. שטפו את התאים פעם אחת עם XPBS אחד ולאחר מכן הוסיפו K-C-S-F-M טרי למחרת. להדביק את אותה אצווה של קרטינוציטים בנגיף באמצעות ההליך שהוצג זה עתה.

להכנת קלטות אורגנוטיפיות. השתמש בצריבה כדי להסיר ריבוע של סנטימטר על סנטימטר ממרכז המכסה של צלחת תרבית רקמות בגודל 3.5 סנטימטר. הצמידו יתדות מרובעות לתחתית הקסטה בעזרת לק שקוף והניחו חמש דקות לייבוש הלק.

לבסוף, הפוך את הקסטה והניח את הקסטה בצלחת של שישה סנטימטרים כשקלטת מונחת על היתדות. אחזר את הדרמיס מאחסון של ארבע מעלות צלזיוס והעביר אותו למיכל של גידול קרטינוציטים. בינוני לכביסה.

לאחר חזרה על הכביסה, הניחו את הדרמיס ב-KGM טרי ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים. לאחר הדגירה, השתמש באזמל כדי לחתוך את הדרמיס לחתיכות בגודל 1.5 ס"מ על 1.5 סנטימטר. לאחר מכן מניחים על החור המרובע של האורגנוטיפ מוגדר כשהחלק העליון של הדרמיס פונה כלפי מעלה.

השתמש במלקחיים כדי להפוך את כל הקסטה האורגנוטיפית המכילה את הדרמיס. הוסיפו חמש טיפות של מטריצה חוץ-תאית טרייה לתחתית הדרמיס ונערו קלות כדי להבטיח פיזור אחיד על פני הדרמיס. לאחר שאפשרתם למטריצה החוץ-תאית להתמצק במשך חמש דקות, השתמשו במלקחיים כדי להפוך את הקסטה בחזרה, ולאחר מכן הוסיפו ארבעה מיליליטר של KGM לצלחת של שישה סנטימטרים.

לאחר מכן, לאחר קציר וספירת הקרטינוציטים המהונדסים גנטית, Resus משהה 0.5 עד 1 מיליון תאים ב-90 מיקרוליטר של KGM ומחלק את התאים לדרמיס. דגרו על התרבות המשותפת ב-37 מעלות צלזיוס. לשנות את התקשורת על התרבויות כל יומיים.

ריבוד מלא והתמיינות של האפידרמיס מתרחשים בדרך כלל לאחר היום החמישי. ניתן לקצור רקמות עד 14 יום לאחר הציפוי. תמונה זו מציגה צביעת המטין ואאוזין של אורגנוטיפיק.

תרביות עור מחודשות של עור אנושי מכיל גם את האפידרמיס וגם את הדרמיס. האפידרמיס מרובד במלואו ומובחן בארבע שכבות נפרדות, כולל שכבת הבסיס הלא מובחנת ושלוש השכבות המובחנות כולל השכבה, הספינוזום, הרנום והקורניום. תמונות אימונופלואורסצנטיות אלה מדגימות כי ביטוי יתר של SNA i 2 כפי שמוצג בצד ימין מעכב את התמיינות האפידרמיס בהשוואה לרקמת הבקרה המוצגת בצד שמאל הצביעה עבור ההתמיינות.

חלבון קרטין אחד או K אחד מוצג בירוק וגרעינים מסומנים בכחול. ניתוח RTQ PCR R למדידת רמות mRNA של SNAI שתיים בביקורת LAC Z ו-S NNA I שתיים מעל רקמת ביטוי מדגים ביטוי גדול פי 50 של SNAI שניים ביחס לביקורת. לבסוף, ניתוח RTQ PCR R זה מדגים כי ביטוי יתר של SNA I 2 מביא לאובדן ביטוי של גנים מבניים המושרים על ידי התמיינות כגון TGM אחד ו-SPRR אחד A.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו צ'יפסי, אימונופלואורסצנטי, RN, ae או כתמים מערביים על מנת לקבוע את מנגנוני הצמיחה וההתמיינות האפידורלית. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום רפואת העור לחקור כיצד שינוי תפקוד הגנים משפיע על הומאוסטזיס בעור. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור תרביות עור אנושיות אורגניות מהונדסות גנטית באמצעות קרטינוציטים ופיתוח דרמיס אנושי.