דוגמנות מוגבלת Capsular אוטם בעזרת טכניקת Photothrombotic
2 ביוני 2016
כתב יד זה מתאר טכניקת דוגמנות של אוטם קופסית. כאן השתמשנו בטכניקת photothrombotic שונה עם בעצימות נמוכות של אור לאחר מיפוי היעד מראש ניתוח. באמצעות טכניקה זו, יצרנו מודל אוטם קופסית מתוחם עם לקויות מוטוריות מתמיד.
המטרה הכוללת של טכניקה זו היא ליצור מודל אוטם קפסולה מוגבל עם ליקוי מוטורי מתמשך בטכניקה פוטוטרומבוטית. לפני יצירת אוטם הקפסולה, יש צורך לזהות את אזור הגפיים הקדמיות בקפסולה הפנימית על ידי החדרת וירוס הקשור לאדנו המבטא GFP לאזור הגפיים הקדמיות של קליפת המוח המוטורית. התחל בהנחת חולדה מורדמת לתוך מסגרת סטריאוטקסית.
לאחר מכן גלחו את ראש החולדה ועקרו את הקרקפת באמצעות 70% אלכוהול ותמיסת פובידון ויוד. יש להזריק 2% לידוקאין הידרו כלוריד מתחת לקרקפת באזור החתך המיועד בקרקפת כדי להפחית כאבים תוך ניתוחיים. יש למרוח משחה עיניים למניעת ייבוש העיניים.
והניחו וילון סטרילי מעל החיה. לאחר ביצוע חתך בקו האמצע של שני סנטימטרים בקרקפת, מקם את הזרוע הסטריאוטקסית כדי לזהות את אזור הגפה הקדמית של קליפת המוח המוטורית על פי הקואורדינטות הסטריאוטקסיות. קדחו חור כניסה במצב זה.
העבירו את המחט לחור הקדוח והורידו את המחט מילימטר אחד דרך הדורה ולתוך קליפת המוח המוטורית. השתמש במשאבת מיקרו דיוק גבוהה כדי להזריק לאט מיקרו ליטר אחד של נגיף. השאירו את המחט במקומה למשך 10 דקות נוספות כדי למנוע זרימה חוזרת במעלה דרכי המחט.
לאחר שחלפו 10 דקות, משוך לאט את המחט. לאחר ניקוי אתר הניתוח בהשקיה מלוחה, אבטח את הפצע בתפר ניילון 3-0. לאחר מכן שחררו את החולדה מהמסגרת הסטריאוטקסית והעבירו אותה לתא התאוששות לצורך מעקב.
מתן משכך כאבים לשליטה בכאב לאחר הניתוח. לאחר שבועיים-שלושה, הקריבו את החולדה על פי שיטות מאושרות וחתכו את המוח המוגן בהקפאה. לאחר צביעה עבור GFP, התבונן באקסונים המתמרים AAV-GFP בקפסולה הפנימית עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
השווה את מיקומי האקסונים המומרים כפי שניתן לראות בתמונה הפלואורסצנטית עם אטלס מוח החולדה כדי לקבוע במדויק את הקואורדינטות הסטריאוטקסיות של האקסונים המומרים. כדי להכין את הממשק העצבי האופטי, השתמש תחילה במקדחת חיתוך כדי לחתוך כארבעה סנטימטרים של מחט עמוד שדרה בגודל 27 עם סטילט בפנים. ואז הפשיט 10 סנטימטרים מהמעיל של סיב אופטי.
הכנס את החלק הלא מעטפת של הסיב האופטי לתוך צינור מתכת. ומהדקים את הצינור סביב הסיב. לאחר מכן השתמש בלחיצה כדי להדק את 1/2 התחתון של צינור המתכת פעמיים.
צינור המתכת ממלא את החלל שבין הסיב האופטי לרכזת מחט עמוד השדרה. מרחו אפוקסי הניתן לריפוי בחום על הסיב האופטי. מרחו אפוקסי נוסף על החלל הריק ברכזת.
והכנס את הסיב האופטי למחט עמוד השדרה. רפאו את האפוקסי למשך 20 דקות בחום של 100 מעלות צלזיוס לקיבוע יציב. לאחר הריפוי, חתכו את הסיב האופטי הבולט מתוך מחט עמוד השדרה ולאחר מכן השתמשו ביריעות חיפוי יהלום כדי ללטש את הסיב האופטי בקצה מחט עמוד השדרה.
לבסוף, חבר את חלק מחבר ה-FCPC של כבל התיקון למצמד של מערכת הלייזר הירוקה. לאחר מכן השתמש במד כוח ואנרגיה אופטי דיגיטלי כדי למדוד את עוצמת האור מקצה הסיב האופטי כדי להבטיח פליטה מדויקת של אור. הניחו כרית חום מתחת לגוף החיה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף על 37.5 מעלות צלזיוס חשב הניתוח.
התחל בהרדמה והכנת החולדה לניתוח כמו קודם. לאחר ביצוע חתך בקו האמצע של שני סנטימטרים, כוונן את גובה מהדק האף עד שהברגמה והלמבדה מיושרים באותה רמה. היישור הנכון הוא קריטי כדי למקד נכון את הקפסולה הפנימית.
מקם את הזרוע הסטריאוטקסית כדי לאתר את האתר לפוטוטרומבוזה. ואז קדחו חור של שני מילימטר בשלב זה. לאחר מכן, יש ללטש ולנקות את קצה הסיב האופטי של ה-ONI, ואז לתקן אותו למסגרת הסטריאוטקסית מבלי להתכופף.
בדוק את קצה ה-ONI כדי לוודא שהוא נקי ושלם. מדוד את עוצמת הלייזר מקצה הסיב האופטי לפני הכנסת הממשק האופטי לאתר המטרה של מוח החולדה. כוונן את עוצמת הלייזר ל-3.5 מילי-וואט בקצה הסיב האופטי.
כעת, הורד את ה-ONI לאזור היעד של הקפסולה הפנימית באמצעות הקואורדינטות הדורסובנטרליות שנקבעו בחלק הראשון של הפרוטוקול. לאחר מכן, הזריק שני מיליגרם לק"ג רוז בנגל דרך וריד הזנב ולאחר מכן התחל טיימר ספירה לאחור המוגדר לדקה אחת. לאחר שחלפה הדקה, הפעל את הלייזר הירוק 532 ננומטר למשך 90 שניות כדי ליצור את הניתוק.
לאחר הקרנה, הסר בעדינות את ה-ONI מהמוח. לאחר ניקוי אתר הניתוח, אבטח את הפצע בתפר ניילון 3-0. לאחר מכן הסר את החולדה מהמסגרת הסטריאוטקסית והעביר אותה לתא התאוששות.
תמונה זו מציגה את היקף נגעי האוטם בעוצמות שונות של אור לייזר משני מילי-וואט לחמישה מילי-וואט שבועיים לאחר הנגע הפוטו-טרומבוטי. החצים מציינים את נגע האוטם. עוצמת האור האופטי נחשבת בין שלושה מילי-וואט לארבעה מילי-וואט בסביבה ניסיונית זו.
שתי התמונות הבאות מראות את המראה המיקרוסקופי של אוטם הקפסולה שלושה שבועות לאחר הפוטותרופוזיס. בחלק עטרה זה של מוח העכברוש, ראשי החצים מציינים את נתיב המחט המכיל את הסיב האופטי בתלמוס ועד לקפסולה הפנימית. קטעים מוכתמים סדרתיים אלה מראים את היקף נגע האוטם בקפסולה הפנימית.
החצים מציינים את נגע האוטם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
כתב היד הזה מתאר טכניקת מודלינג של אוטם קפסולרי באמצעות טכניקה פוטוטרומבוטית שונה. גישה זו מאפשרת יצירת מודל אוטם קפסולרי מוגדר היטב אשר מביא לפגיעה מוטורית מתמשכת.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- נוירוביולוגיה
- פגיעה מוטורית
רקע
- אוטמים קפסולריים קשורים לגירעונות מוטוריים.
- טכניקות פוטוטרומבוטיות משמשות לגרימת נזקים מוחיים מקומיים.
- הבנת מנגנוני הפגיעה המוטורית חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.
- מיפוי מטרות הוא חיוני ליצירת מודל מדויק.
מטרת המחקר
- לפתח מודל אמין של אוטם קפסולרי.
- לחקור את ההשפעות של אוטמים קפסולריים על התפקוד המוטורי.
- להשתמש בטכניקה פוטוטרומבוטית שונה לצורך מיקוד מדויק.
שיטות ששימשו
- זיהוי אזור הגפה הקדמית בקפסולה הפנימית באמצעות וירוס משולב-אדנו המבטא GFP.
- הכנת החולדה באמצעות הרדמה והצבת מסגרת סטריאוטקסית.
- עיקור הקרקפת והכנת החתך.
- הזרקת לידוקאין לצמצום הכאב במהלך הניתוח.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של מודל אוטם קפסולרי מוגדר.
- הוכחה של פגיעה מוטורית מתמשכת לאחר האוטם.
- אימות של הטכניקה הפוטוטרומבוטית השונה.
- קביעת שיטה ניתנת לשחזור למחקרים עתידיים.
מסקנות
- הטכניקה הפוטוטרומבוטית השונה יעילה למודלינג של אוטמים קפסולריים.
- ניתן להשתמש במודל זה לחקר פגיעות מוטוריות והתערבויות אפשריות.
- יש צורך במחקר נוסף כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של הגירעונות המוטוריים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This photothrombotic technique enables precise modeling of white matter stroke by selectively targeting the internal capsule while sparing adjacent gray matter. The resulting circumscribed capsular infarct produces persistent motor deficits, providing a disease-relevant system for mechanistic de-risking of neurotherapeutic candidates. The model supports target validation and preclinical assessment of interventions aimed at white matter pathology, addressing a critical gap in stroke research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to white matter stroke pathophysiology.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system for functional target validation in motor circuitry.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking infarct location to persistent motor impairment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable lesion volumes via optical intensity titration for dose-response assessment.
- Operational Value: Delivers highly replicable infarct models with consistent motor deficit readouts.
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening in neuroprotection or neurorepair.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models white matter stroke at behavioral, circuit, and cellular levels for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on lesion specificity and functional outcome correlation.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of infarct extent with motor deficit severity for predictive biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through preclinical efficacy testing, enabling iterative refinement of neurotherapeutic strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of white matter vulnerability and circuit-specific motor pathway disruption.
- Screening: Enables assay standardization through precise lesion control and quantitative motor deficit scoring.
- Analytics: Provides volumetric infarct measurements and behavioral readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via persistent motor deficit phenotyping.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of neuroprotective and rehabilitative compounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through selective white matter infarct modeling.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via laser intensity calibration and stereotaxic targeting.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling early mechanistic de-risking of white matter pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on ability to mitigate persistent motor deficits in a validated model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector delivery, stereotaxic surgery, and optical neural interface fabrication.
- Depends on precision instrumentation including stereotaxic frames, microinjectors, and calibrated laser systems.
- Necessitates cross-team standardization for viral titer consistency, optical fiber preparation, and postoperative monitoring.
- Adaptation considerations include species-specific stereotaxic coordinates and optical properties of gray versus white matter.
- Practical limitations include surgical complexity and the need for postoperative validation via histology and behavior.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Identification of the Forelimb Area in the Internal Capsule Using AAV-GFP
3:09
Construction of the Optical Neural Interface
4:41
Photothrombotic Infarct of the Internal Capsule
6:44
Results: Microscopic Appearance of Capsular Infarct after Photothrombosis
7:38
Conclusion
