Name: הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: למד שיטה להנדסה גנטית יציבה של תאי גזע עצביים במבוגרים בעכבר באמצעות וירוס לנטי. השיטה מאפשרת ניתוח השפעות אוטונומיות ולא אוטונומיות של הנישה העצבית על התנהגות התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים את עזרתו של MJ Palop ואת התמיכה הטכנית של SCSIE של ולנסיה Universidad de. אנו מודים גם אנטוניה Follenzi על הערות מועילות ודיון של כתב היד. אם הוא נתמך על ידי Fundacion Botìn, על ידי Banco Santander דרך חטיבת שלה סנטנדר אוניברסיטאות העולמי, ועל ידי מענקי Generalitat מוולנסיה (פרוגרמה Prometeo, ACOMP, ו ISIC) ו Ministerio דה Economìa y Competitividad (MINECO: SAF2011-23331, CIBERNED ו RETIC Tercel) . עבודה זו נתמכה גם על ידי BFU2010-21823 ו RETIC Tercel המענק MINECO ואת מועצת המחקר האירופית (ERC) 2012-STG (260511- PD-HUMMODEL) אי.סי BM-P. הוא זכה במלגה FPI ספרדי של MINECO.

<ol><li>Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+bridge+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells bridge their niche.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).</li>
<li>Silva-Vargas, V., Crouch, E. E., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+and+their+niche%3A+a+dynamic+duo+during+homeostasis%2C+regeneration%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regeneration, and aging.</a> Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 935-942 (2013).</li>
<li>Ponti, G., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+progression+from+stem+cells+to+new+neurons+in+the+adult+brain+ventricular-subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Lineage progression from stem cells to new neurons in the adult brain ventricular-subventricular zone.</a> Cell Cycle. 12 (11), 1649-1650 (2013).</li>
<li>Menn, B., Garcia-Verdugo, J. M., Yaschine, C., Gonzalez-Perez, O., Rowitch, D., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+oligodendrocytes+in+the+subventricular+zone+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain.</a> J Neurosci. 26 (30), 7907-7918 (2006).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+confer+unique+pinwheel+architecture+to+the+ventricular+surface+in+neurogenic+regions+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).</li>
<li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche%3A+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 289-300 (2008).</li>
<li>Tavazoie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+vascular+niche+for+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A specialized vascular niche for adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subventricular+zone+en-face%3A+wholemount+staining+and+ependymal+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li>
<li>Ramirez-Castillejo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pigment+epithelium-derived+factor+is+a+niche+signal+for+neural+stem+cell+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pigment epithelium-derived factor is a niche signal for neural stem cell renewal.</a> Nat Neurosci. 9 (3), 331-339 (2006).</li>
<li>Falcao, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+from+the+choroid+plexus+to+the+subventricular+zone%3A+go+with+the+flow%21%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The path from the choroid plexus to the subventricular zone: go with the flow!</a> Front Cell Neurosci. 6, (2012).</li>
<li>Delgado, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+NT-3+delivered+by+vasculature+and+CSF+promotes+quiescence+of+subependymal+neural+stem+cells+through+nitric+oxide+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endothelial NT-3 delivered by vasculature and CSF promotes quiescence of subependymal neural stem cells through nitric oxide induction.</a> Neuron. 83 (3), 572-585 (2014).</li>
<li>Kokovay, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM1+is+essential+to+maintain+the+structure+of+the+SVZ+niche+and+acts+as+an+environmental+sensor+to+regulate+SVZ+lineage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression.</a> Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).</li>
<li>Porlan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MT5-MMP+regulates+adult+neural+stem+cell+functional+quiescence+through+the+cleavage+of+N-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MT5-MMP regulates adult neural stem cell functional quiescence through the cleavage of N-cadherin.</a> Nat Cell Biol. 16 (7), 629-638 (2014).</li>
<li>Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lake-front+property%3A+a+unique+germinal+niche+by+the+lateral+ventricles+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Lake-front property: a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain.</a> Neuron. 70 (4), 674-686 (2011).</li>
<li>Porlan, E., Perez-Villalba, A., Delgado, A. C., Ferròn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+neural+stem+cells+in+the+subependymal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of neural stem cells in the subependymal zone.</a> Arch Biochem Biophys. 1-2 (534), 11-19 (2013).</li>
<li>Mamber, C., Verhaagen, J., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+targeting+of+subventricular+zone+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo targeting of subventricular zone astrocytes.</a> Prog Neurobiol. 92 (1), 19-32 (2010).</li>
<li>Ferron, S. R., Andreu-Agullo, C., Mira, H., Sanchez, P., Marques-Torrejon, M. A., Fariñas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+ex%2Fin+vivo+assay+to+detect+effects+of+exogenously+added+factors+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells.</a> Nat Protoc. 2 (4), 849-859 (2007).</li>
<li>Consiglio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+in+vivo+gene+transfer+into+adult+mammalian+neural+stem+cells+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14835-14840 (2004).</li>
<li>Dull, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Third-Generation+Lentivirus+Vector+with+a+Conditional+Packaging+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System.</a> J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
<li>Bomsel, M., Alfsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+viruses+through+the+epithelial+barrier%3A+pathogenic+trickery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Entry of viruses through the epithelial barrier: pathogenic trickery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 57-68 (2003).</li>
<li>Castellani, S., Di Gioia, S., Trotta, T., Maffione, A. B., Conese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+lentiviral+vector-mediated+transduction+on+the+tightness+of+a+polarized+model+of+airway+epithelium+and+effect+of+cationic+polymer+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Impact of lentiviral vector-mediated transduction on the tightness of a polarized model of airway epithelium and effect of cationic polymer polyethylenimine.</a> J Biomed Biotechnol. , (2010).</li>
<li>Bonazzi, M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impenetrable+barriers+or+entry+portals%3F+The+role+of+cell-cell+adhesion+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Impenetrable barriers or entry portals? The role of cell-cell adhesion during infection.</a> J Cell Biol. 195 (3), 349-358 (2011).</li>
<li>Padmashali, R., You, H., Karnik, N., Lei, P., Andreadis, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adherens+junction+formation+inhibits+lentivirus+entry+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adherens junction formation inhibits lentivirus entry and gene transfer.</a> PLoS One. 8 (11), (2013).</li>
<li>Yamashita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone-derived+neuroblasts+migrate+and+differentiate+into+mature+neurons+in+the+post-stroke+adult+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum.</a> J Neurosci. 26 (24), 6627-6636 (2006).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
</ol>

כל המניפולציות נעשו בחדר בטיחות ביולוגית ברמת 2. פרוטוקולים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת ולנסיה והיו כל באמות הוראה אירופה 2010/63 / האיחוד האירופי.

LVS להציע יתרונות חשובים על פני מערכות ויראליות אחרות עבור ההנדסה הגנטית של מבוגר NSCs 16,18. משלוח Stereotaxic של lentiviruses לנישה V-SVZ מייצג שיטה יעילה לתייג ואת עקבות חלוקת B1-NSCs לעתים רחוקות להתגבר על המגבלות של שיטות נפוצות אחרות כגון BrdU, אשר נחלש לאחר חלוקות תא מרובים, או רטרו-וירוס, אשר רק למקד תאים כי הם מתרבים ברגע היישום. LVS, יחד עם adenoviruses, יכול להדביק תאים עצמאי של מעמד הרכיבה שלהם וזה רלוונטי במיוחד עבור תאים שאינם מחזור, כגון תאים ependymal, א...

אזור murine חדרית-subventricular (V-SVZ), בקירות החדר לרוחב מול בסטריאטום, הוא אזור נבטי מאוד פעיל בו תהליך מתמשך של תוצאות בידול שכפול תאים ובתאים בייצור מתמשך של הנורה חוש הריח (OB interneurons) ו oligodendrocytes כפיס המוח 1. הדור לכל החיים של תאים אלו מופיעים להיות נתמכים על ידי נוכחות באזור זה של תאי גזע עצביים (NSCs; המכונים גם תאי B1), המבטאים את חלבון גליה fibrillary חומצי אנטיגן astrocytic (GFAP) גזע סמני תא כגון nestin, ID1 ו Sox2 2. GFAP-לבטא בתאי B1 ליצור מעבר הגברה אבי תאים (TAP) (תאים C), המבטאים שעתוק גורמי Dlx2 (דיסטלי פחות homeobox 2) ו Ascl1 (homolog achaete-schute יונקים 1) ולחלק כמה פעמים במהירות לפני שהם להצמיח כדי neuroblasts הנודדת (תאי א) או oligodendroblasts 3. חדש שנוצר prolifneuroblasts erative להעביר anteriorly, ויצר נחל נודדות המקורי (RMS) אל OB, שם הם להשתלב הפרטניים ושכבות גלומרולרי כמו interneurons מעכבות בדיל. Oligodendroblasts הצעיר נודד לעבור CC, שם הם הופכים תאי NG2 חיובי מפותחים אשר ממשיכים להתחלק באופן מקומי או להתמיין oligodendrocytes myelinating הבוגר 1,4. תאי B1, אשר נובעים ותאי גלייה רדיאלי עובריות, לשמר את המורפולוגיה המוארכת ומקוטבת של קודמיהם ולהציג מערכת יחסים מאוד מיוחדת עם הנישה שלהם. הם משתרעים בין התא אפנדימלי אילו קווים את החדר ואת הרשת של כלי דם להשקות את נישת V-SVZ. תהליך הפסגה הקטן של intercalates תאי B1 בין ependymocytes multiciliated ומסתיים cilium העיקרי יחיד שאינו ניע, ואילו התהליך הבסיסי שלהם משתרע למרחקים ארוכים להתקרב מקלעת כלי הדם מישוריים כי משקה סוף הנישה זו בlamina ASAL של נימי מקלעת 2,5-8. הדרך האמינה ביותר להבחין B1-NSCs מ האסטרוציטים הלא נוירוגנית, שהן גם GFAP +, בגומחה V-SVZ שלם מבוסס על כל הר ההכנות של הקיר לרוחב החדר וניתוח שלהם על ידי מיקרוסקופ confocal 3-D אחרי immunostaining עבור GFAP לתייג את תהליך הפסגה B1-המל&quot;ל דק, β-catenin להתוות קרום התא, ואו γ טובולין כסמן של גופים הבסיס cilial או acetylated α-טובולין לתייג את היקף כל cilium 5,8. תצפיות של כל-mounts אלה מפני שטח חדרית הראו כי תאי B1 ו- ependymal מסודרים &quot;גלגלי רוח&quot; 5, שבה תהליכי פסגת uniciliated של GFAP אחד או כמה + B1 תא מוקפים שושנה של תאי ependymal multiciliated. המורפולוגיה האופיינית של תאי B1 בקורלציה עם ראיה נסיונית indicating כי כלי דם / תאי האנדותל חדרית נוזל השדרתי (CSF) מהווה מקורות מוסדרים של אותות מסיסים הפועלים NSCs 2,6,9-11. על פני החדר, homotypic ואינטראקציות apico-לרוחב heterotypic שמקורם בתאי דם ependymal ו- B1 כוללים צמתים הדוקים adherens צמתים 5,12. יתר על כן, מולקולות הדבקה מעורב מתחמי junctional בין התאים B1 ו- ependymal, כגון N-cadherin ו- V-CAM, הוכחו להסדיר לא רק את המיקום מאורגן של B1 בגומחה V-SVZ, אלא גם קפאון שלהם 12 , 13. Monolayer התא ependymal-B1 מופיע לפעול כמחסום דיפוזיה המאפשר השטף מוסדר מים ומולקולות קטנות מן CSF, אבל הגבלת המעבר בין תאית של חלבונים גדולים 10,11. ראיה נסיונית עולה כי cilium הפסגה בתא B1 ממוצבת באופן ייחודי יכול לשחק תפקיד כחיישן של איתות פוליפפטידים נוכח CSF 2,5-7. תאים Ependymal הם, כשלעצמם, גם מקור של אותות מסיסים קרום הנכנס עם תפקיד בוויסות התנהגות המל&quot;ל 14,15. נוקלאוזידים לעקיבה, כגון bromo-deoxyuridine (BrdU), או רטרווירוסים היה בשימוש נרחב לתייג ובתאים, כולל NSCs, in vivo. עם זאת, שיטות אלה אינן אופטימליים עבור מעקב גורל לטווח ארוך משום שאותות BrdU לדלל באמצעות חלוקות תא חוזרים רטרווירוסים נראה כי הן מיועדות מועדפות הגברה זמן תאים עקב הדרישה שלהם של התפשטות תאים עבור תמרת 16,17. כדי לבחון פיזיולוגית המל&quot;ל in vivo, כולל אינטראקציות עם רכיבי נישה, חשוב להקים שיטה לתייג ואת העקבות לעתים נדירות תאים מתחלקים, כמו B1-NSCs הם שקט בעיקר ותאי ependymal השכנות שלהם מעולם לחלק בתנאים פיסיולוגי 3. כאן, אנו מראים כי וקטורים lentiviral (LVS) לאפשר סימן גן-יעילות גבוההing ושינוי ארוך הטווח של NSCs המבוגר ותאי ependymal הלא חלוקה, בשל בסבירות המרובה ליכולתם transduce וכדי להשתלב בגנום של תאי יעד באופן מחזור עצמאי תא. יתר על כן, אנו מראים כיצד תוואי עזרה כייל משלוח ויראלי transduce תאים ependymal במיוחד, אבל לא התאים B1 ובכך לאפשר ניתוח של תלויי נישה, תופעות ependymal על NSCs.

<table><tbody><tr><td>חלק 1: יצירת LV למשלוח in vivo.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ציוד: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>אופטימה XL-100K</td><td></td></tr><tr><td>רוטור אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>SW-28</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה רוטור</td><td>בקמן קולטר</td><td>SW-55</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אולטרה-צנטריפוגה&nbsp;</td><td>בקמן קולטר</td><td>358126</td> צינורות אולטרה-צנטריפוגה <td>25 מ"מ x 89 מ"מ</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>בקמן קולטר</td><td>326819</td> מתאמי אולטרה-צנטריפוגה <td>13 מ"מ x 51 מ"מ</td></tr><tr><td></td><td>בקמן קולטר</td><td>358156</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>SPL</td><td>PLC-30006</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>SPL</td><td>PLC-30024</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 10 ס"מ</td><td>SPL</td><td>PLC-20101</td> צינורות FACS <td>בסגנון 100 x 20</td></tr><tr><td></td><td>אפורה</td><td>DE400800</td><td>12 מ"מ x 75 מ"מ, 5 מ"ל</td></tr><tr><td>מסנן FACS סטרילי</td><td>BD</td><td>340626</td><td>30 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>מסנן ניטרוצלולוזה</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>0.22 &mu; מ&nbsp;</td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה</td><td>BD</td><td>LSR Fortessa</td><td>לייזר כחול 488 ננומטר</td></tr><tr><td>מסנן Steritop Biofil</td><td></td><td>FPE-204-500&nbsp;</td><td>0.22 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>ריאגנטים:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE פלסמיד&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12251</td><td>אריזת ליבה פלסמיד</td></tr><tr><td>pRSV.REV פלסמיד&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12253</td><td>אריזת ליבה פלסמיד</td></tr><tr><td>pMD2G פלסמיד&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>פלסמיד מעטפה</td></tr><tr><td>pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre פלסמיד&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12252</td><td>פלסמיד וקטור העברה</td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של דולבקו&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>L0101-500</td><td>לתרבית תאי HeLa</td></tr><tr><td>המדיום של Dulbecco השונה של Iscove&nbsp;</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>12440-053</td><td>עבור תרבית תאים 293T</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td></td><td></td><td>Tris-HCl (סיגמא, T5941), 0.1 מ"מ EDTA (סיגמא, E5134), pH 7.6, &nbsp; ללא DNAse/RNAse, 0.2 ומיקרו; m מסנן סטרילי</td></tr><tr><td>2x HBS</td><td></td><td></td><td>0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM נטול מים Na2HPO4 (Sigma, S7907) ב-dH2O (רצוי לא MilliQ). התאם את ה-pH ל-7.0 עם תמיסת NaOH (Calbiochem, 567530).</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td>תמיסת מלאי ב-100x, המשמשת להכנת מדיום תרבית HeLa ו-293T בריכוז סופי של פי 10.</td></tr><tr>תמיסת מלאי <td>גלוטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7513-100</td><td>במשקל 200 מ"מ, המשמשת להכנת מדיום תרבית HeLa ו-293T בריכוז סופי של 6 מ"מ.</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>11360-039</td><td>תמיסת מלאי ב-100 מ"מ, המשמשת להכנת מדיום תרבית HeLa ו-293T בריכוז סופי של 1 מ"מ.</td></tr><tr><td>תוסף GlutaMAX</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>35050-061</td><td>משמש להכנת מדיום תרבית 293T בריכוז סופי של 1%.</td></tr><tr><td>תמיסת מלאי פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td>מכילה 5,000 יחידות/מ"ל פניצילין ו-5 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין. משמש להכנת מדיום תרבית HeLa ו-293T בריכוז סופי של 1%.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>עם פנול אדום, מכיל 2.5 גרם טריפסין חזיר ו-0.2 גרם EDTA 4Na/L HBSS.</td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט&nbsp; (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td>ללא סידן כלורי ומגנזיום כלוריד, 10x, נוזלי, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית תאים. תמיסת מלאי המשמשת להכנת 1x PBS במים בדרגת תרבית תאים.</td></tr><tr><td>פוליברן (הקסדימתרין ברומיד)&nbsp;</td>אבקת <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H9268</td><td>. הכן תמיסת מלאי פי 1,000 ב-8 מ"ג/מ"ל ב-dH<sub2O</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde EM דרגה 16%</td> <td>EM Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>חלק 2: הזרקה סטרוטקסית של LV לתוך ה-SEZ הנכון או לחדר הרוחבי.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ציוד:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vernier מכשיר סטריאוטקסי</td><td>NeuroLab, Leica</td><td>39463001</td><td>http://www.leicabiosystems.com/</td></tr> <tr><td>מתאם עכברים וחולדות יילודים של קנינגהם</td><td>NeuroLab, </td> מחזיק מזרק Leica <td>39462950</td><td></td></tr><tr><td></td><td>KD Scientific</td><td>KDS-311-CE</td><td></td></tr><tr><td>מזרק מד 33</td><td>המילטון</td><td>P/N&nbsp; &nbsp; &nbsp; 84851/00</td><td>#85RN</td></tr><tr><td>מקדחה חשמלית</td><td>כלי מדע עדין</td><td>98096</td><td></td></tr><tr><td>שמיכה תרמית</td><td>Ufesa</td><td>AL5512/01</td><td>230-240 V, 100-110 W, סוג</td></tr><tr><td>C_AL01 מכונת גילוח&nbsp;</td><td>Jata</td><td>MP373N</td><td>דגם: יופי, 3 V, 300 mA, סוג HT-03.</td></tr><tr><td>ריאגנטים:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Esteve</td><td>DOMTOR&nbsp;</td><td>תמיסה מסחרית במינון 1 מ"ג/מ"ל.&nbsp;</td></tr><tr><td>קטמין</td><td>מריאל</td><td>אימלגן 500&nbsp;</td><td>תמיסה מסחרית במינון 50 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr>תערובת <td></td><td></td><td>מדטומידינה/קטמין</td><td>הכינו תערובת עובדת של מדטומידין בריכוז סופי של דילול של 0.2 מ"ג/מ"ל וקטמין בריכוז סופי של 15 מ"ג/מ"ל בתמיסת מלח. השתמש כהרדמה בהזרקת נפח כדי לקבל ריכוז סופי של 0.5-1 מ"ג מדטומידינה לק"ג משקל גוף ו-50-75 מ"ג קטמין לק"ג משקל גוף</td></tr><tr><td>תמיסת Butorphanol</td><td>Pfizer</td><td>Torbugesic</td><td>Stock ב-10 מ"ג/מ"ל. משמש כמשכך כאבים במינון 1 מ"ג/מ"ל בתמיסת מלח.</td></tr><tr>תמיסת <td>Atipamezole</td><td>Esteve</td><td>Antisedan</td><td>Stock במינון 5 מ"ג/מ"ל, המשמשת בריכוז סופי של 0.5 מ"ג/מ"ל בתמיסת מלח ליציאה מההרדמה.</td></tr><tr><td>תמיסת מלח 0.9%</td><td>בראון</td><td>13465412</td><td></td></tr><tr><td>היסטואקריל</td><td>בראון</td><td>1050052</td><td>דבק עור מקומי</td></tr><tr><td>הידרוג'ל</td><td>שקוף H2O</td><td>70-01-5022</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>11 ס"מ x 21 ס"מ</td></tr><tr><td>אקונומיקה/Virkon</td><td>Dupont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עט טוש כירורגי</td><td>Staedler</td><td>313-9</td> חומר סיכה <td>קבוע לעיניים</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td>SICCAFLUID</td><td>0.5 גרם/דוזיס, קרבומר 974P</td></tr><tr><td>פובידון-יוד</td><td>בטדין</td><td>694109.6</td><td>10% פובידון-יוד</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק</td><td>><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>חלק 3: ניתוח היסטולוגי.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית אוטומטית</td><td>Cole-Parmer Inst. Co.</td><td>HV-07524-55</td><td>Masterflex L/S כונן חסכוני במהירות משתנה, 1.6-100 סל"ד,</td></tr><tr><td>ראש משאבה</td> 230 וולט <td>Cole-Parmer Inst. Co.</td><td>HV-07518-00</td><td>Masterflex L/S ראש משאבה עם עומס קל לצינורות מדויקים; בית PSF, רוטור CRS</td></tr><tr><td>צינור סיליקון</td><td>Cole-Parmer Inst. Co.</td><td>HV-96410-16</td><td>פלטינה L/S 16</td></tr><tr><td>סט ורידים לקרקפת</td><td>Vygon V-green</td><td>70246.05T</td><td>25 גרם, אורך צינור 30 ס"מ</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Olympus</td><td>FluoView FV10i</td><td></td></tr><tr><td>פלטה חמה</td><td>Tehtnica</td><td>SHP-10</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנטים:</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאגר פוספט (PB)</td><td></td><td></td><td>0.2 מ' PB: 0.2 מ' Na2HPO4 (Sigma, S7907) ו-0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) ב-dH2O, התאם את ה-pH ל-7.2-7.4</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>Panreac</td><td>141451.1211</td><td>הכן טרי בכל פעם. לחמם dH2O עד 55&ndash; 60 מעלות; C בעזרת פלטה חמה המונחת במכסה אדים ויוצקים אבקת PFA תוך כדי ערבוב לקבלת תמיסה של 8%. התמיסה לבנה מעוננת מכיוון ש-PFA אינו מתמוסס בקלות. הוסף 1N NaOH טיפה אחר טיפה רק עד שהתמיסה מתנקה. התקרר, סנן דרך נייר Whatman והוסף נפח שווה ערך של 0.2 M PB.</td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> מלח <td>0.9% NaCl ב-dH2O</td></tr><tr><td>דבק-על</td><td>LOCTITE</td><td>767547</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>Panreac</td><td>122712.1608</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7126-100</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Millipore</td><td>S30-100</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T9284</td><td>מחטא</td></tr><tr><td>נוגדן ארנב נגד GFP</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-215</td><td>השתמש בדילול של 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 חמור נגד ארנב IgG (H+L) בדיקות</td><td>מולקולריות</td><td>A-21206</td><td>השתמש בדילול 1:750</td></tr><tr><td>6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>צביעה גרעינית פלואורסצנטית. יש להשתמש ב-2 מ"ג/מ"ל ב-ddH2O. יש לשמור בחושך בטמפרטורה של 4&00 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>EM Sciences</td><td>17984-25</td><td>מדיום הרכבה לתכשירים פלואורסצנטיים</td></tr></tbody></table>

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי v-svz העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

יחסית בתאי גזע שקט סומטיים לתמוך התחדשות התאים לכל החיים ברוב רקמות בוגרות. תאי גזע עצביים במוח של יונקים בוגרים מוגבלים שתי גומחות נוירוגנית ספציפיים: אזור subgranular של gyrus משוננת בהיפוקמפוס ואת אזור חדרית-subventricular (V-SVZ; המכונה גם subependymal אזור או SEZ) בקירות של לרוחב חדרים. פיתוח אסטרטגיות העברת גני in vivo עבור אוכלוסיות תאי גזע בוגרים (כלומר אלה של מוח יונקים) וכתוצאה מכך ביטוי לטווח הארוך של transgenes הרצוי תאי הגזע וצאצאים הנגזרות מהם הוא כלי מרכזי במחקר ביו ביוטכנולוגיים הנוכחי. כאן, שיטה ישירה in vivo מוצגת לגבי ההנדסה הגנטית היציבה של תאי V-SVZ עכבר בוגר שמנצלת את זיהום המחזור עצמאי התא על ידי LVS ואת cytoarchitecture מאוד המיוחד של נישת V-SVZ. באופן ספציפי, הפרוטוקול הנוכחי לערבזה הזרקה של LVS ריק (שליטה) או LVS קידוד קלטות ביטוי transgene מסוים לתוך או V-SVZ עצמה, עבור in vivo מיקוד של כל סוגי התאים נישה, או לתוך לומן החדר לרוחב, עבור מיקוד של ependymal תאים בלבד. קלטות ביטוי אז הם משולבים לתוך הגנום של התאים transduced וחלבונים פלורסנט, מקודדים גם על ידי LVS, לאפשר זיהוי של תאי transduced לניתוח תא אוטונומיים ובלתי אוטונומיות, תופעות תלויות נישה בתאים שכותרתו שלהם צֶאֱצָאִים.

LV בתיווך מערכת מסירת גן יכולה לשמש לטווח הארוך תמרת vivo של תאי V-SVZ העכבר הבוגר, המאפשרת המעקב שלהם הנדסה גנטית במהלך התפשטות, הגירה והבחנה. הזיהום ואת הביטוי הוא יעיל ויניב תאים רבים ניתן להבחין בקלות בין תאים שאינם נגועים אחרים על ידי הביטוי של הכתב כלל. יש לנו עד כה דמיינו תאי transduced עם כתבי ניאון GFP, מונעים על ידי אמרגן קינאז phosphoglycerate הביע בכל מקום בגוף, אך כתבים אחרים או תגי חלבון יכולים לשמש גם. אנו משתמשים באופן שגרתי נוגדנים GFP במקום להסת...

כאן אנו מתארים הליך המבוסס על שימוש בחלקיקים לנטי-ויראלים לשינוי גנטי ארוך טווח של תאי גזע עצביים ו/או תאי אפנדימליים סמוכים להם בנישה הנוירוגנית הגחנית-תת-חדרית הבוגרת המאפשרת ניתוח נפרד של השפעות אוטונומיות ולא אוטונומיות של תאים, תלויות נישה על תאי גזע עצביים.

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להחדיר נפחים נמוכים של חלקיקי לנטי-וירוס בתיתר גבוה, הנושאים מבני DNA ספציפיים, לאזור הוונטריקולרי-סוב-וונטריקולרי במוחו של עכבר בוגר כדי להדביק את כל סוגי התאים שבו, או לחדר הצדי כדי להשפיע על תאי אפנדימה בלבד. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בנוגע לאינטראקציות שיש לתאי גזע עצביים בנישה הוונטריקולרית-סוב-וונטריקולרית של העכבר הבוגר עם תאי האפנדימה השכנים להם. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שוקטורים לנטי-וירוס משתלבים בגנום של תאי המטרה באופן שאינו תלוי במחזור התא, מה שמאפשר ביטוי לטווח ארוך בתאים המתחלקים לעיתים רחוקות. תלמידת הדוקטורט Beatriz Mart תסייע לי להדגים את ההליך.

stable-efficient-genetic-modification-cells-adult-mouse-v-svz-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

שליטה על ההתפשטות של תאי גזע הסומטיים היא גורם מרכזי פוגעות המחקר והשימוש בטיפול שלהם. כאן אנו מתארים מערכת באופן זמני להרחבת שליטה עצבית גזע תאים במהלך ההתפתחות ובגרות, אשר ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח העכבר.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

מקור: Porlan, E., et al. שינוי גנטי יציב ויעיל של תאים בעכבר הבוגר V-SVZ לניתוח השפעות אוטונומיות ולא אוטונומיות של תאי גזע עצביים. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים שינוי גנטי יציב של תאי גזע עצביים (NSCs) באזור הגחון-תת-חדרי (V-SVZ) באמצעות הזרקה סטריאוטקסית של גן טיפולי נושא וירוס במודל עכבר. הנגיף חודר לתאי גזע, עובר שעתוק הפוך, משתלב בגנום ומאפשר שינוי גנטי יציב ויעיל ליישומים נוירותרפיים.

הזרקה סטריאוטקסית של וירוסים לשינוי גנטי יציב במודל עכבר

וקטורים ויראליים לאפשר למניפולצית גן ממוקדת. אנחנו מדגימים את שיטה לביטוי גנים מותנים או אבלציה בחוט שדרת העכבר, באמצעות הזרקת stereotaxic של וקטור ויראלי לקרן האחורית, אתר בולט של קשר הסינפטי בין afferents החושיים הראשוניים ועצב של מערכת העצבים המרכזית.

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לדור בו זמני של תרביות תאים עצביות מבשר, כמו גם monolayers או neurospheres חסיד, מאזור subventricular וgyrus משוננת של עכברים בוגרים בודדים.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

אנו מדווחים על שיטה מבוססת מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) לבידוד תאי גזע עצביים (NSCs) וצאצאיהם מהאזור התת-חדרי (SVZ) של מוח העכבר הבוגר. מיושם על עכברים טרנסגניים של אינדיקטור מחזור תא פלואורסצנטי (FUCCI), הוא מאפשר לחקור את התקדמות מחזור התא על ידי הדמיה חיה.

מיון תא של תאי גזע ועצביים ממבוגרי עכבר Subventricular האזור וחי-הדמיה של Dynamics תא המחזור שלהם

אנו מתארים פרוטוקול של ניתוח stereotaxic עם מכשיר ביתי הראש-קבוע עבור ריאגנטים microinjecting לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה גנטית ב תאים עצביים של אזורים ספציפיים של מוח העכבר neonatal.

ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal

כאן אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח מודלים של עכברים מהונדסים גנטית באמצעות תאי גזע עובריים, במיוחד עבור דנ"א גדול (KI). פרוטוקול זה מכוונן באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9, וכתוצאה מכך יעילות KI משופרת באופן משמעותי בהשוואה לשיטת מיקוד הדנ"א הליניארי ההומולוגית הקונבנציונלית בתיווך רקומבינציה.

מיקוד גנים יעיל ביותר בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי גזע עובריים לפיתוח מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית

שיטה לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים ממוחות של חולדות חיות מוצגת כאן בפירוט ניסיוני. הוא מאפשר אוספים מרובים של תאים אלה מאותם בעלי חיים מבלי לסכן את רווחתם.

שיטת "חליבת המוח" לבידוד תאי גזע עצביים ותאי אב אוליגודנדרוציטים מחולדות חיות

במאמר זה אנו מתארים מערכת נוקלאופקציה שנועדה לשפר את יעילות העברת הגנים בתאי גזע עצביים מורחבים (NSCs) שבודדו מהאזור התת-חדרי של המורין הבוגר. הממצאים מראים כי שיטה זו משפרת באופן משמעותי את ההפרעה הגנטית בתאי גזע גזעיים, עולה על היעילות של פרוטוקולי טרנספקציה מסורתיים ומשפרת את שיעור הישרדות התאים.

בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להנדסת תאי גזע שתוכנתו מחדש כימית כדי להשיג אפנון עצבי מדויק על ידי התמיינות תאים אלה לתאים קודמים דופמינרגיים, השתלתם במודלים של עכברים של מחלת פרקינסון, והערכת תוצאות התנהגותיות ואלקטרופיזיולוגיות כדי לאשר את האינטגרציה המוצלחת והיעילות התפקודית של התאים המושתלים.

ויסות כימוגנטי בתאי קודמן שמקורם בתאי גזע מתוכנתים מחדש בטיפול במחלות נוירודגנרטיביות

למד שיטה להנדסה גנטית יציבה של תאי גזע עצביים במבוגרים בעכבר באמצעות וירוס לנטי. השיטה מאפשרת ניתוח השפעות אוטונומיות ולא אוטונומיות של הנישה העצבית על התנהגות התאים.

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

גלה סרטונים נוספים