גאומגנטית שדה (GMF) וצמח אבולוציה: לחקור את ההשפעות של ביטול GMF ב

המטרה הכללית של הליך זה היא להביא להיפוך של השדה הגאומגנטי, או ה-GMF, באמצעות סלילי הולץ (Holtz coils) הנשלטים על ידי ספק כוח. בסופו של דבר, מוצג כי היפוך ה-GMF משפיע על המורפולוגיה ועל הביטוי הגנטי של צמחים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האבולוציה של צמחים, כגון האם להיפוך השדה המגנטי של כדור הארץ היה תפקיד באבולוציה ובהסתגלות של צמחים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לבחון השפעות ביולוגיות פוטנציאליות של שדות מגנטיים חלשים באורגניזם מודל פשוט שניתן לגדל עם חזרות רבות, כולן תחת תנאים מבוקרים במדויק. את הפרוצדורה זו ידגימו אלברטו בוקו וסטודנט בהנחייתו מהמעבדה שלי, וכן קיארה aa, סטודנטית לדוקטורט במעבדתי, ו-CIA ברטאה, פרופסור חבר בקבוצה שלי.

כדי להתחיל, הפעילו את שלושת ספקי הכוח של ה-DC המחוברים לשלושה זוגות של סלילי הלמולץ (Helmholtz Coils), והפעילו את המגנטומטר התלת-צירי שהגשושית שלו מוכנסת לסלילים התלת-ציריים. הפעילו את המחשב והריצו את תוכנת המגנטומטר המאפשרת איסוף נתונים מהמגנטומטר התלת-צירי. ספקי הכוח מחוברים למחשב גם באמצעות חיבור A-G-P-I-B לצורך בקרה.

כווננו את מתחי ספקי הכוח כדי להפיק את השדה המגנטי הרצוי עם וקטור שדות מגנטיים הפוך, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הניחו זרעים של Arabidopsis Aliana ecotype Columbia, zero בתוך מבחנה של 1.5 milliliter, שעברו סטריליזציה באמצעות טיפול בתמיסת סידן היפוכ לוריט למשך 10 עד 12 דקות בטמפרטורה של 25 עד 28 °C תוך ניעור רציף. לאחר מכן, שטפו את הזרעים פעמיים עם 80% ethanol, ולאחר מכן בשטיפה עם 100% ethanol.

ולבסוף, שטיפה במים מזוקקים סטריליים. הכינו ליטר אחד של מצע Murrah Shiga ו-SCOG מושנה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט לפני ההקשחה. צקו 80 מיליליטר של מצע לכל צלחת פטרי מרובעת, כך שיהיו 30 זרעים סטריליים בכל צלחת.

לאחר מכן, אטמו את הצלחות באמצעות סרט שעווה. בצעו ורנליזציה (vernalization) לצלחות במצב אופקי, בחשכה ובטמפרטורה של 4°C למשך יומיים, כדי להגביר ולסנכרן את הנביטה. הכינו נורות נתרן על ידי כיסוי הפס אור (spotlight) בסרט ג'לטין כחול, כדי להפחית את הרכיב האדום של הנורות לאחר תהליך הוורנליזציה.

הכינו את צלחות הפטרי לחשיפה ל-GMF רגיל או הפוך. חשפו את הזרעים בסביבה עם בקרת אקלים בטמפרטורה של 22 degrees Celsius בעמדה אנכית. בצעו ניסויים מקבילים הן מחוץ לסלילים התלת-ציריים והן בתוך הסלילים התלת-ציריים.

תחת לוח זמנים של מחזור תאורה הכולל שמונה שעות חשיכה ו-16 שעות אור. לאחר החשיפה, צלם את צלחות הפטרי כדי לחשב את אורך השורש ושטחי העלה. ראשית, מדוד את צלע צלחת הפטרי.

לאחר מכן, פתחו את תמונת פטרי בתוכנת Image J והשתמשו באפשרות הקו הישר (straight line) כדי לסמן קו החוצה בדיוק את דופן הצלחת. בתפריט הניתוח (analyze), בחרו ב-"set scale" והזינו את המרחק בפועל בתיבת המרחק הידוע (known distance). לאחר מכן, הזינו את יחידת האורך.

ולבסוף, לחצו על האפשרות הגלובלית כדי להפוך את ההגדרות לזמינות עבור כל המדידות של אורך השורש. עקבו בקפידה אחר צורת השורש באמצעות כלי השרטוט החופשי (freehand tool). מדדו את האורך באמצעות אפשרות המדידה בתפריט הניתוח (analyze menu).

המשיכו למדוד את כל השורשים בתמונה ושמרו את הקובץ לצורך ניתוח סטטיסטי בהמשך. למדידת שטח העלה, השתמשו באפשרות adjust בתפריט התמונות, ולאחר מכן ב-color threshold, בחרו את העלה הבודד, ובתפריט analyze בחרו ב-analyze particles; שמרו את המדידות האינדיבידואליות לצורך ניתוח סטטיסטי. אספו 30 נבטים ו-30 שורשים בנפרד, והקפיאו אותם מיד בחנקן נוזלי.

לאחר מכן, יש לטחון בחנקן נוזלי באמצעות מכתש ועלי, לפני בידוד RNA כולל כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. יש לבצע את כל הניסויים במערכת real-time באמצעות cyber green one עם ROX כסטנדרט טעינה פנימי, ולבצע את התגובה עם תערובת של 25 microliter. באמצעות הפריימרים המפורטים בפרוטוקול הטקסט, יש לכלול בקרות ללא שעתוק הפוך (non reverse transcription controls) כדי לנטר זיהום של DNA גנומי, וכן בקרות ללא תבנית (non template controls). יש לקרוא את הפלואורסצנציה לאחר כל שלב של דנטורציה והארכה.

שתי זכוכיות המגדלת מייצגות את הנתונים שנאספו, כולל עקומות התכופפות (kneeling) ודיסוציאציה. עברו למסך הניתוח וההגדרה וודאו שערכת הנתונים שנאספה במהלך מקטע הדיסוציאציה של הניסוי נבחרה. לצורך ניתוח של כל ההרצות, בצעו ניתוח עקומת התכה מ-55 עד 95 °C על ידי הכללת מקטע הדיסוציאציה בפרופיל התרמי.

השתמשו במסך עקומת הדיסוציאציה (dissociation curve) הנגיש דרך לשונית התוצאות כדי לצפות בפרופיל הדיסוציאציה. נתחו את כל תרשימי ההגברה באמצעות התוכנה של מכשיר ה-real-time PCR.

כדי לקבל ערכי CT, יש לכייל ולנרמל את רמות ה-RNA היחסיות ביחס לרמתה של גן הבית (housekeeping gene) המתאים ביותר. היכנסו למסך תרשימי ההגברה דרך לשונית התוצאות. בחרו את שלב העלייה (ramp) או שלב המישור (plateau) עבורם יש לנתח את הנתונים, באמצעות מסך הניתוח, הבחירה וההגדרה.

לאחר מכן, בחרו ב-baseline corrected normalized fluorescence מתפריט ה-fluorescence בלוח הבקרה. היכנסו למסך ערכי דגימות הפלטה (plate sample value) דרך לשונית התוצאות (results), כדי להציג את ערכי ה-CT עבור הבארים שנדגמו.

השתמשו בארבעה גנים של ייחוס שונים כדי לנרמל את תוצאות ה-real-time PCR. בחרו את הגן בעל הדירוג הגבוה ביותר באמצעות תוכנת הניתוח והשתמשו בגן היציב ביותר לצורך הנרמול. ארגנו בקצרה את נתוני הקלט בגיליון Excel, כאשר העמודה הראשונה תכיל את שמות הגנים והשורה הראשונה תכיל את שמות הדגימות.

לאחר מכן, בחרו את תוכנת הניתוח מסרגל התפריטים. השתמשו בתיבת הדו-שיח כדי לבחור את נתוני הקלט. לאחר מכן, סמנו את השדות sample names, gene names, ו-simple output only.

לחצו על כפתור ה-go כדי לבצע את הניתוח, ובחרו בגן המדורג במקום הראשון כגן המועמד בעל הביטוי היציב ביותר. לאחר 10 ימים של חשיפה, צמחי הביקורת מראים אורך שורש גדול משמעותית ועליעלים רחבים יותר בהשוואה לצמחים שנחשפו לתנאי GMF הפוכים לאחר 10 ימי חשיפה. ההשפעה של היפוך ה-GMF הייתה שינוי דרסטי בביטוי הגנים של כל הגנים שנבדקו, כולל crucifer in three copper transport protein one ו-redox responsive transcription factor one; קווים מציינים שגיאה תקנית וכוכביות מציינות הבדלים מובהקים בין צמחים שנחשפו לתנאי GMF הפוכים לתנאי GMF רגילים.

השפעת היפוך ה-GMF לא גרמה לשינויים משמעותיים בביטוי הגנים בנבט. עם זאת, נצפתה דה-רגולציה (downregulation) קיצונית בביטוי הגנים בשורשים של צמחים שגודלו. תחת תנאי GMF הפוך, גנים אלו כוללים את thal, aate peroxidase, aate peroxidase, iron superoxide dismutase אחד, N-A-D-P-H אחד, respiratory burst oxidase, protein ו-catalyst three.

ברגע שהטכניקה תהפוך לשגורה, ניתן לבצעה במשך דקות בודדות או לאורך ימים, בהתאם לדרישות הניסוי, בתנאי שהיא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפוך או לשנות את השדה הגאומגנטי, וכיצד לבצע מחקרים מורפולוגיים וגנטיים על הצמחים שנחשפו אליו. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להרחיק כל מקור לשדה מגנטי מהאזור המוקף בסלילי הקסדה.

חשוב שסלילי הקסדה והגנרטורים שלהם לא ייצרו חום או רעידות. החוקר צריך להיות עיוור למצב החשיפה לשדה המגנטי עד להשלמת רישום הנתונים הסופיים. טכניקה זו אפשרה לחוקרים בתחום הקליטה המגנטית לבחון את השפעת השדות המגנטיים על אבולוציית צמחים, התנהגות בעלי חיים, ניווט ועל שורות תאים אנושיות.

בעתיד, אנו מקווים לבצע מחקרים דומים בתנאי מיקרו-כבידה כדי להעריך כיצד שינוי בשדה המגנטי ישפיע בתנאי חלל על צמיחת צמחים. עבודה עם מערכות המייצרות שדות מגנטיים חלשים אינה נחשבת למסוכנת. עם זאת, יש לנקוט באמצעי הזהירות הרגילים ויש להיוועץ בחשמלאי מוסמך לפני עבודה עם ציוד כגון ספקי הכוח עבור זוגות הסלילים של ה-helmholtz.