גאומגנטית שדה (GMF) וצמח אבולוציה: לחקור את ההשפעות של ביטול GMF ב Thaliana ארבידופסיס ביטוי פיתוח וג'ין

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר היפוך של השדה הגיאומגנטי או GMF עם סלילי הגה הולטס הנשלטים על ידי ספק כוח. בסופו של דבר, הוכח כי היפוך GMF משפיע על המורפולוגיה וביטוי הגנים של צמחים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום אבולוציה של צמחים, כגון האם היפוך השדה המגנטי של כדור הארץ שיחק תפקיד באבולוציה ובהסתגלות של צמחים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לבדוק השפעות ביולוגיות פוטנציאליות של שדות מגנטיים חלשים באורגניזם מודל פשוט שניתן לגדל עם שכפולים רבים, הכל בתנאים מבוקרים במדויק. מדגימים את ההליך הזה אלברטו בוקו וסטודנט מודרך מהמעבדה שלי, וגם קיארה aa. היא דוקטורנטית במעבדה שלי וברטאה מה-CIA, שהיא פרופסור חבר בקבוצה שלי.

כדי להתחיל, הפעל את שלושת ספקי הכוח DC המחוברים לשלושת הזוגות של זוגות הסליל של הלם הולט, והפעל את המגנטומטר התלת-צירי שהגשושית שלו מוכנסת לסלילים התלת-ציריים. הפעל את המחשב והפעל את תוכנת המגנטומטר המאפשרת לאסוף נתונים מהמגנטומטר התלת-צירי. ספקי הכוח מחוברים גם למחשב באמצעות חיבור A-G-P-I-B לשליטה.

הגדר את המתחים של ספקי הכוח כדי ליצור את השדה המגנטי הרצוי עם וקטור שדות מגנטיים הפוך כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מניחים את הזרעים של אקוטיפ Arabidopsis Aliana קולומביה, אפס למשטח צינור של 1.5 מיליליטר, מעוקר על ידי טיפול בתמיסת סידן היפוכלוריט למשך 10 עד 12 דקות בטמפרטורה של 25 עד 28 מעלות צלזיוס עם ניעור מתמשך. לאחר מכן שוטפים את הזרעים פעמיים עם 80% אתנול, ולאחר מכן שטיפה עם מאה אחוז אתנול.

ולבסוף, שטיפה במים מזוקקים סטריליים. הכן ליטר אחד של מדיום שונה של Murrah Shiga ו-SCOG כמתואר בפרוטוקול הטקסט לפני ההתמצקות. שופכים 80 מיליליטר בינוני לכל צלחת פטרי מרובעת, כך 30 זרעים סטריליים על צלחת.

ואז אוטמים את הצלחות בסרט שעווה. ורן הצמיד את הלוחות אופקית בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך יומיים כדי להגביר ולסנכרן את הנביטה. הכן מנורות אדי נתרן על ידי כיסוי הזרקור בסרט ג'לטין כחול כדי להפחית את המרכיב האדום של המנורות לאחר ורנליזציה.

התכוננו לחשוף את לוחות הפטרי לרגיל או הפוך. GMF. חשוף את הזרעים בסביבה מבוקרת אקלים בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס במצב אנכי. בניסויים מקבילים הן מחוץ לסלילים התלת-ציריים והן בתוך הסלילים התלת-ציריים.

תחת לוח זמנים של תקופת צילום של שמונה שעות, חושך ו-16 שעות אור. לאחר החשיפה, צלמו את צלחות הפטרי כדי לחשב את אורך השורש ושטחי העלים. ראשית, מדוד את הצד של צלחת הפטרי.

לאחר מכן פתח את התמונה של לוח פטרי בתוכנת תמונה J והשתמש באפשרות הקו הישר כדי לצייר קו שחוצה בדיוק את צד הצלחת. בתפריט הניתוח, בחר קבע קנה מידה והוסף את המרחק בפועל לתיבה מרחק ידוע. ואז הכנס את יחידת האורך.

ולבסוף לחץ על האפשרות הגלובלית כדי להפוך את ההגדרות לזמינות עבור כל המדידות עבור אורך השורש. עקוב בזהירות אחר צורת השורש באמצעות הכלי ביד חופשית. מדוד את האורך באמצעות אפשרות המדידה בתפריט הניתוח.

המשך למדוד את כל השורשים בתמונה ושמור את הקובץ להמשך ניתוח סטטיסטי. עבור אזור העלה מתפריט התמונה, השתמש באפשרות ההתאמה, ואחריה סף הצבע, בחר את העלה הבודד, ובתפריט הניתוח, בחר נתח חלקיקים, שמור את המדידות הבודדות לניתוח סטטיסטי. אוספים 30 יורה ו -30 שורשים בנפרד, ומקפיאים אותם מיד בחנקן נוזלי.

לאחר מכן טוחנים חנקן נוזלי עם מרגמה ועלי לפני בידוד ה-RNA הכולל כמתואר בפרוטוקול הטקסט, בצע את כל הניסויים במערכת בזמן אמת באמצעות מערכת ירוקה סייבר עם ROX כתקן טעינה פנימי, בצע את התגובה בתערובת של 25 מיקרוליטר. השימוש בפריימרים המפורטים בפרוטוקול הטקסט כולל בקרות שאינן שעתוק הפוך לניטור זיהום DNA גנומי, כמו גם בקרות שאינן תבניות. קרא פלואורסצנטי לאחר כל שלב כריעה והארכה.

שתי המשקפיים המגדלת מייצגות את הנתונים שנאספו, כולל עקומות כריעה ודיסוציאציה. נווט למסך הניתוח וההגדרה וודא שמערך הנתונים שנאסף במהלך קטע הדיסוציאציה של הניסוי נבחר. לניתוח עבור כל הריצות, בצע ניתוח עקומת התכה מ-55 עד 95 מעלות צלזיוס על ידי הכללת קטע הדיסוציאציה בפרופיל התרמי.

השתמש בגישה למסך עקומת הניתוק דרך כרטיסיית התוצאות. כדי להציג את פרופיל הניתוק. נתח את כל עלילות ההגברה עם תוכנת מכשירי ה-PCR בזמן אמת.

כדי להשיג ערכי CT, כיול ונרמל את רמות ה-RNA היחסיות עם רמת הגנים הטובים ביותר לניהול משק הבית. גש למסך עלילות ההגברה דרך לשונית התוצאות. בחר את הרמפה או הרמה שעבורה יש לנתח נתונים באמצעות מסך הניתוח, הבחירה וההגדרה.

ולאחר מכן בחר את הקרינה המנורמלת המתוקנת הבסיסית מתפריט הקרינה בלוח הפקודות. גש למסך ערך דגימת הצלחת דרך כרטיסיית התוצאות. כדי להציג ערכי CT עבור הבארות שנדגמו.

השתמש בארבעה גני ייחוס שונים כדי לנרמל את תוצאות ה-PCR בזמן אמת. בחר את הגן המדורג במקום הראשון באמצעות תוכנת הניתוח והשתמש בגן היציב ביותר לנורמליזציה. ארגן בקצרה את נתוני הקלט בגיליון Excel כאשר העמודה הראשונה מכילה את שמות הגנים והשורה הראשונה המכילה את שמות הדגימה.

לאחר מכן בחר את תוכנת הניתוח משורת התפריטים. השתמש בתיבת הדו-שיח כדי לבחור את נתוני הקלט. לאחר מכן, בדוק את שמות הדגימה של השדות, שמות הגנים והפלט הפשוט בלבד.

לחץ על כפתור המעבר כדי לבצע את הניתוח, בחר את הגן המדורג במקום הראשון כגן המועמד המתבטא בצורה היציבה ביותר. לאחר 10 ימי חשיפה, הצמחים מראים אורך שורש גדול יותר באופן משמעותי ועלים מורחבים יותר בהשוואה לצמחים שנחשפו לתנאי GMF הפוכים לאחר 10 ימי חשיפה. ההשפעה של היפוך ה-GMF הייתה שינוי דרסטי בביטוי הגנים של כל הגנים שנבדקו, כולל מצליב: בשלושה חלבון הובלת נחושת אחד וגורם שעתוק מגיב לחמצון חיזור פס אחד מצביע על כוכבית שגיאה סטנדרטית מצביעה על הבדלים משמעותיים בין צמחים שנחשפו לתנאי GMF הפוכים ונורמליים.

השפעת ההיפוך של ה-GMF לא גרמה לשינויים משמעותיים בביטוי הגנים של היורה. עם זאת, נצפתה ירידה דרסטית בביטוי הגנים של השורש של צמחים שגדלו. בתנאי GMF הפוכים, גנים אלה כוללים thal, aate peroxidase, aate peroxidase, ברזל סופראוקסיד דיסמוטאז אחד, N-A-D-P-H אחד, אוקסידאז מתפרץ נשימתי, חלבון וזרז שלוש.

לאחר המאסטר, ניתן לבצע טכניקה זו מדקות ועד היום, על פי הניסוי הנדרש אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד להפוך או לשנות את השדה הגיאומגנטי ולבצע מחקרים מורפולוגיים וגנטיים על צמחים חשופים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להסיר את כל מקורות השדה המגנטי מהאזור המוקף בסלילי קסדה.

חשוב שסלילי הקסדה והגנרטורים שלהם לא ייצרו חום או רעידות. יש לסנוור את החוקר ממצב החשיפה לשדה המגנטי עד לרישום הנתונים הסופיים. טכניקה זו אפשרה לחוקרים בקליטת מגנטו לחקור את ההשפעה של שדות מגנטיים על אבולוציה של צמחים, התנהגות וניווט של בעלי חיים, ועל קווי תאים אנושיים.

בעתיד, אנו מקווים לבצע מחקרים דומים במיקרו-כבידה על מנת להעריך כיצד השינוי בשדה המגנטי ישפיע בתנאי החלל על גדילת הצמחים. עבודה עם מערכות המייצרות שדות מגנטיים חלשים אינה נחשבת למסוכנת. עם זאת, עליך לנקוט באמצעי הזהירות הרגילים ועליך לפנות לייעוץ של חשמלאי מוסמך לפני שאתה עובד עם ציוד כגון ספקי הכוח להגה מחזיק זוגות סלילים.