Name: הדמיה פליטת אור של דגם עם מערכת חיסון בבעלי חיים לגליובלסטומה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: למדו הדמיית ביולומינסנציה בתאי גליומה GL261 בעכברים לחקר גידולים תוך-גולגלתיים. שיטה זו מאפשרת מעקב לא פולשני אחר צמיחת הגידול ותגובה לטיפולים אימונותרפיים במודלים אימונוקומפטנטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לראג'ואנט קאור על הסיוע הטכני. ברצוננו להודות למקסוול טום על הסיוע בהכנת וירוס הלנטי. עבודה זו נתמכה על ידי הקתדרה ע"ש רזא וג'ורג'יאנה חטיב בניתוחי גידול בבסיס הגולגולת באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו, ופרופסור ויו"ר מייקל ג'יי מרצ'יז באוניברסיטת נורת'ווסטרן.

<ol><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosurgical+management+and+prognosis+of+patients+with+glioblastoma+that+progresses+during+bevacizumab+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Neurosurgical management and prognosis of patients with glioblastoma that progresses during bevacizumab treatment.</a> Neurosurgery. 70 (2), 361-370 (2012).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Grossman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+patients+with+newly+diagnosed+glioblastoma+treated+with+radiation+and+temozolomide+in+research+studies+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States.</a> Clin Cancer Res. 16 (8), 2443-2449 (2010).</li>
<li>Sughrue, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+considerations+of+modern+animal+models+of+malignant+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Immunological considerations of modern animal models of malignant primary brain tumors.</a> J Transl Med. 7 (84), (2009).</li>
<li>Ausman, J. I., Shapiro, W. R., Rall, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+chemotherapy+of+experimental+brain+tumors%3A+development+of+an+experimental+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model.</a> Cancer Res. 30 (9), 2394-2400 (1970).</li>
<li>Zagzag, D., Zhong, H., Scalzitti, J. M., Laughner, E., Simons, J. W., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+hypoxia-inducible+factor+1alpha+in+brain+tumors%3A+association+with+angiogenesis%2C+invasion%2C+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in brain tumors: association with angiogenesis, invasion, and progression.</a> Cancer. 88 (11), 2606-2618 (2000).</li>
<li>Cha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic%2C+contrast-enhanced+perfusion+MRI+in+mouse+gliomas%3A+correlation+with+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Dynamic, contrast-enhanced perfusion MRI in mouse gliomas: correlation with histopathology.</a> Magn Reson Med. 49 (5), 848-855 (2003).</li>
<li>Ksendzovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+immunosuppressive+mechanisms+in+a+mouse+glioma+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Investigation of immunosuppressive mechanisms in a mouse glioma model.</a> J Neurooncol. 93 (1), 107-114 (2009).</li>
<li>Biollaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+anti-tumor+immunity%3A+differences+in+DC+function%2C+TGF-beta+production+and+numbers+of+intratumoral+Foxp3%2B+Treg%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Site-specific anti-tumor immunity: differences in DC function, TGF-beta production and numbers of intratumoral Foxp3+ Treg.</a> Eur J Immunol. 39 (5), 1323-1333 (2009).</li>
<li>El Andaloussi, A., Han, Y., Lesniak, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolongation+of+survival+following+depletion+of+CD4+%2B+CD25%2B+regulatory+T+cells+in+mice+with+experimental+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Prolongation of survival following depletion of CD4 + CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors.</a> J Neurosurg. 105 (3), 430-437 (2006).</li>
<li>Dinca, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Monitoring+of+Intracranial+Glioblastoma+Xenograft+Response+to+Primary+and+Salvage+Temozolomide+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy.</a> J. Neurosurg. 107 (3), 610-616 (2007).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-parametric+estimation+from+incomplete+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Stat.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Non-parametric estimation from incomplete observations.</a> J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).</li>
<li>Peto, R., Peto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptotically+efficient+rank+invariant+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Stat.+Soc.+Ser.+A.+Stat.+Soc%22%5BJournal%5D)">Asymptotically efficient rank invariant procedures.</a> J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185207(1972).</li>
<li>Armitage, P., Berry, G., Matthews, J. N. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArmitage%2C+P+%22Statistical+Methods+in+Medical+Research%22">Statistical Methods in Medical Research</a>. , 4th ed, Blackwell Science. Oxford. (2001).</li>
<li>Newcomb, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+ionizing+radiation+and+peripheral+vaccination+produces+long-term+survival+of+mice+bearing+established+invasive+GL261+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The combination of ionizing radiation and peripheral vaccination produces long-term survival of mice bearing established invasive GL261 gliomas.</a> Clin Cancer Res. 12 (15), 4730-4737 (2006).</li>
<li>Pellegatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurospheres+enriched+in+cancer+stem-like+cells+are+highly+effective+in+eliciting+a+dendritic+cell-mediated+immune+response+against+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas.</a> Cancer Res. 66 (21), 10247-10252 (2006).</li>
<li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+luciferase+expression+does+not+alter+immunologic+or+in+vivo+growth+properties+of+GL261+murine+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Stable luciferase expression does not alter immunologic or in vivo growth properties of GL261 murine glioma cells.</a> J Transl Med. 12, 345-34 (2014).</li>
<li>Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+implantation+with+subsequent+3D+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+murine+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas.</a> J Vis Exp. (57), e3403(2011).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+intracranial+brain+tumor+xenografts+with+subsequent+analysis+of+tumor+growth+and+response+to+therapy+using+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotactic+intracranial+implantation+and+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+tumor+xenografts+in+a+mouse+model+system+of+glioblastoma+multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תאי גליומה עכברית GL261, כאשר מושתלים לתוך מערכת חיסון intracranially syngeneic C57BL / 6 עכברים, מציעים מספר יתרונות בהשוואה למודלים של בעלי החיים xenograft גליומה אנושיים. רבים מגידולי xenografted לגדול כמו נגעים במארז שלא במדויק לשחזר את המחלה האנושית פולשנית. לעומת זאת, גידול GL261 מדגים לא רק פלישה לתוך המוח סמוך, אלא גם ניאו-וסקולריזציה, דמויות mitotic, ונימק עמוק 7. והכי חשוב כאשר לומדים אימונולוגיה גידול או אסטרטגיות טיפול חיסוניות 15, 16, עכבר C57BL / 6 שומר מערכת חיסונית שלמה 8. מחקרים קודמים הראו ביטוי חזק של TGF-β ציטוקינים לדיכוי המערכת החיסונית וגידולים תוך גולגולת מכילים תאי T-רגולציה לדיכוי מערכת החיסון דומה לגליובלסטומה אדם 9, 10. הטכניקה הפשוטה שתוארה כאן מאפשרת לביטוי יציב של לוציפראז על ידי תאי GL261. לאחרונה דיווחנו סימיLar במבחנה ובצמיחת vivo של תאי GL261.luc בהשוואה לתאי GL261, בנוסף למאפיינים היסטולוגית גידול דומים ותא חיסון לחדור 17. תאי GL261.luc יציבות להביע לוציפראז אשר מזרז החמצון של luciferin מצע המרת אנרגיה כימית לפוטונים ולכן אור לזיהוי. Luciferin יכול להינתן בבטחה לבעלי חיים וחוצה את מחסום דם המוח לאחר הזרקה תוך ורידית או intraperitoneal. בבעלי חיים במחקר קטנים כגון עכברים, פליטת אור יכול להתגלות חיצוני באופן בלתי פולשני 11. לכן, גידול ניתן להעריך באופן סדרתי ללא הצורך בהקרבת בעלי חיים או MRI היקר או הדמיה CT. השלבים הקריטיים בפרוטוקול כרוך, לא רק התמרה lentiviral, אלא גם אימות של ביטוי היציב של לוציפראז במבחנה לפני תחילת ניסויי כל in vivo. הפסד של התמרה עשוי requiמחדש זיהום lentivirus חוזר. מבוא של גן עמידות לאנטיביוטיקה לתוך וקטור הביטוי יכול לשמש גם כדי לבחור עבור ביטוי בלוציפראז. טכניקה קפדנית נדרשת להשתלה תוך גולגולתי למקום reproducibly מספר התאים עקבי במיקום מדויק אנטומית כדי לאפשר השוואה בין קבוצות טיפול שונות. הבדל עיקרי בין המחקר הנוכחי והמחקרים קודמים של תאי GL261 לוציפראז להביע הוא השימוש בטכניקת יד חופשית להשתלת תאים בהשוואה לשימוש במסגרת stereotactic 18. אנחנו הוכחנו בעבר תוצאות השתלה בקנה אחד עם יד הטכניקה החופשית 19. היתרון של יד הטכניקה החופשית הוא היכולת לבצע ניתוחי תפוקה גבוהה של סוכני טיפול שונים. בידיים שלנו, אנחנו יכולים להשתיל כ -60 בעלי חיים בשעה 1. לאחר השליטה בטכניקה, היישומים העתידיים של הטכניקה הם בלתי מוגבלים. כdemonstr GL261mitoses אטס גבוה וגידול מהיר דומה לגליובלסטומה אדם, ניתן להעריך טיפולים אנטי-שגשוג. כמו כן, ניתן להשתמש בטיפולים אנטי-פולשני ואנטי-angiogenic כגידולי GL261 הם פולשנית וangiogenic. יש להשתמש בזהירות בעת בוחנת את ההשפעה של תרופות כימותרפיות שמכוונים כנגד מטרות אנושיות. בהשוואה למחקרים קודמים ניצול xenografts גליובלסטומה אדם להביע לוציפראז 20, זה ייחשב הגבלה של המודל שלנו. כמו כן, ההשפעה של אסטרטגיות טיפול חיסוניות של גידול ניתן ללמוד במודל xenografted GL261.

גליומה ממאירה היא גידול המוח האנושי הנפוץ והקטלני ביותר. גם כאשר מטופלים בכריתה כירורגית מקסימלית, הקרנות וכימותרפיה, ההישרדות החציונית נשארת 15-20 חודשים במרכזי הפניה לגידולי מוח עיקריים1, 2, 3. הצורה האגרסיבית ביותר של גליומה ממאירה, גליובלסטומה, מאופיינת בדמויות מיטוטיות, ניאו-וסקולריזציה, פלישה למוח סמוך ונמק פסאודופליסדינג. השתלות אורתוטופיות של גידולי מוח באמצעות תאי גידול מוח אנושי מילאו תפקיד חיוני במחקר נוירו-אונקולוגי ואפשרו תרגום פרה-קליני לבדיקת חומרים חדשים, לפני הכניסה לניסויים קליניים בבני אדם. בעוד שרוב המודלים האנושיים של קסנוגרפט מסכמים מאפיינים רבים של המחלה האנושית, מגבלה בסיסית בכל מערכות מודל הקסנוגרפט המבוססות על בני אדם היא השימוש בבעלי חיים חסרי חיסון4. 
היעדר תגובת מארח שלמה משנה בבירור את צמיחת הגידול הן מבחינת מורפולוגיה של הגידול והן מבחינת יעילות ההשתלה. בעוד שהנחות מסוימות מקובלות בפירוש תוצאות ממודלים מורכבים, השגת מסקנות רלוונטיות בתחום ההערכה הטיפולית היא אתגר. מאפיינים ביולוגיים בסיסיים מסוימים עשויים להיות דומים בבעלי חיים חסרי חיסון ובעלי יכולת חיסונית, אך אחרים כגון דלקת הקשורה לגידול, פלישה לרקמות, תגובה לפציעה הם כנראה שונים מאוד. לעומת זאת, GL261 הוא קו תאי גליומה עכברי המושרה כימית המסכם במדויק את הגליומה כאשר הוא מושתל במוחם של עכברי C57BL/6 סינגניים בעלי יכולת חיסונית5. בדומה למחלה האנושית, גידול תוך גולגולתי מוביל במהירות ובאופן חוזר לתסמינים נוירולוגיים ולמוות של בעלי חיים6-10. 
ניתן למדוד ישירות את צמיחת הגידול התת עורי. ניתן למדוד צמיחת גידול תוך גולגולתי רק באמצעות הקרבת בעלי חיים או באמצעות מחקרי הדמיה יקרים. ביטוי יציב של האנזים לוציפראז מאפשר הדמיה ביולוגית תוך גולגולתית לא פולשנית וחסכונית11. ביולומינסנציה של תאי GL261 שעברו לוציפראז נמצאת בקורלציה טובה עם צמיחת גידול תוך גולגולתי. לאחרונה השווינו ישירות את GL261 לתאי GL261 שעברו שינוי בלוציפראז ולא הראינו הבדל בצמיחה ופלישה במבחנה, פרופיל ציטוקינים אימונולוגי, הישרדות in vivo של עכברי גידול תוך גולגולתי הנושאים C57BL/6, או חדירת תאים חיסוניים. טכניקה זו ישימה למחקרים פרה-קליניים של גליובלסטומה הכוללים ניטור לא פולשני של צמיחת הגידול.

<table><tbody><tr><td>D-לוציפרין, אשלגן מלח</td><td>זהב ביוטכנולוגיה</td><td>LUCK-100</td><td>חנות הרחק מהאור</td></tr><tr><td>תוכנת תמונה חיה</td><td>קליפר מדעי החיים</td><td>צור קשר להצעת מחיר</td><td>ללא</td></tr><tr><td>קסנוגן לומינה</td><td>קליפר מדעי החיים</td><td>צור קשר להצעת מחיר</td><td>אף אחד</td></tr><tr><td>24-well; תרבית רקמה סטנדרטית; </td><td>פלקון</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous בדיקת התפשטות תאים עם תמיסה אחת&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>none</td></tr><tr><td>Synergy 2 Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td>צור קשר להצעת מחיר</td><td>אף אחד</td></tr><tr><td>96 באר צלחת בדיקה, צלחת שחורה, תחתית שקופה עם מכסה, תרבית רקמות Tretaed</td><td>Coster</td><td>3603</td><td>none</td></tr><tr><td>Ketaset</td><td>Pfizer</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>חומר בקרה</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>23076-35-9</td><td>none</td></tr><tr><td>28G מחט (עם מזרק)&nbsp;</td><td>פישר&nbsp; &nbsp;</td><td>22-004-270</td><td>AKA מזרק אינסולין</td></tr><tr><td>2% כלורהקסידין</td><td>פישר</td><td>NC9756995</td><td>AKA " נולבסאן"</td></tr><tr><td>3% מי חמצן</td><td>פישר</td><td>H312P-4</td><td>יש לאחסן הרחק מאור</td></tr><tr><td>משחת עיניים</td><td>1272830 הידוע</td><td></td><td>גם בשם " דמעות אקווה"</td></tr><tr><td>25 גרם 1 1/2 מחט</td><td>BD בקטון דיקינסון</td><td>305127</td><td>ללא</td></tr><tr><td>אזמל חד פעמי</td><td>נוצה</td><td>2975</td><td>מס '21</td></tr><tr><td>גזה</td><td>פישר</td><td></td><td>22028563 חיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td>ללא</td></tr><tr><td>מהדק עור, סיכות, מסיר</td><td>סטולטינג</td><td>59020</td><td>ללא</td></tr><tr><td>PDI Alchol רפידות הכנה</td><td>פישר</td><td>23-501-711</td><td>אין</td></tr><tr><td>רפלקס 7 מ"מ קליפים פצועים 100 חבילה</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>203 1000</td><td>חיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>רפלקס 7 מ"מ Wound Clip Applier</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>204 1000</td><td>חיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>רפלקס 7 מ"מ מסיר קליפ פצע</td> עץ <td>המוח Scientific, INC</td><td>205 1000</td><td>ללא</td></tr><tr><td>ספוגית קצה עגול יחיד עם ידית עץ</td><td>Qosmedix</td><td>10107</td><td>חיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של הנקס ללא Ca2+ ו-Mg2+ (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>ללא</td></tr><tr><td>מזרק המילטון</td><td>המילטון</td><td>80300</td><td>ללא</td></tr><tr><td>FuGENE 6 Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2961</td><td>ללא</td></tr><tr><td>שעוות עצם</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>599864</td><td>אף אחד</td></tr></tbody></table>

הדמיה פליטת אור של דגם עם מערכת חיסון בבעלי חיים לגליובלסטומה

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

בניגוד למודלים של בעלי חיים של גליומה אנושית המדווחים בדרך כלל, גליומה עכברית GL261 xenografts מסכמים כמעט את כל המאפיינים הקליניים וההיסטופתולוגיים הרלוונטיים של המחלה האנושית. כאשר תאי GL261 מושתלים תוך גולגולתית בעכברי C57BL/6 סינגניים, למודל יש יתרון נוסף של שמירה על מיקרו-סביבה חיסונית שלמה. ביטוי יציב של לוציפראז בתאי GL261 מאפשר ניטור ביולומינסנציה לא פולשני וחסכוני של צמיחת גידול תוך גולגולתי. לאחרונה הוכחנו כי ביטוי לוציפראז בתאי GL261 אינו משפיע על תכונות צמיחת הגידול, ביטוי ציטוקינים אימונומודולטוריים של תאי גידול, חדירת תאים חיסוניים לגידול או הישרדות כוללת של בעלי חיים הנושאים את הגידול התוך גולגולתי. לכן, נראה כי מודל הגליומה של GL261 luciferase יכול להיות שימושי בחקר שיטות כימותרפיות ואימונותרפיות חדשות. כאן אנו מדווחים על הטכניקה ליצירת ביטוי לוציפראז יציב בתאי GL261 וכיצד לחקור את הצמיחה במבחנה ובגוף החי של תאי הגידול על ידי הדמיה ביולומינסנציונית.

תאי GL261 היו נגועים בלוציפראז המכיל lentivirus כפי שתואר לעיל בצעדים 1. הדמיה פליטת אור במבחנה מדגימה ביטוי בלוציפראז חזק דומה לרמות בשליטה החיובית U87.luc שורת תאי גליובלסטומה אדם (איור 1). כצפוי, תאים נגוע GL261 להפגין שום ביטוי בלוציפראז רקע. שלב זה הוא פשוט אך קריטי לביצוע לפני מחקרים נוספים באמצעות שורת התאים הנגוע כדי לאשר ביטוי בלוציפראז יציב. ביטוי לוציפראז לאחר השתלה תוך גולגולתי. לפני השתלה תוך גולגולתי, שהראינו שום הבדל בשיעור צמיחה במבחנה של GL261.luc בהשוואה לתאי GL261 (איור 2). לצמיחה תוך גולגולת וניתוח הישרדות, תאים הוזרקו לbrains של עכברי C57BL / 6 לפי פרוטוקול שלב 3. צמיחת גידולים בעכברי נושאי גידולי GL261.luc נותח סדרתי עבור הדמיה פליטת אור באמצעות צעד פרוטוקול 4 והפגין צמיחה לגילוי גידול (איור 3 א). עכברי נושאי גידולי GL261.luc במהירות ובעקביות הפכו גוססים והיו מורדמים. חשוב לציין, שאין הבדל בהישרדות כוללת בין GL261.luc וגידול GL261 נושא בעלי חיים (איור 3). בvivo הדמיה פליטת אור ולכן יכולה לשמש לניטור תגובה לטיפולים ניסיוניים גליובלסטומה. צמיחה מהירה אמינה גידול והישרדות כללית קצרה יכולים להניב כמויות גדולות של נתונים בכמות זמן קצר יחסית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig1.jpg" /> פעילות לוציפראז איור 1. בתאי GL261.luc. U87.luc, תאי GL261.luc וGL261 (שליטה שלילית) היו מצופים בצפיפות שלx x x x x 1.0 x 10 6, 5.0 10 5, 2.5 10 5, 1.0 10 5, 5.0 10 4, ו -2.5 10 4 תאים / גם משמאל לימין. הארה (פוטון / sec / סנטימטר SR / 2) נמדד על ידי תחנת ההדמיה לומינה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig2.jpg" /> איור 2. ביטוי לוציפראז אינו משפיע על התפשטות תאי GL261. תאי GL261.luc לא לגרום ל הבדל בהתפשטות כפי שהודגם על ידי assay התפשטות תאי MTS. הגרף מראה גידול של פי, ביחס ליום 1, כפי שנקבע על ידי השוואת הערך ספיגה הממוצע (ממוצע ± SEM) בנקודת זמן thespecified לערך הממוצע ביום 1 (ערכי -test t מזווגים להשוואותבין כל שורת תאים: P = .7796) 14. ברים שגיאה מייצגים את הערכים הממוצע (ממוצע ± SEM) מדגימות ארבע פעמים בכל יום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig3.jpg" /> איור 3. ביטוי לוציפראז מינון לא ישפיע על in vivo צמיחת גידול והישרדות של בעלי חיים. () ניטור פליטת אור מדגים צמיחה הדרגתית של גידול תוך גולגולתי GL261.luc בעכברי C57BL / 6. (ב) ניתוח הישרדות קפלן-מאייר מדגים אין הבדל בהישרדות כוללת עבור עכברים המושתלים intracranially עם שני תאי GL261 (קו מוצק) או GL261.luc (קו מקווקו).אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תאי גליומה GL261 מספקים מודל שימושי של בעלי חיים בעלי יכולת חיסונית של גליובלסטומה. מטרות פרוטוקול זה הן להדגים טכניקות מתאימות לניטור צמיחת גידול תוך גולגולתי באמצעות הדמיית ביולומינסנציה in vivo, ולאמת את התועלת של תאי GL261 שעברו שינוי בלוציפראז לחקר אימונולוגיה של גידול וגישות אימונותרפיות לטיפול בגליובלסטומה.

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להדגים את הטכניקות הנכונות לניטור צמיחת תאי גידול וגידול תוך-גולגולתי באמצעות הדמיית ביולומינסנציה in vivo, כדי לאמת את התועלת של מודיפיקציית לוציפראז של תאי גידול עכבריים מסוג GL261. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בחקר אימונולוגיה של גידולים וגישות אימונותרפויטיות, כגון השאלה האם המודיפיקציה של העקה משפיעה על השגחה של תאי GL261 ועל צמיחתם in vivo.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהנדסת לוציפרז של תאי גידול GL261 מאפשרת ניטור לא פולשני של צמיחתם ותגובתם לטיפול in situ. כאשר תרבית תאי ה-GL261 המבטאים לוציפרז מגיעה ל-70% confluency בבקבוק T75, קצור את התאים באמצעות טריפסינציה. ספור את התאים ולאחר מכן העבר אותם לפלטת 24 בארות בצפיפויות מדורגות.לאחר שלוש שעות באינקובטור לתרביות תאים, פתחו את התוכנה לדימות ביולומינצנציה ואתחלו את מערכת הדימוי. כאשר המצלמה התקררה ל-90- degrees Celsius, הגדירו בתוכנת הדימוי מצב Luminescent עם זמן חשיפה של 10 שניות ו-Medium Binning. לאחר מכן, דגרו את התאים ב-25 µL של luciferin לבאר למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, והניחו את הפלטה בתחנת הדימוי.בחר ב-Acquire כדי להתחיל את הדימוי. כאשר תמונה תתקבל בהצלחה, יופיעו חלון תמונה ולוח כלים. לחץ על כלי ה-Regions of Interest ובחר 6 by 4 מאייקון החריץ.כסו את אזור האות באמצעות 6 על 4 חריצים, ובחרו בסמל העיפרון בלשונית Measurements. יופיע חלון עם טבלה של מדידות אזור העניין (ROI) ביחידות של פוטונים לשנייה לסטראדיאן לסנטימטר רבוע. לביצוע בדיקת שגשוג (proliferation assay) in vitro, קצרו את תרביות התאים כפי שהודגם זה עתה כאשר הן מגיעות ל-70% confluency.השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להעביר את תאי הגידול ל-20 בארות של פלטה בעלת 96 בארות, בריכוז של 1.5 × 10³ תאים ל-80 µL של מצע RPMI לכל בארה. כדי להגביל את התאיידות תרביות התאים, מלאו את הבארות הריקות שסביבן ב-100 µL של מצע RPMI טרי. לאחר מכן, כדי להעריך את השגשוג התאי, הוסיפו 20 µL של רכיב MTS לכל בארה עם תאים.דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. לאחר שלוש שעות, השתמשו בקורא מיקרופלטות כדי למדוד את הבליעה באורך גל של 490 nm. כדי לנרמל את ערכי הבליעה, חלקו את הערכים מכל יום בקריאות המקבילות שהתקבלו ביום הראשון.ביום ההשתלה, השעו 1x10⁵ תאים למקרוליטר ב-HBSS ללא סידן ומגנזיום מתרבית תאי גידול בעלת התכנסות (confluency) של 70%. לאחר מכן, לאחר וידוא רמת הסדציה המתאימה באמצעות צביטה בבהוות, גלחו את חלקו העליון של הראש של כל חיה ניסויית. בעזרת מקלוני צמר גפן, נקו כל גולגולת עם 2% chlorhexidine.לאחר מכן, יש למרוח חומר סיכוך על עיניו של כל עכבר. כעת, השתמש בסכין מנתחים סטרילית כדי לבצע חתך סגיטלי באורך של כ-1 סנטימטר מעל עצם הפריאטאל-אוקסיפיטל של החיה הראשונה. נקה שוב את שטח הפנים של הגולגולת באמצעות 3% hydrogen peroxide תוך סימון של ה-bregma הנראה.לאחר מכן, באמצעות מחט סטרילית בכיול 25-gauge, קדחו חור של 3 מילימטרים בגולגולת מימין ל-bregma ומיד מאחורי ה-coronal suture. כדי להבטיח עומק הזרקה מתאים, השתמשו במספריים כדי לחתוך 3 מילימטרים מהקצה המחודד של טיפ פ pipette בנפח 20-microliter, והחליקו מזרק Hamilton בכיול 26-guage לתוך הטיפ עד ש-3 מילימטרים מהמחט בולטים מקצה הטיפ. הכניסו את המחט לחור בגולגולת, והזריקו לאט 3 µL של 3 × 10⁵ תאי גידול לאורך פרק זמן של דקה אחת.השאירו את המחט במקומה למשך דקה נוספת ולאחר מכן הוציאו אותה באיטיות. שטפו את העצם החשופה עם מי חמצן (hydrogen peroxide) בריכוז 3% ותמיסת chlorhexidine בריכוז 2%. לאחר מכן, לאחר ייבוש הגולגולת באמצעות מקלוני צמר גפן נקיים, גזרו חתיכה של 3 ריבוע מילימטרים של שעוות עצם סטרילית והצמידו את השעווה לקצה חשוף של מקלוני צמר גפן.כסו את נקודת ההזרקה בשעוות עצם. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי למתוח כל צד של הקרקפת מעל השעווה. לאחר סגירת הפצע ומתן משככי כאבים מתאימים לאחר הניתוח, חזרו על הפרוצדורה עבור כל חיה ניסויית.כדי לדמות את צמיחת הגידול התוך-גולגולתי, ראשית בצעו את אתחול תחנת ההדמיה כפי שהודגם כעת. לאחר מכן, לאחר אישור רמת הסדציה המתאימה באמצעות צביטה בזנב, הגדירו את פרמטרי מערכת ההדמיה כפי שהודגם כעת, למעט בחירה ב-Auto עבור זמן החשיפה.כאשר מערכת ההדמיה מוכנה, הניחו את העכברים על תחנת ההדמיה ובחרו ב-Acquire כדי להוציא תמונות של ביטוי הלוסיפראז. לאחר שהתמונה הופקה בהצלחה, בחרו את כלי ה-Region of Interest מלוח הכלים ואת Auto מתוך סמל העיגול. הקף את אזורי האות כדי להגדיר את אזורי העניין (ROI), ולאחר מכן השו כילולים של האזורים ביחידות של פוטונים לשנייה, לסטראדיאן לסנטימטר רבוע.לבסוף, הוציאו את העכברים מתא ההדמיה, ועקבו אחר בעלי החיים הנושאים את הגידול עד להחלמה מלאה. הדמיית ביו-לומינסנציה in vitro של תאי GL261 שהודבקו בלנטי-וירוס המכיל לוסיפראז מראה ביטוי לוסיפראז חזק, הדומה לרמות הלוסיפראז המבטאים בשורת תאי גליובלסטומה אנושית U87MG המבטאת לוסיפראז כביקורת חיובית. כצפוי, תאי GL261 שאינם נגועים אינם מראים ביטוי רקע של לוסיפראז.לפני השתלה תוך-גולגולתית, לא נצפתה הבדל בשיעורי הגדילה in vitro של תאי GL261 luciferase ותאי GL261. כפי שמוצג בדימות ביולומינסנציה סדרתי של בעלי חיים שהוזרקו להם גידולי תוך-גולגולת, תאי גידול המבטאים GL261 luciferase מראים גם הם שיעור גדילה מהיר ועקבי in vivo, ללא הבדל משמעותי בשיעורי ההישרדות שנצפו בין קבוצות הניסוי הנושאות גידולים. ברגע שהטכניקה תשלט, ניתן להשתמש בה כדי לדמות עד 25 עכברים בשעה, אם היא מבוצעת כראוי.לאחר פיתוחה, טכניקה זו משפרת את היכולת של דימוי ביו-לומנסנס (bioluminescence imaging) לשמש ככלי יעיל לניטור צמיחת גידולי GL261 in vivo, ובכך מקדמת את חקירת התגובות האימונותרפיות במודלים של עכברים בעלי מערכת חיסונית תקינה.

bioluminescence-imaging-an-immunocompetent-animal-model-for

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בלוציפראז, שונה אדם xenografts גידול במוח ניתן לקבוע intracranially בעכברים athymic, עם ניטור הבאים של הגידול ואת התגובה לטיפול באמצעות הדמיה פליטת אור. בשילוב עם ניתוח הישרדות, ניטור פליטת אור הוא כלי מחקר הכרחי לצורך בדיקות טרום קליניים של טיפולים נשקלת לטיפול בגידולים במוח.

הקמת גידול תוך גולגולתי xenografts המוח עם ניתוח בדיעבד של הגידול ואת התגובה לטיפול באמצעות הדמיה פליטת אור

הדמיה של פליטת אור ועין מתנהלת פעילות היפוקסיה, גורם 1α מוחל לפקח היפוקסיה תוך גולגולתי התפתחות גידולים של סרטן השד מודל גרורות במוח העכבר.

בתחום ההדמיה vivo של פליטת אור Dynamics היפוקסיה גידול של גרורות סרטן השד המוח במודל של עכברים

ההשתלה תוך גולגולתי של תאים לתוך GL261 C57BL / 6 עכברים מייצרת gliomas ממאיר לשחזר רבים מסימני ההיכר של multiforme glioblastoma האדם. השתמשנו GL261 התאים ביציבות להביע בלוציפראז כדי לאפשר לנו...

השרשה תוך גולגולתי עם 3D לאחר In vivo Bioluminescent הדמיה של gliomas Murine

אנו מתארים שיטה משולבת להשתלה המדויקת, stereotactic של תאי multiforme glioblastoma אדם לתוך המוח של עכברים בעירום וסידורי...

השרשה ותוך גולגולת Stereotactic<em&gt; בחי</em&gt; הדמית bioluminescent של xenografts גידול במערכת מודל עכבר של multiforme glioblastoma

בסרטון זה, אנו מתארים טומוגרפיה מולקולרית פלואורסצנטית או FMT עבור הדמיה in vivo של גליובלסטומה מתויגת חלבון פלואורסצנטי xenografts במודלים עכבריים. הטכניקה שימושית להבהרת ההשפעות של טיפולים נגד גידולים ברמה המולקולרית.

טומוגרפיה מולקולרית פלואורסצנטית: טכניקת הדמיה עבור הדמיה In vivo של גליובלסטומה מתויגת חלבון פלואורסצנטי Xenografts במודל עכבר

מקור: Clark, A.J., et al. הדמיית ביולומינסנציה של מודל בעלי חיים בעלי יכולת חיסונית לגליובלסטומה. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הדמיית ביולומינסנציה כדי לעקוב אחר התקדמות גליובלסטומה במודל עכבר בעל יכולת חיסונית, תוך שימוש בתאי גידול המבטאים לוציפראז ולוציפרין כדי לכמת את צמיחת הגידול באופן לא פולשני.

הדמיה ביולומינסנציה של מודל עכבר בעל יכולת חיסונית לגליובלסטומה

הקמנו מודל גליובלסטומה orthotopic קליפת המוח בעכברים לשני הפוטונים במיקרוסקופ intravital שמשחזר אילוצי biophysical בדרך כלל במשחק במהלך הצמיחה של הגידול. חלון זכוכית כרוני החלפת הגולגולת מעל לגידול מאפשר המעקב של התקדמות הגידול לאורך זמן על ידי שני פוטונים במיקרוסקופ.

Glioblastoma עכבר דגם orthotopic שמירה על אילוצי המוח של רקמת ריאה, פיסיים ומתאים לשני פוטונים במיקרוסקופ Intravital

הזרקה תוך-גולגולתי Orthotopic של תאים סרטניים שימש בחקר הסרטן ללמוד ביולוגיה גידול במוח, התקדמות, התפתחות, תגובה טיפולית. כאן אנו מציגים פלורסצנטיות מולקולרית טומוגרפיה של גידול xenografts, אשר מספק הדמיה intravital בזמן אמת, כימות של גידול המוני במודלים פרה גליובלסטומה.

קרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית עבור הדמיה In Vivo של גליובלסטומה Xenografts

אנו מציגים גישה חדשנית למיקרוסקופ דו-פוטוני של העברת הגידול של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל עם תווית פלואורסצנטית לגליובלסטומה במודל עכבר.

מיקרוסקופיה תוך-חיונית דו-פוטונית של גליובלסטומה במודל מורין

מחסום הדם-מוח הוא משוכה משמעותית במתן טיפולים לגליובלסטומה, מחלה שאין לה תרופה. כאן, אנו מדווחים על פלטפורמת ננו טיפולית של תחמוצת ברזל מונחית תמונה in vivo שיכולה לעקוף את המחסום הפיזיולוגי הזה בזכות גודלו ולהצטבר בגידול.

העברת ננו-חלקיקים של מטען אוליגונוקלאוטיד במודל בעלי חיים רב-צורניים מסוג גליובלסטומה

גליובלסטומה היא צורה הרסנית של סרטן מוח ראשוני, וטיפול תרמי אינטרסטיציאלי בלייזר מתגלה כחלופה מבטיחה לכריתה כירורגית קונבנציונלית לגליובלסטומה שאינה ניתנת לניתוח. פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר פרה-קליני אופטימלי שניתן להשתמש בו כדי לחקור את השפעות הטיפול או טיפולים משלימים וקומבינטוריים.

מודל עכברי בעל יכולת חיסונית לטיפול תרמי אינטרסטיציאלי בלייזר בגליובלסטומה

למדו הדמיית ביולומינסנציה בתאי גליומה GL261 בעכברים לחקר גידולים תוך-גולגלתיים. שיטה זו מאפשרת מעקב לא פולשני אחר צמיחת הגידול ותגובה לטיפולים אימונותרפיים במודלים אימונוקומפטנטיים.

הדמיה פליטת אור של דגם עם מערכת חיסון בבעלי חיים לגליובלסטומה

גלה סרטונים נוספים