הדמיה פליטת אור של דגם עם מערכת חיסון בבעלי חיים לגליובלסטומה

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים את הטכניקות המתאימות לניטור צמיחת תאי גידול וגידול תוך גולגולתי באמצעות הדמיית ביולומינסנציה in vivo כדי לאמת את התועלת של שינוי לוציפראז של תאי גידול עכברים GL261. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר אימונולוגיה של גידולים וגישה אימונותרפית. כגון האם שינוי הלחץ משפיע על התפשטות תאי GL261 וגדל in vivo.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שינוי לוציפראז של תאי גידול GL261 מקל על ניטור לא פולשני של צמיחתם ותגובתם לטיפול באתרם. כאשר תרבית תאי הלוציפראז GL261 מגיעה ל-70% מפגש בבקבוק T75, קצרו את התאים על ידי טריפסיניזציה. ספרו את התאים ולאחר מכן העבירו אותם לצלחת של 24 בארות בצפיפות מדורגת.

לאחר שלוש שעות באינקובטור תרבית תאים, פתחו את תוכנת ההדמיה הביולוגית ואתחלו את מערכת ההדמיה. כאשר המצלמה התקררה ל-90 מעלות צלזיוס, הגדר את תוכנת ההדמיה ל-Luminescent עם זמן חשיפה של 10 שניות ו-Medium Binning. לאחר מכן דגרו את התאים ב-25 מיקרוליטר לוציפרין לבאר למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, והניחו את הצלחת על תחנת ההדמיה.

בחר רכוש כדי להתחיל את ההדמיה. כאשר תמונה הושגה בהצלחה, יופיע חלון תמונה ומשטח כלים. לחץ על כלי אזורי עניין ובחר 6 על 4 מסמל החריץ.

כסה את אזור האות בחריצים של 6 על 4, ובחר בסמל העיפרון בכרטיסייה מדידות. יופיע חלון עם טבלה של מדידות אזור עניין כיחידות פוטונים לשנייה לכל סטרדיאן לסנטימטר מרובע. כדי לבצע בדיקת התפשטות במבחנה, קצור את תרביות התאים כפי שהודגם זה עתה כאשר הן מגיעות למפגש של 70%.

והשתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי למקם את תאי הגידול ב-20 בארות כל אחת מצלחת של 96 בארות ב-1.5 כפול 10 לתאים השלישיים לכל 80 מיקרוליטר של מדיום RPMI לבאר. כדי להגביל את אידוי תרביות התאים, מלאו את הבארות הריקות שמסביב ב -100 מיקרוליטר של מדיום RPMI טרי. לאחר מכן, כדי להעריך את התפשטות התאים, הוסף 20 מיקרוליטר של מגיב MTS לכל באר תאים.

ולדגור את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר שלוש שעות, השתמש בקורא מיקרו-פלטות כדי למדוד את הספיגה ב-490 ננומטר. כדי לנרמל את ערכי הספיגה, חלקו את הערכים מכל יום בקריאות המתאימות שהתקבלו ביום הראשון.

ביום ההשתלה, השעו פעם אחת 10 עד 5 תאים למיקרוליטר ב-HBSS ללא סידן ומגנזיום מתרבית תאי גידול משולבת של 70%. לאחר מכן, לאחר אישור רמת ההרגעה המתאימה על ידי צביטת הבוהן, גלחו את החלק העליון של הראש של כל חיית ניסוי. בעזרת מריחת קצה כותנה, נקו כל גולגולת עם 2% כלורהקסידין.

לאחר מכן מרחו חומר סיכה על העיניים של כל עכבר. כעת השתמש באזמל סטרילי כדי לבצע חתך סגיטלי באורך של כסנטימטר אחד מעל עצם העורף הקודקודית של החיה הראשונה. ונקו שוב את פני הגולגולת עם מי חמצן 3% תוך ציון הברגמה הנראית לעין.

לאחר מכן, בעזרת מחט סטרילית בקוטר 25, קדחו חור של 3 מילימטר בגולגולת מימין לברגמה וממש מאחורי תפר העטרה. כדי להבטיח את עומק ההזרקה המתאים, השתמש במספריים כדי לחתוך 3 מילימטרים מהקצה המחודד של קצה פיפטה של 20 מיקרוליטר, והחלק מזרק המילטון של 26 מד לקצה עד ש-3 מילימטרים מהמחט בולטים מקצה הקצה. הכנס את המחט לחור בגולגולת, והזריק לאט 3 מיקרוליטר של 3 כפול 10 ל-5 מתאי הגידול במשך תקופה של דקה.

השאירו את המחט במקומה למשך דקה נוספת ואז משכו אותה לאט. החלף את העצם החשופה במי חמצן 3% ותמיסת כלורהקסידין 2%. לאחר מכן, לאחר ייבוש הגולגולת עם אפליקטור קצה כותנה טרי, גזרו חתיכה של 3 מילימטרים רבועים של שעוות עצם סטרילית והצמידו את השעווה לקצה חשוף של אפליקטור קצה כותנה.

מכסים את מקום ההזרקה בשעוות העצם. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי למשוך כל צד של הקרקפת מעל השעווה. לאחר סגירת הפצע ומתן משככי כאבים מתאימים לאחר הניתוח, חזור על ההליך עבור כל חיית ניסוי.

כדי לדמות את צמיחת הגידול התוך גולגולתי, אתחל תחילה את תחנת ההדמיה כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, לאחר אישור רמת ההרגעה המתאימה על ידי צביטת זנב, הגדר את הפרמטרים של מערכת ההדמיה כפי שהודגם זה עתה. למעט בחירה באפשרות אוטומטי עבור זמן החשיפה.

כאשר מערכת ההדמיה מוכנה, הנח את העכברים על תחנת ההדמיה ובחר רכוש כדי לקבל תמונות של ביטוי הלוציפראז. לאחר שהתמונה נרכשה בהצלחה, בחר את הכלי אזור עניין ממשטח הכלים ואוטומטי מסמל העיגול. הקף את אזורי האות כדי להגדיר את אזורי העניין ולאחר מכן קבל מדידות של האזורים כיחידות של פוטונים לשנייה, לכל סטרדיאן לסנטימטר מרובע.

לבסוף, הוציאו את העכברים מתא ההדמיה, ועקבו אחר בעלי החיים נושאי הגידול עד שהם מתאוששים לחלוטין. הדמיית ביולומינסנציה במבחנה של תאי GL261 הנגועים בלנטי-וירוס המכיל לוציפראז מציגים ביטוי לוציפראז חזק הדומה לרמות הלוציפראז המתבטאות על ידי קו תאי גליובלסטומה אנושי המבטא לוציפראז U87MG חיובי. כצפוי, תאי GL261 לא נגועים אינם מציגים ביטוי לוציפראז ברקע.

לפני ההשתלה התוך גולגולתית, לא נצפה הבדל בשיעורי הצמיחה במבחנה של קווי תאי GL261 לוציפראז ו-GL261. כפי שמדגים הדמיה ביולומינסנציה סדרתית של בעלי חיים שהוזרקו לגידול תוך גולגולתי, תאי גידול המבטאים לוציפראז GL261 מציגים גם קצב צמיחה מהיר ועקבי in vivo ללא הבדל משמעותי בשיעורי ההישרדות בין הקבוצות נושאות הגידול הניסיוניות שנצפו. לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לדמות עד 25 עכברים לשעה אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו משפרת את היכולת של הדמיית ביולומינסנציה להיות שימושית לניטור צמיחת גידול GL261 in vivo ומקדמת את חקירת התגובות האימונותרפיות במודלים של עכברים בעלי יכולת חיסונית.