דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא להשתמש בתאי אנדותל כסוג חדש של מודל תאים המציג אנטיגן מישורי כדי לחקור תהליכי איתות אנטיגניים בסיסיים. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בתחום החסינות האדפטיבית, כגון כיצד דינמיקת שיפוץ תת-תאית ומולקולרית מתואמת מרחבית וזמנית בתוך הסינפסה החיסונית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהאנדותל נוצר כמעט מישורי משטח מחשב.

זה מאפשר הדמיה עם רזולוציה מרחבית-זמנית אופטימלית בהקשר של משטח תא מורכב מבחינה פיזיולוגית וניתן לעיצוב. למרות ששיטה זו מתמקדת בהפעלת תאי זיכרון חיוביים CD 4 TH אפקטור אחד, ניתן ליישם אותה גם לחקר מגוון סוגי תאי T אנטיגן ותהליכי איתות. היום, כריס ואני נראה לך לבצע את ההתחלה השנייה על ידי העברת קוד של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים של ריאות אנושיות או עוריות עם ממברנה YFP ו-DS אדום מסיס באמצעות חיבה גרעינית NU ולצלחת את התאים הטרנספטקטים על לוחות תרבית הדמיה של תאים חיים.

למחרת החליפו את מדיום תרבית התאים במדיום טרי בתוספת אינטרפרון גמא כדי לגרום לביטוי M MHC שני על תאי האנדותל, ואחריו גירוי התאים עם 20 ננוגרם למיליליטר של TNF אלפא 24 שעות לאחר מכן ביום השלישי 30 עד 60 דקות. לפני תחילת הניסוי, דגרו את האנדותל במיקרוגרם אחד למיליליטר, כל אחד מהסופר-אנטיגנים החיידקיים סטפילוקוקלי אנטרוטוקסין B ורעלן תסמונת הלם רעיל אחד ב -37 מעלות צלזיוס. במהלך הדגירה, ספרו את מספר התאים ברי קיימא מתרבית הלימפוציטים המעניינת והעבירו פעמיים פי 10 עד השישית מהתאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

לאחר מכן, סובב את התאים והשהה מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של מאגר A טרי שהוכן כך שלא יישארו אשכולות תאים. לאחר מכן הוסף שני RA מיקרו-מולרי שניים לדגימת תאי T, כסה את הצינור והפוך אותו מיד להומוגני. מחלקים את הצבע לאורך תרחיף התא.

לאחר דגירה של 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, סובבו את הלימפוציטים המסומנים והשעו מחדש בעדינות אך ביסודיות את התאים ב-20 עד 40 מיקרוליטר של מאגר A טרי לתמונה חיה, התאים מפעילים את מערכת המיקרוסקופ ופותחים את תוכנת לכידת התמונה המתאימה. הגדר את הפרמטרים המתאימים להדמיית זמן-lapse רב-ערוצית אוטומטית, כמו גם את מרווח הרכישה של 10 עד 30 שניות ומשך כולל של כ-20 עד 60 דקות. לאחר מכן, הוסף שמן טרי למטרה.

התקן צלחת מיקרוסקופ המכילה 0.5 מיליליטר חיץ A על מתאם שלב החימום, והפעל מיד את המתאם שהוגדר קודם לכן ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר שתיים-שלוש דקות של שיווי משקל, השתמש בפיפטה של 20 מיקרוליטר כדי להוסיף את שני הלימפוציטים הטעונים של RA במנוחה לתוך תא צלחת המיקרוסקופ המותקן ולהפעיל את הדמיית השדה הבהיר. בחר את נתיב האור לחלקי העיניים והשתמש בכפתור המיקוד של הקורס כדי להביא את המטרה למגע עם החלק התחתון של צלחת המיקרוסקופ.

לאחר מכן השתמש בעינית ובכפתור המיקוד העדין כדי לאתר את תאי ה-T המיושבים בתחתית הצלחת והשתמש בפקדי שלב XY כדי לבחור שדה המכיל לפחות 10 תאים כאשר התאים המתאימים אותרו. עבור משדה בהיר למקור האור הפלואורסצנטי ומהדמיית IP למצלמת CCD. בצע אופטימיזציה של פרמטרי הרכישה ולאחר מכן רכוש תמונות Fira 2 3 40 ו- FIRA 2 3 80 במנוחה.

אחד השלבים המרכזיים ליצירת תוצאות מוצלחות הוא אופטימיזציה קפדנית של פרמטרי רכישת הקרינה, הבטחת איסוף אות מספיק ובמקרה של פירה שתיים, שיחס הבסיס 3 43 80 קרוב לאחד. כאשר נקבעו שני זמני החשיפה של ה-FIRA, החלף את צלחת תאי ה-T בצלחת מיקרוסקופ של תאי אנדותל באמצעות פיפטת העברה חד פעמית הסר במהירות את המדיה ושטוף את התאים פעם אחת עם מיליליטר אחד של מאגר חם A, ולאחר מכן החלף את הכביסה ב-0.5 מיליליטר של מאגר טרי A. לאחר מכן התאם את פרמטרי הרכישה עבור ממברנה YFP ו-DS RED כפי שהודגם זה עתה עבור פירה שתיים.

לדאוג שעוצמת האות הפלואורסצנטי הממוצעת בכל ערוץ תיפול בין 25 ל-75% מהטווח הדינמי של הגלאי. לפני ביצוע ניסוי הדמיית תאים חיים, צלם מספר מרווחים של תמונות של תאי האנדותל בלבד כדי לקבוע קו בסיס עם התוכנה האוטומטית. לאחר מכן הכנסת קצה של כרך קטן למדיה קרוב למרכז המטרה.

הוצא לאט חמישה מיקרוליטרים של פירה מרוכזת, שני לימפוציטים טעונים למרכז שדה ההדמיה של צלחת המיקרוסקופ. כאשר הלימפוציטים מתייצבים, בצע התאמות עדינות למיקוד כדי להבטיח שממשקי תאי האנדותל של תאי T נשמרים במישור המוקד. עם היעדים של 40 ו-63 x, 10 עד 20 תאים לשדה הם אופטימליים.

לאחר מרווח התצפית הרצוי, המשיכו בהדמיה ומיד פיפטה CIN ישירות לתוך צלחת המיקרוסקופ לריכוז סופי של שני מיקרומולר כדי לגרום לשטף סידן מקסימלי. שני אותות. בעת יישום טיפולים בתאים, הקפד לשמור על מיקוד חד על פני השטח המסומנים YFP של הממברנה האפיקלית של האנדותל כדי להבטיח רזולוציה אופטימלית של עיצוב מחדש של הסינפסה החיסונית.

בהיעדר סופר-אנטיגן על CD הספציפי לסופר-אנטיגן אנדותל, ארבעה לימפוציטים חיוביים TH אחד מתפשטים במהירות, מקטבים ונודדים לרוחב על פני תאי האנדותל. במהלך תהליך זה, הלימפוציטים מרחיבים בליטות קצרות מועד או ILPs לתוך פני האנדותל, אשר ניכרים כטבעות של פלואורסצנטיות YFP ממברנה המקבילות לטביעות רגליים בנוכחות סופר-אנטיגן, מגעים קרובים בין תאים לתאים המונעים על ידי ILPs קשורים להתחלת שטף סידן המוביל להצטברות של ILPs מיוצבים בתוך הסינפסה האימונולוגית. מערכי ILP כאלה מחוברים לאיתות סידן מתמשך.

טבעות הקרינה הממברנה הנוצרות במהלך אינטראקציות של תאי אנדותל של תאי T תואמות את בליטות תאי ה-T המניעות כתמי פלישה נפרדים בתאי אנדותל כפי שאושר על ידי ההדגמה כי טבעות אלו מתואמות מרחבית וקינטית עם אזורי הציטופלזמה שנעקרה והוצאה. תוך דקות מהדגירה המשותפת של תאי האנדותל ותאי ה-T בנוכחות הידבקות סופר-אנטיגן ומולקולות איתות הקשורות לאיתות אנטיגני מועשרות בתוך טביעות הפוטה וה-ILPs של הסינפסה האימונולוגית. ואכן, הסינפסה האימונולוגית האנדותל של תאי T מציגה ארכיטקטורה תלת מימדית דיסקרטית המנוקדת על ידי ILPs של תאי T המשתרעים לתוך פני התא המציג אנטיגן שבתוכו מועשר המנגנון המולקולרי לזיהוי אנטיגן.

בגישה זו, ניתן להתגבר על מכשולים מרכזיים במודלים קיימים של מחשב אישי, המאפשרים התבוננות בארכיטקטורה תת-תאית תלת-ממדית שאחרת אינה ניתנת לגילוי ועיצוב מחדש מהיר של ממשקי תאי T פיזיולוגיים למחשב. זה מציע פוטנציאל לרמות חדשות של הבנה של תהליכי איתות אנטיגניים.