Name: דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: חקור דינמיקת סינפסה חיסונית באמצעות מודל תאי אנדותל מישורי לחקר תהליכי סיגנל אנטיגני. שיטה זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות תאי T והפעלתם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לד"ר פיטר ט. סייג' על עזרתו ביצירת חלק מהתמונות המייצגות. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R01 ל-C.V.C. (HL104006).

<ol><li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+function+and+migration.+Two+sides+of+the+same+coin%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">T-cell function and migration. Two sides of the same coin.</a> N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+receptors+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adhesion receptors of the immune system.</a> Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).</li>
<li>Shaw, A. S., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+T+cell+receptor+go+the+distance%3A+a+topological+view+of+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation.</a> Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).</li>
<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+T-cell+interactions+with+antigen+presenting+cells+in+culture+and+in+intact+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue.</a> Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).</li>
<li>Brossard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifocal+structure+of+the+T+cell+-+dendritic+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse.</a> Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+context+of+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cellular context of T cell signaling.</a> Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li>
<li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+complexes+and+clusters%3A+functional+advantages+and+methodological+hurdles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).</li>
<li>Oddos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+high-resolution+imaging+of+intercellular+immune+synapses+using+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers.</a> Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Bunnell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+ligation+induces+the+formation+of+dynamically+regulated+signaling+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies.</a> J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
<li>Seminario, M. C., Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+T-cell+receptor+microclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in T-cell receptor microclusters.</a> Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+bilayers+at+the+vanguard+of+immune+cell+activation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies.</a> J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).</li>
<li>Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMartinelli%2C+R+%22Encyclopedia+of+Cell+Biology%22">Encyclopedia of Cell Biology</a>. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).</li>
<li>Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte-endothelial cell interactions.</a> Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+by+the+endothelium%3A+a+green+light+for+antigen-specific+T+cell+trafficking%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking?</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+recognition+is+facilitated+by+invadosome-like+protrusions+formed+by+memory%2Feffector+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells.</a> J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).</li>
<li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+foci+facilitate+activation+of+the+phospholipase+C-gama+in+primary+T+lymphocytes+via+the+WASP+pathway+%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway .</a> eLife. , (2015).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+histocompatibility+complex+class+II-expressing+endothelial+cells+induce+allospecific+nonresponsiveness+in+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells.</a> J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).</li>
<li>Ma, W., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells+effectively+costimulate+cytokine+production+by%2C+but+not+differentiation+of%2C+naive+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells.</a> J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).</li>
<li>Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+antigen+presentation%3A+stimulation+of+previously+activated+but+not+naive+TCR-transgenic+mouse+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells.</a> Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).</li>
<li>Epperson, D. E., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-presenting+function+of+human+endothelial+cells.+Direct+activation+of+resting+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells.</a> J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).</li>
<li>Shiao, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+effector+memory+CD4%2B+T+cells+directly+recognize+allogeneic+endothelial+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo.</a> J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-signal+model+for+T+cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">A two-signal model for T cell trafficking.</a> Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).</li>
<li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+diapedesis+is+initiated+by+invasive+podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes.</a> Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).</li>
<li>Carman, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+transcellular+diapedesis%3A+probing+and+pathfinding+by+%27invadosome-like+protrusions%27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'.</a> J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).</li>
<li>Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dendritic+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell-dendritic cell immunological synapses.</a> Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).</li>
<li>Saito, T., Yokosuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+synapse+and+microclusters%3A+the+site+for+recognition+and+activation+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells.</a> Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).</li>
<li>Gomez, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HS1+functions+as+an+essential+actin-regulatory+adaptor+protein+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse.</a> Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).</li>
<li>Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor+signaling+to+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor signaling to integrins.</a> Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).</li>
<li>Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cytoskeleton+during+leukocyte+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of the cytoskeleton during leukocyte responses.</a> Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).</li>
<li>Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor+deformation+model+of+TCR+triggering%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">The receptor deformation model of TCR triggering.</a> Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).</li>
<li>Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-anchored+monomeric+agonist+pMHCs+alone+trigger+TCR+with+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity.</a> PLoS Biol. 6 (2), e43(2008).</li>
<li>Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+mechanics+and+molecular+organization+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Bending mechanics and molecular organization in biological membranes.</a> Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+receptor+activation+by+dynamic+membrane+binding+of+the+CD3epsilon+cytoplasmic+tyrosine-based+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif.</a> Cell. 135 (4), 702-713 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר שיטות לחקירת תאי האנדותל כט) נגמ&quot;שים פיסיולוגיים understudied וii) כסוג חדש של &#39;מודל APC הסלולרי מישוריים&#39;. עם כל כבוד ללשעבר, זה הפך להיות יותר ויותר מוערך שנגמ&quot;שים שאינם hematopoietic ההיקפי (או &#39;סטרומה&#39;) ממלאים תפקידים קריטיים, שאינם מיותרים (כלומר, בהשוואה לנגמ&quot;שים hematopoietic) בעיצוב תגובות חיסוניים אדפטיבית 16-18. בין ההערכה הטובה ביותר 16-18 בין כגון נגמ&quot;שים &quot;חצי מקצועיים&quo...

לימפוציטים מסוג T הוא סניף של המערכת החיסונית אדפטיבית המאופיינת ביכולת לזהות ביעילות אנטיגן פפטיד (Ag) חייבת מורכב histocompatibility גדול (MHC) מולקולות באמצעות קולטנים של תאי T (TCRs) 1. לימפוציטים נאיביים constitutively להעביר ולסרוק תאים מקצועיים Ag הצגה &#39;(נגמ&quot;שים; למשל, תאים דנדריטים) בתוך בלוטות הלימפה, בעוד תאי הזיכרון / T מפעיל צריכים לסקור מגוון רחב מאוד של נגמ&quot;שים ותאי יעד פוטנציאליים בתוך רקמות היקפי ביעילות. בדקות הבאות הכרה ראשונית של Ag מקור על APC, ימפוציטים לעצור הגירתם ומתחיל להיווצר ממשק תאי תאים אינטימי מיוחד &quot;סינפסה החיסונית &#39;כינתה (IS). ספג (כלומר, 30-60 דקות) היא קשר נדרש להגביר ולקיים איתות 2-7. מחקרים המתעוררים לזהות שבתוך הוא, זה הוא ההיווצרות רציפה ומהיר remodeling של מיקרו-אשכולות בדידים איתות תת-תאי (כלומר, מכילים MHC / Ag-TCR, F- אקטין, הדבקה ומולקולות איתות) הקובעים את החוזק והאיכות של תגובות חיסוני וכתוצאה מכך 2-7. עם זאת, פרטים דינמיים ומנגנון רגולציה של תהליך זה באופן חלקי הבינו 8,9. זה נובע במידה רבה מאתגרים טכניים הקשורים בטופולוגיות סדירות של משטחי APC ונטייה גרועים מבוקרת של מטוסי האינטראקציה תאי תאים, נושאים שעמוקים להגביל את ההדמיה spatiotemporal הנדרשת גישות 8-10 (Figure1A). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53288/53288fig1.jpg" /> איור 1. דגם APC התא פיסיולוגי מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics. סכמטי ממחיש הדמיה מסורתית של סינפסה החיסונית בין תאי T וprofessio<html> תא סופי APC () ו- T ומודל מסורתי שומנים מישוריים APC bilayer (ב &#39;) בהשוואה למודל זה רומן אנדותל APC מישוריים (C). נגמ&quot;שים מקצועיים לספק סינפסות החיסונית פיזיולוגית אבל מציעים ממשק מונחה גרוע תא-תא (כלומר, ביחס למישור ההדמיה XY האופטימלי; רזולוציה ~ 0.2 מיקרומטר), אשר באופן דרמטי פוגע מרחבית (רזולוציה ~ מיקרומטר מטוס ההדמיה z 1) ובזמן (כלומר, בשל הצורך לסרוק שוב ושוב בכל מטוסי ההדמיה z) רזולוציה של הדמיה. יש דגמי bilayer טופולוגיה מישוריים המספקת רזולוציה ההדמיה spatiotemporal אופטימלית, אבל גם פשוטים ביותר, שאינם פיסיולוגי ונוקשה. מודל תא האנדותל זה משלב את הטופולוגיה מישוריים של bilayers שומנים עם המצע הפיזיולוגי של APC קלאסי כדי לספק רזולוציה הדמיה מרחב ובזמן אופטימלית בסביבה פיזיולוגית.מ &#39;/ קבצים / ftp_upload / 53,288 53288fig1large.jpg &quot;target =&quot; / _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. העבודה קודמת עקפה באופן חלקי על המכשולים הללו על ידי פיתוח מודלים מצע מישוריים (כלומר, bilayers שומנים ומשטחים מצופים נוגדנים) המספקים רזולוציה spatiotemporal אופטימלית (כלומר, באמצעות תיקון משטח הפעלת תא T לתכנית אחת שמקבילה להדמית XY האופטימלית מטוס) 11-15 (1B איור). מודלים אלה הקלו תובנות חשובות דינמיקת subcellular / מולקולרית השולטות איתות אנטיגני בתאי T, כוללים גילוי אקטין דינמי / TCR מיקרו-אשכולות איתות 7,11-14. עם זאת, מודלים כאלה מטבעם פשטניים, כמו גם נוקשה (מניעת הפיתוח / המחקר של תכונות טופולוגי 3 ממדים) (איור 1). לכן, זה עדיין לא ברור איך להתייחס כגון ממצאים לPHYתאי תאים siologic מעקב חיסוני. למרות שעדיין understudied, כלי דם ותאי האנדותל הלימפה הם מתעוררים כגדולים (כלומר, גדולים יותר במספרים מכל נגמ&quot;שים המקצועיים, על ידי ~ 1000-פי) תא היקפי של נגמ&quot;שים &quot;חצי מקצועי&quot; 16-18. תאים אלה מבטאים MHC-אני-, MHC-II- ושפע של מולקולות שיתוף ממריץ (למשל, CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1, אבל לא CD80 וCD86) ואסטרטגיים ממוקם בממשק שבין דם לרקמה שבו הם משרתים פונקציות זקיף מיוחדות 16-18. מחקרים קודמים הראו שתאי האנדותל יכולים למעשה מחדש לעורר מפעיל / זיכרון, אבל לא נאיבי, תאי T 19-25. כך, תאי האנדותל עשויים לשחק תפקידי APC ייחודיים בשלב מפעיל של תגובות חיסוניים אדפטיבית בתוך הרקמות ההיקפית, כגון השפעה מקומית על הפעלת תא T, בידול, זיכרון וסובלנות 16,17,26. CRItically, כאשר גדלו במבחנה, תאי האנדותל יוצרים משטחי תא כמעט מישורי והם בקלות transfectable (למשל, עם כתבי חלבון פלואורסצנטי). תכונות אלה הן אידיאליים עבור הדמיה גבוהה spatiotemporal רזולוציה של דינמיקה טופולוגית במהלך אינטראקציות תא-תא 19,27. כך תאי האנדותל עשויים לשמש כמודל &#39;מישוריים סלולארי APC&#39; פיסיולוגי מובהק מתאים ללימוד מנגנוני שיפוץ subcellular / מולקולריים המניעה את הכרת אנטיגן ולווסת תגובות (איור 1 ג) 19,20. בעבר הוקם טכניקות הדמיה משלימות (כולל transfection של תאי endothelia עם מקבלי חלבון פלואורסצנטי של קרום הפלזמה וcytosol) ללומד את הפרטים של אינטראקציה ליקוציט-האנדותל בהידבקות וההגירה Transendothelial 27, הראה כי לויקוציטים באופן פעיל לחקור את פני השטח של האנדותל ידי דינמי הכנסהההכחשה ד של תת-מיקרון בקנה מידה, בליטות גליליות אקטין עשיר (~ 200-1,000 ננומטר בקוטר ועומק) כינו בליטות כמו invadosome (כלומר, &#39;ILPs&#39;) 27,28. הדמיה גישות אלה הורחבו עוד יותר יחד עם יצירת הפרוטוקולים לנצל פונקצית APC אנדותל לפתח השיטות הראשונות להדמיה גבוהה spatiotemporal רזולוציה של סינפסה החיסונית תא אנדותל T כ19,20 דיווח ועוד לתאר זאת. ממצא מרכזי הנגזר ממודל APC סלולארי זה מישוריים רומן הוא שILPs תא T לתפקד גם בקידום זיהוי Ag ראשוני ובשמירת איתות שלאחר מכן. ואכן, מערכים של ILPs מרובה (שהתייצבו ונצבר בתגובה הראשונית שטף סידן) להעשרת תכנית בTCR ומולקולות רמיזות של PKC-Q איתות פעילה כגון, ZAP-70, phosphotyrosine וHS1. לכן, ILPs נראה לייצג מקביל פיסיולוגי תלת-ממדית למייקרו-TCR האיתותאשכולות ראו בדגמי bilayer מישוריים. גישה זו, ובכך, ברגישות מגלה / דינמיקה מולקולרית ואדריכלית (ומשתמע ביו-מכאנית) דיווחים לא אחרת לזיהוי. השיטה המתוארת במסמך זה צריכה להיות שימושי לגישור על הפער בין APC המקצועי ודגמי מצע APC מלאכותיים כדי לשפר את היכולת שלנו לחקור את המנגנונים בסיסיים של תגובות חיסוניים אדפטיבית. ואילו כאן הדגש הוא על ההפעלה של מפעיל CD4 + סוג Th1 / תא זיכרון, גישה בסיסית זו ניתן לשנות בקלות ללמוד מגוון רחב של סוגי תאי T וAGS, כמפורט להלן.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer למתוח לטקס ללא חוסם עורקים</td><td>BD Biosciences</td><td>367203</td><td></td></tr><tr><td>BD אלכוהול ספוגיות</td><td>BD Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>367861</td><td>K2 EDTA</td></tr><tr><td>BD Vacutainer כפתור איסוף דם סט BD</td><td>Biosciences</td><td>367335</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1440-02</td><td>הביאו ל-RT לפני השימוש</td></tr><tr><td>FCS-Optima</td><td>Atlanta Biologics</td><td>s12450</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>סטפילוקוקלי אנטרוטוקסין B</td><td>טכנולוגיית</td> <td>רעלןBT202RED</td><td>תמיסת מלאי 1 מ"ג/מ"ל ברעלן</td></tr><tr><td>תסמונת הלם רעיל PBS 1</td><td>טכנולוגיית רעלן</td><td>TT606RED</td><td>תמיסת מלאי 1 מ"ג/מ"ל ב-PBS</td></tr><tr><td>אנושי IL-15</td><td>מו"פ & D Systems</td><td>247-IL-025</td><td>פתרון מלאי 50ug/ml ב-PBS</td></tr><tr><td></td><td>PBS Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>תמיסת מלאי 1 מ"ג/מ"ל ב-H20</td></tr><tr><td>HMVEC-d Ad-Dermal MV תאי אנדו</td><td>Lonza</td><td>CC-2543</td><td>ניתן להשתמש ב-ECs מיקרו-וסקולריים אנושיים אחרים, כלומר ערכת כדורים HLMVECs</td></tr><tr><td>EGM-2 MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-4174</td><td>פתרון מלאי 10x, לדלל בערכת</td></tr><tr><td>נוקלאופקטור PBS amaxa-HMVEC-L</td><td>Lonza</td><td>vpb1003</td><td>ערכה נדרשת לשלב 4</td></tr><tr><td>IFN-g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3265</td><td>תמיסת מלאי 1 מ"ג/מ"ל ב-H20</td></tr><tr><td>TNF-alpha 10ug, Human</td><td>Life Technologies</td><td>PHC3015</td><td>תמיסת מלאי 1 מ"ג/מ"ל ב-H20</td></tr><tr><td>פנול HBSS ללא אדום</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C1016-100G</td><td>תמיסת מלאי 1M ב-H20</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>208337</td><td>תמיסת מלאי 1M בסרום אנושי H20</td></tr><tr><td>אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A6909-10 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>אימרסול 518 F שמן טבילה ללא פלואורסצנטי</td><td>פישר מדעי</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM 20x50ug</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>פתרון מלאי 1mM ב- DMSO</td></tr><tr><td>pEYFP-Mem (Mem-YFP)</td> <td>Clontech</td><td>6917-1</td><td></td></tr><tr><td>pDsמונומר אדום (ציטופלזמי מסיס DsRed)</td> <td>Clontech</td><td>632466</td><td></td></tr><tr><td>pDsקרום מונומר אדום (Mem-DsRed)</td> <td>Clontech</td><td>632512</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-אקטין</td><td>Clontech</td><td>6116-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד 37%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td>רעיל, השתמש באדים</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; צינורות צנטריפוגה חרוטיים פלקון 15 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה חרוטיים פלקון 50 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-959-49A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות מטופלות בתרבית רקמות בז T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; צלוחיות מטופלות בתרבית רקמות בז T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; תרבית תאי קורנינג מטופלת T175</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10-126-61&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-545-85&nbsp;</td><td>קוטר 12 מ"מ</td></tr><tr><td>&nbsp; צלחות תרבית רקמות פלקון 24 בארות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>צלחות דלתא-T</td><td>ביופטקס</td><td>04200415B</td><td></td></tr><tr><td>פיפטס פסטר חד פעמי</td><td>וויטון פישר סיינטיפיק</td><td>13-678-8D</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל שפופרת אפנדורף&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ICAM1 עכבר אנטי אנושי</td><td>BD Biosciences</td><td>555509</td><td></td></tr><tr><td>HS1 עכבר אנטי אנושי</td><td>BD Biosciences</td><td>610541</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD11a (LFA-1alpha) מדע ביולוגי מטוהר</td><td></td><td>BMS102</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD3 Alexa Fluor&reg; 488</td><td>ebioscience</td><td>53-0037-41</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-MHC Class II&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab55152</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד טאלין 1</td><td>Abcam</td><td>ab71333</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד PKC&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab109481</td><td></td></tr><tr><td>פוספוטיזין (4G10 פלטינה)</td><td>Millipore</td><td>50-171-463</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Amaxa Biosystems</td><td></td><td>נדרש אלקטרופורטור לשלב 4</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510&nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovison Software</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU-425 (סדרה 60) ארון בטיחות ביולוגי</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; פורמה STRCYCLE 37 & deg; C, 5% CO2 תרבית תאים</td><td>אינקובטור פישר סיינטיפיק</td><td>202370</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810</td><td>Eppendorf</td><td>EW-02570-02</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; Z359629</td><td>Bright-Line Hemocytometer</td></tr><tr><td>איזוטמפ אמבט מים דגם 202</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr></tbody></table>

דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה dynamics

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

חסינות מסתגלת מוסדרת על ידי אינטראקציות דינמיות בין תאי T ותאי הצגת אנטיגן (&#39;נגמ&quot;שים&#39;) המכונה &quot;סינפסות החיסונית&quot;. בתוך ממשקי תאי תאים האינטימיים אלה אשכולות בדידים משנה הסלולר של MHC / Ag-TCR, F- אקטין, הדבקה ויוצרים מולקולות איתות ולשפץ במהירות. דינמיקה אלה נחשבות לגורמים קריטיים של שתי היעילות והאיכות של התגובות חיסוני המתפתחות ולכן של מגן לעומת חסינות פתולוגיים. הבנה נוכחית של סינפסות החיסונית עם נגמ&quot;שים פיסיולוגיים היא מוגבלת על ידי חוסר ההתאמה של הרזולוציה ההדמיה השגה. למרות שמודלים מלאכותיים מצע (למשל, bilayers שומנים מישוריים) מציעים רזולוציה מעולה והיו כלים יקרים מאוד, הם מטבעם אינו פיסיולוגיים ופשטניים. תאי האנדותל של כלי דם והלימפה צמחו כתא רקמה היקפית חשובה (או סטרומה) ​​של &#39;חצי מקצועאל נגמ&quot;שים &quot;. נגמ&quot;שים אלה (המבטאים ביותר של המכונות מולקולריות של נגמ&quot;שים מקצועיים) יש התכונה הייחודית של יצירת תא שטח כמעט מישורי והם בקלות transfectable (למשל, עם כתבי חלבון פלואורסצנטי). במסמך גישה בסיסית ליישום תאי האנדותל כרומן ו&#39;מודל APC הסלולרי מישוריים &#39;פיסיולוגי להדמיה וחקירה של תהליכי איתות אנטיגני הבסיסיים משופרות תתואר.

גישת הדמיה רומן באמצעות תאי האנדותל ושילוב יתרונות הרזולוציה של מודל bilayers שומנים מישוריים עם המורכבות וdeformability של נגמ&quot;שים מקצועיים הפיזיולוגיים פותחה (איור 1). איור 2 מספק דוגמאות של הגירה טיפוסית, שטף סידן ודינמיקה טופולוגית נצפתה עם זה גִישָׁה. בהעדר SAG על האנדותל, לימפוציטים מסוג CD4 + Th1 SAG ספציפי התפשט במהירות, ולקטב רוחבי להעביר על פני האנדותל (איור 2 א) בלי fluxi...

חסינות אדפטיבית נשלטת על ידי 'סינפסות אימונולוגיות' דינמיות הנוצרות בין תאי T לתאים המציגים אנטיגן. פרוטוקול זה מתאר שיטות לחקירת תאי אנדותל הן כ-APCs פיזיולוגיים לא נחקרים והן כסוג חדש של 'מודל APC תאי מישורי'.

דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

המטרה הכללית של טכניקה זו היא להשתמש בתאי אנדותל כסוג חדש של מודל תא מיצג אנטיגן מישורי, על מנת לחקור תהליכי איתות אנטיגניים בסיסיים. שיטה זו יכולה לסייע לנו למענה על שאלות מפתח בתחום החסינות הנרכשת, כגון האופן שבו דינמיקת העיצוב מחדש הסוב-תאית והמולקולרית מתואמת מרחבית וזמנית בתוך הסינפסה האימונולוגית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהאנדותל יוצר משטח PC מישורי למעשה.דבר זה מאפשר דימות ברזולוציה ספאטיו-טמפורלית אופטימלית בהקשר של פני תא הניתנים לעיצוב ומורכבים פיזיולוגית. למרות ששיטה זו מתמקדת בהפעלה של תאי זיכרון אפקטוריים מסוג CD4+ Th1, ניתן להשתמש בה גם לחקר של מגוון סוגי תאי T, אנטיגנים ותהליכי איתות. היום, כריס ואני נראה לכם כיצד לבצע את השלב השני: התחילו בטרנספקציה של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים מריאה או מעור של בן אדם עם YFP ממברנלי ו-DS red מסיס באמצעות נוקליאפקציה, והעבירו את התאים שעברו טרנספקציה לצלחות תרבית לדימות תאים חיים.ביום למחרת, החליפו את מצע תרבית התאים במצע טרי המועשר ב-interferon gamma כדי להשרות ביטוי של MHC two בתאי האנדותל, ולאחר מכן גרו את התאים באמצעות 20 ng/mL של TNF alpha 24 שעות מאוחר יותר, ביום השלישי, למשך 30 עד 60 דקות. לפני תחילת הניסוי, דגרו את האנדותל עם 1 µg/mL של כל אחד מהסופראנטיגנים הבקטריאליים staphylococcal enterotoxin B ו-toxic sh

an-endothelial-planar-cell-model-for-imaging-immunological-synapse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Bilayers מישוריים נתמכים הם כלים רבי עוצמה שיכולים לשמש מודל אינטראקציות מולקולריות בסינפסה האימונולוגית. כאן, אנו מציגים שיטות לעיגון הידבקות התא חלבונים ידועים לווסת היווצרות הסינפסה לעלון העליון של bilyer השומנים ולדמיין היווצרות הסינפסה באמצעות מיקרוסקופ TIRF.

Bilayers מישורי נתמכות עבור תצורת לימוד של סינפסות החיסונית Kinapse

מאמר זה מתאר שיטה לחזות היווצרות הסינפסה virological HIV-1 המעטפה הנגרמת על bilayers זכוכית הנתמכים מישוריים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סך פנימית (TIRF) השתקפות. השיטה ניתן גם לשלב עם כתמים immunofluorescence לזהות הפעלה חלוקה מחדש של מולקולות איתות המתרחשים במהלך היווצרות ה-HIV-1 המעטפה הנגרמת סינפסה virological.

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

סרטון זה מדגים הדמיה של תאים חיים של טופולוגיית סינפסות אימונולוגיות, וחוקר את יחסי הגומלין בין לימפוציטים מסוג T לבין תאי אפיתל הנושאים אנטיגנים פלואורסצנטיים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה תזוזה של ציטופלסמה אדומה וטבעות קרום צהובות בתאי אנדותל, דבר המצביע על היווצרות סינפסות אימונולוגיות.

הערכת טופולוגיית סינפסה אימונולוגית באמצעות דימות תאים חיים

מקור: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. הדמיית זמן-lapse של ארבוריזציה עצבית באמצעות תיוג דליל של וירוסים הקשורים לאדנו. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להמחיש דינמיקה דנדריטית בצמחי רשתית של עכבר חי. הוא מתאר את השלבים לייצוב הרשתית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, ביצוע הדמיה אפיפלואורסצנטית כדי לדמיין אינטרנוירונים אמקריניים של התפרצות כוכבים, ולכידת תמונות תלת מימד בהילוך מהיר כדי לנטר שינויים במורפולוגיה דנדריטית אמקרינית.

הדמיה קונפוקלית של דינמיקה דנדריטית עצבית באקספלנטים של רשתית עכבר

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקול להדמיה על ידי Nanoscopy STED שני צבעים סינפסה החיסונית ציטוטוקסיות של תאי NK סכמו על זכוכית. שימוש בשיטה זו אנו מקבלים רזולוציה ננומטר תת -100 של חלבוני סינפסה ושלד התא.

ויזואליזציה של סינפסה החיסונית על ידי פליטה מאולצת דלדול מגודרת בזמן צבע כפול (STED) Nanoscopy

כדוריות דם לבנות לחצות את monolayer אנדותל באמצעות paracellular או מסלול transcellular. פיתחנו assay פשוט כדי לעקוב אחר חלוקת junctional אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial יקוציט תחת זרימה פיזיולוגית להפלות בין שני מסלולי הגלגול.

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

אנו מתארים כאן שילוב של טכניקת דו-שכבת השומנים הנתמכת בזכוכית ליצירת סינפסות אימונולוגיות עם טכניקת הדמיה ברזולוציה גבוהה של מיקרוסקופיה של דלדול פליטה מגורה (STED). מטרת פרוטוקול זה היא לספק למשתמשים את ההוראות הדרושות לביצוע מוצלח של שתי טכניקות אלה.

הדמיה ברזולוציה סופר של תא הרוצח הטבעי החיסונית סינפסה על מישורי שומנים bilayer נתמך-זכוכית

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה מלאה לניתוח כמותיים של המערכת החיסונית הסינפסות בין ראשי תאי T אנושיים תאים אנטיגן. השיטה מבוססת על מיכשור הדמיה, אשר מאפשר רכישת הערכה של מספר תאים אלף תמונות בתוך תקופה קצרה יחסית של זמן.

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

בפרוטוקול זה מתמונות הן את המערך האימונוולוגי והן את תנועת הפרשה המקוטב הבאה לעבר הסינפולוגית החיסונית. שערי מעלה הסלולר נוצרו בין תא הסופר-אנטיגן פעמו של ראג'י (מתנהג כמו תא אנטיגן המציג) ו שיבוט ג'ורקאט (מתנהג כמו מסייע לימפוציטים T לימפופן).

הדמיה של הסינפסה החיסונית של האדם

כאן אנו מציגים את הפרוטוקול לשחזור צעדים של תאים סינתטיים המציגים אנטיגן באמצעות Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים ואת השימוש בהם כדי לחקור את הפלט הסינפטי מתאי T מופעלים.

הכנת Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי T

חקור דינמיקת סינפסה חיסונית באמצעות מודל תאי אנדותל מישורי לחקר תהליכי סיגנל אנטיגני. שיטה זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות תאי T והפעלתם.

דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics

גלה סרטונים נוספים