שיטות להעברת לוקליזציה דווקא של תאים או DNA לPostimplantation המוקדם עכבר עוברים

המטרה הכוללת של הליכים אלה היא להדגים כיצד להעביר במדויק תאים או DNA לעוברי עכברים מוקדמים לאחר ההשתלה. שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית, כגון בדיקת הפוטנציאל in vivo של תאים מתורבתים במבחנה ותפקודם של גנים מסוימים בשלבים עובריים ספציפיים. היתרונות העיקריים של טכניקות אלו הם שהן אינן דורשות ציוד מיוחד והופכות מניפולציות ניסיוניות של בריו עכבר מטע מוקדם לאפשריות לאחר הקרבת נקבה בהריון ביום E 7.5 או E 8.5 על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש במספריים ומלקחיים כדי לבודד את הרחם ולהניח אותו בצלחת של 30 מילימטר מלאה ב-M שני בינוניים עם שני זוגות מלקחיים עדינים.

קרעו בזהירות את שריר השריר, ואז קלפו את הדצידואה, היזהרו לא לנקב את החללים העובריים הנוספים. הסר את קרום הרייקר באמצעות מלקחיים כדי לצבוט אותו ולהפריד אותו לאט מהעובר. לאחר מכן תחת מיקרוסקופ ניתוח סטריאו, בדוק את העוברים כדי לוודא ששק החלמון מי השפיר וחרוט השליה שלמים בעזרת פיפטה, העבירו את העוברים לכלי נקי של M שתיים והניחו על מכסה צלחת פטרי מפלסטיק בגודל 30 מילימטר על קרח או משטח קרח כדי לצנן חלקית את העוברים.

הכנת מדיום תרבית ותרבית עוברים על פי פרוטוקול הטקסט להשתלת תאים מתורבתים בעוברי עכברים. התחל בשימוש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לגרד פיזית תאי גזע אבלסט, המבטאים GFP בכל מקום מצלחת תרבית של שש בארות. העבירו את התאים לתוך הצלחת המכילה את העוברים.

חבר נימי השתלה שנמשכו ביד לצינור השואב כדי לגרום לפיפטה בפה למצוץ בעדינות את פיפטת הפה כדי למשוך גוש תאים אחד או יותר של יותר מ-20 תאים לתוך נימי ההשתלה. לאחר מכן פוצצו בעדינות את התאים כדי לפזר גושים גדולים. בחר גוש אחד המכיל כ-10 עד 20 תאים ושאב אותו לתוך נימי ההשתלה.

שוב, שמירה על הגוש קרוב לפתח הנימים בעזרת זוג מלקחיים. החזק את העובר במקומו באופן רופף והכנס את נימי ההשתלה לאזור העניין. כדי ליצור פתח.

הוצא בעדינות את הגוש מתוך נימי ההשתלה, והשאיר את המחרוזת הקצרה של 10 עד 20 תאים תקועה בעובר. השאירו את העוברים באותה צלחת של M שני מדיום והשתמשו בתרכובת פלואורסצנטית המנתחת מיקרוסקופ ומצלמה כדי לצלם את העוברים המושתלים. שמור על זמן ההדמיה למינימום כדי למנוע חשיפה של העוברים לאור וחום מוגזמים.

מיד לאחר הדמיה באמצעות משחה, העבירו את העוברים בנפח מינימלי של M שני מדיום תרבית ותרבית מאוזנת מראש על פי ההנחיות בפרוטוקול הטקסט לפני ביצוע ניסויי אלקטרופורציה, השתמשו במיקרו פיפטה אופקית כדי למשוך פיפטות הזרקת DNA עם קצה עדין ופתח של פחות מ-10 מיקרומטר כדי למנוע נזק לרקמות. עבור אלקטרופורציה נימית מזכוכית, השתמש במיקרו זיוף כדי לחתוך את פתח פיפטות הזרקת ה-DNA לקוטר פנימי של 20 או 30 מיקרומטר עם קצה נקי וללא קצוות שבורים. חבר כל אלקטרודת פלטינה לחוט מבודד דק והכנס אותה למחזיק מחט מיקרו-הזרקה מכוסה בסרט בידוד.

להכנת אלקטרודה נימית בעבודת יד, הכנס חוט פלטינה בקוטר 0.2 מילימטר לתוך נימי זכוכית אלקטרופורציה עם פתח קבוע בקוטר 20 או 30 מיקרומטר. למקד את הזרם החשמלי ולהעביר את ה-DNA של הפלזמה לאזור קטן של עניין בעובר. כדי ליצור אלקטרודה בצורת L כופפו חוט פלטינה בקוטר 0.2 מילימטר, וצרו צורת L עם החלק האופקי של ה-L באורך של כמילימטר אחד.

התקן את מחזיקי המחט על מחזיקי מכשירים סטנדרטיים למיקרו-מניפולציה. חבר את האלקטרודה הנימים לאנודה של ספק הכוח. חבר את האלקטרודה בצורת L לאנודה של המולטימטר.

לאחר מכן חבר את הקתודה של המולטימטר לקתודה של ספק הכוח. מלאו את נימי הזכוכית האלקטרופורציוניים ב-PBS עד לטווח של מילימטר עד שני מילימטרים מהחלק העליון והכנסו את אלקטרודת הפלטינה הישרה לתוך נימי הזכוכית עד שהיא מגיעה לתחתית הנימים. עוגן את האלקטרודה בצורת L על פני צלחת הפטרי בגודל 30 מילימטר מלאה ב-PBS.

השתמש במשאבת פיקו פנאומטית להזרקת DNA. הכנס את מחט ההזרקה מהמבלסט הצדדי לחלל מי השפיר של העובר והזריק כחמישה מיקרוליטר של תמיסת DNA לחלל או עד שהוא מלא לחלוטין. הקפד לא לפוצץ את העובר.

לאחר מכן מקם בזהירות את העובר בין האלקטרודות והעבר את האלקטרודה הנימים למיקום המדויק שבו אמור להיות מועבר ה-DNA. באמצעות 200 וולט בשישה פולסים כל אחד באורך של 50 אלפיות השנייה, אלקטרופוטציה של העובר במרווח של שנייה אחת בין כל פולס. העבר מיד את העובר למדיום תרבית מאוזן מראש לפני שתחזור על האלקטרופורציה לעובר הבא.

זיהוי תאים חיים או מתים אלקטרופורטיים שעתיים לאחר האלקטרופורציה. על פי פרוטוקול הטקסט המוצג כאן נמצא עובר עם epi PSCs המבטא EGFP בכל מקום מושתל על E 7.5 ומתורבת ex vivo למשך 24 שעות. כאשר 10 עד 16 fscs הושתלו בעוברים E 7.5, הם השתלבו והתרבו היטב בתוך העובר המארח.

עם זאת, השתלת תאים נוספים אינה מביאה לכימריזם טוב יותר ולמעשה מביאה לגושים לא משולבים כפי שמודגם כאן. כפי שמוצג באלקטרופורציה זו של GFP המבטא פלסמידים. תאים חיוביים ל-GFP זוהו שעה עד שעתיים לאחר האלקטרופורציה.

כאשר תאי אבלסט דיסטליים בשלב הפס הפרימיטיבי המאוחר של העובר היו אלקטרופורטים תאים מסומנים תרמו לדרם העצבי לאחר 24 שעות בתרבית, מה שמתאים למפות הגורל הידועות של תאי אבלסט בעוברים בשלב הגסטרו. איור זה מראה כי בדומה לשימוש בסוגים אחרים של אלקטרודות לאלקטרופורציה, האלקטרודה הנימים גרמה גם למידה מסוימת של מוות תאים באזור הממוקד. מכיוון שאזור זה נראה כהה יותר בצבעו בהשוואה לאזורים שכנים שסימנו את גרעיני התאים המתים עם קרום אטום, פלואורסצנטי אדום רחוק אטום.

אישר כי טכניקת האלקטרופורציה הנימים מביאה רק למספר קטן של תאים מתים ליד אתר האלקטרופורציה. בזמן ניסיון הליכים אלה, חשוב להתחיל בתרבית העוברים תוך שעתיים. לאחר בידוד הרחם מהעכברים בסוף התרבית, ניתן לתקן את העוברים.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו צביעת חתך על מנת לענות על שאלות נוספות כמו תרומתו של תורם או תאים קלועים אלקטרו לעוברים המארחים. לאחר צפייה בסרטון זה, אנו אמורים להבין היטב כיצד להעביר במדויק תאים ל- DNA שלנו לעוברי עכברים מוקדמים לאחר ההשתלה.