בידוד של שברים תת-גרעיניים מועשרים-תא ויראלי שכפול מתאים נורמלים אדם נגוע Adenovirus

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשיג פראקציה לא-גרעינית המועשרת במדורי רפליקציה (replication compartments) שנוצרו בתאים המודבקים באדנווירוס, לצורך מחקר מפורט של הרכבם, העל-מבנה שלהם והפעילויות הקשורות אליהם. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הווירולוגיה של DNA, כגון מחקר של מנגנונים מולקולריים השולטים ברפליקציה וביטוי של הגנום הוויראלי, אשר תלויים בתורם במדורי רפליקציה לצורך ויסות האינטראקציות בין הנגיף לתא המארח. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שמדובר בפרוצדורה פשוטה המבוססת על מדרג מהירות (velocity gradient) להקמת מערכת נטולת תאים, המאפשרת את חקר המנגנונים המאפשרים לנגיפי DNA המתרבים בגרעין להשתלט על התא המודבק.

על מנת לבצע בדיקה זו, ראשית, הכין אדנווירוס מסוג 5 או Ad5 ופיברובלסטים מעור של בן אדם או HFF כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. ראשית, הדבק 10⁷ תאי HFF בצלחות תרבית רקמה של 100 מילימטר באמצעות 1 מיליליטר של DMEM לצלחת, ב-MOI של 30 יחידות יוצרות מוקדים או FFU לתא. הדגר את התאים למשך שעתיים באינקובטור לתרביות תאים מלחח ב-37 °C ו-5% carbon dioxide. נער את הצלחות בעדינות מדי 15 דקות כדי להבטיח פיזור הומוגני של אינוקולום הנגיף על התאים. לאחר ההדגרה, הסר את המצע והוסף DMEM טרי.

יש להוסיף 10% FBS ולאחר מכן לדגור את התאים למשך 16, 24 או 36 שעות תוך שימוש בגרד תאים (cell scraper). יש לאסוף בעדינות את התאים המודבקים ואת תאי הביקורת לאחר ההדבקה ולאגור את תגלי השביקה במבחנות צנטריפוגה סטריליות על קרח. יש לספור את התאים באמצעות תא נב באואר (neubauer chamber) ולאחר מכן לצנטריפוג את התאים ב-220 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

בשלב הבא, השביה מחדש את משקע התאים בחמישה מיליליטר של PBS קר בקרח, סבב ב centri-fuge ושטוף את התאים שלוש פעמים בחמישה מיליליטר של PBS קר בקרח, תוך השלכת עלי-הנוזלים של השטיפה כדי להכין את התאים לליזיס. השביה מחדש את משקע התאים ב-700 microliters של באפר היפוטוני קר בקרח עם מעכבי פרוטאז, ואפשר לתאים להתנפח על קרח למשך שלוש שעות. באמצעות עומס Teflon מסוג A, ביצוע הומוגניזציה לתאים באמצעות 10 עד 20 תנועות דחיפה כלפי מטה.

בדקו את הליזאט תחת המיקרוסקופ מדי 20 תנועות כדי לעקוב אחר הליזיס של התאים. חזרו על התהליך למשך כ-80 תנועות עד שכל התאים יפוצצו בהצלחה. לאחר מכן, סבבו את ההומוגנאט בצנטריפוגה ב-300 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות.

אחסן את הנוזל העליון בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס במבחנה כפרקציה הציטופלזמית כדי להסיר שיירי תאים מגרעיני ה-nuclei reus. השהה את המשקע ב-750 µL של תמיסת סוכרוז 0.25 M (תמיסה אחת), העבר בפיפטה 750 µL של תמיסת סוכרוז 0.35 M (תמיסה שתיים) למבחנת צנטריפוגה, והנח בזהירות את ההומוגנאט המשוחה מעל תמיסה שתיים. צנטריפוג את כרית הסוכרוז ב-1400 ×g בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן השלף והסר את הנוזל העליון.

יש להשעות מחדש את המשקע ב-750 µL של תמיסה שתיים לצורך ליזיס. סוניקציה של התוך-גרעיני תתבצע במקלעת אולטרסונית, שתישמר בטמפרטורה של 4 °C או פחות, בשני פולסים של חמש דקות. יש לבדוק את הליזיס הגרעיני תחת מיקרוסקופ שדה בהיר בין הפולסים, ולבצע סוניקציה נוספת עד להשגה של ליזיס גרעיני מלא.

בשלב הבא, העבירו בפיפטה 750 µL של תמיסת סוכרוז 0.88 M (תמיסה 3) לפרועת צנטריפוגה, והשכיבו את תמיסת הליזאט הגרעיני מעל תמיסה 3. צנטריפגו את הליזאט ב-3000 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות. השכבה העליונה בנפח 1.5 mL היא פראקציית הנוקליופלזמה, אותה יש לשמור בטמפרטורה של 70- °C.

לאחר מכן, השביה מחדש את המשקע ב-700 µL של תמיסה שנייה. זהו פראקציית מדור השכפול 85 או RCF של גרעין המארח, שמאוחסנת גם היא ב-70°C- . כדי להתחיל בניתוח אימונופלואורסצנציה, הוסף טיפה של 5 µL מה-RCF על גשמיות זכוכית מצופות בסלין.

הניחו לטיפה להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של PBS כטיפה לצד הנקודה והטו את הפסחית כדי שה-PBS יזרום על הנקודה. רוקנו את ה-PBS מהפסחית.

בשלב הבא, חסמו את נקודת הדגימה באמצעות 500 microliters של PBS המכיל 5% bovine serum albumin למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. כדי להסיר את תמיסת החסימה העודפת, הוסיפו בעדינות 500 microliters של PBS על הדגימה שננקדה על השקופית, ללא שאיבה ישירה על הדגימה. בצעו את השטיפה שלוש פעמים.

בשלב הבא, הוסיפו 20 µL של נוגדן ראשוני מדולל נגד החלבון הקישורי ל-DNA מסוג viral E two A על נקודת הדגימה. כסו את השקופית למניעת התאיידות והדגירו בתא לח ביחס לטמפרטורת החדר למשך שעתיים. כעת, שטפו את הדגימה בעדינות שלוש פעמים ב-PBS המכיל 0.02% tween 20.

הימנעו מפיפטור ישיר על הדגימה לאחר שטיפות אלו. הוסיפו 20 µL של נוגדן משני לעכבר המשורשר ל-fluoro four ישירות על הדגימה, והדגרימו בטמפרטורה של 4 °C למשך שעה אחת. בתוך תא לח, הוסיפו 500 µL של PBS עם 0.02% Tween 20 למשקופיות, ושוב, הימנעו מפיפטור ישיר על הדגימה.

לאחר מכן, הוסיפו two microliters של תמיסת קיבוע והניחו זכוכית כיסוי מעל הדגימה. אטמו את דפנות זכוכית הכיסוי בעזרת לק. התבוננו בנסחית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה עם עדשה של 63 x באורך הגל הרצוי הספציפי ל-fluoro four שנעשה בו שימוש; כאן מוצגת תוצאה של אימונופלואורסצנציה של חלבון adenoviral E two A DNA binding protein או DBP.

המבנים המכילים DBP הם rc ויראליים תת-גרעיניים, שימו לב כי E two A DBP ממוקם בתוך ה-RC ומופיע בירוק. בנוסף, העשרה של DNA ויראלי ב-RCF אוששה באמצעות PCR בהשוואה בין ה-RCF לבין הפракציה הנוקלאופלזמית או NPL ב-24 ו-36 שעות לאחר ההדבקה. ה-GNA הוויראלי נמצא באופן סלקטיבי ב-RCF ולא ב-NPL.

הטקסט המצורף מספק ראיות נוספות ל-MNA של אדנו-וירוס ב-RCF. ברגע ששולטים בטכניקה זו, ניתן לבצעה בתוך שש שעות מרגע קצירת התאים הזיהומים ועד לבידוד ה-RCF, במידה והיא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור תמיד את הדגימות על קרח ולנטר את שלבי ההומוגניזציה הגרעינית, הבידוד, הסוניקציה ובידוד הפראקציה התת-גרעינית באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר. לאחר ביצוע פרוצדורה זו.

ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון R-T-P-C-R ומיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (transmission electron microscopy), על מנת לחקור את הבקרה של ביטוי גנים ויראליים הקשורה לתאי השכבה של השכפול הוויראלי (viral replication compartments) ואת העל-מבנה של חלקיקים אלה. לטכניקה זו יש פוטנציאל לסלול את הדרך עבור חוקרים בתחום הווירולוגיה של גידולי DNA לחקור מנגנונים מולקולריים המשנים את הבקרה על מחזור התא ומעודדים שכפול ויראלי בתאי אדם. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן בידודם של תאי שכבה של שכפול ויראלי מגרעיני תאים נגועים, לצורך ביצוע מחקרים מורפולוגיים, תפקודיים והרכביים של מבנים אלה המושרים על ידי הנגיף.

אל תשכחו שעבודה עם אינדיקטור SAN עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון הרכבת מגיני אוזניים, בעת ביצוע הליך זה.