בידוד של שברים תת-גרעיניים מועשרים-תא ויראלי שכפול מתאים נורמלים אדם נגוע Adenovirus

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג חלק לא גרעיני מועשר בתאי שכפול שנוצרו בתאים נגועים באדנווירוס לצורך מחקר מפורט של הרכבם, מבנה האולטרה והפעילויות הנלוות אליהם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום וירולוגיה של DNA, כגון מחקר של מנגנונים מולקולריים השולטים בשכפול וביטוי הגנום הנגיפי אשר בתורם תלויים בתאי שכפול לוויסות אינטראקציות בין תאי מארח הנגיף. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בהליך פשוט המבוסס על שיפוע מהירות להקמת מערכת נטולת תאים הניתנת לחקר המנגנונים המאפשרים לנגיפי DNA משכפלים גרעיניים להשתלט על התא הנגוע.

על מנת לבצע בדיקה זו, ראשית, הכינו אדנו-וירוס מסוג 5 או D 5 ופיברובלסטים של עורלה אנושית או HFF כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה כדי להתחיל להדביק 10 עד ה-HFF השביעי בכלי תרבית רקמה של 100 מילימטר באמצעות מיליליטר אחד של 85 ו-DMM למנה ב-MOI של 30 יחידות יוצרות מיקוד או FFU לכל תא לדגור על התאים במשך שעתיים באינקובטור תרבית תאים לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. נדנד בזהירות את הכלים כל 15 דקות כדי להבטיח פיזור הומוגני של חיסון הנגיף על התאים. לאחר הדגירה מסירים את המדיום ומוסיפים דמם טרי.

בתוספת של 10% FBS ואז דגרו על התאים למשך 16, 24 או 36 שעות באמצעות מגרד תאים. קצרו בעדינות את התאים הנגועים והבקרו לאחר ההדבקה ואספו את תרחיף התאים בצינורות צנטריפוגות סטריליים על קרח. ספרו את התאים באמצעות תא נויבאואר ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב-220 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, השעו מחדש את כדור התא בחמישה מיליליטר של צנטריפוגת PBS קרה כקרח ושטפו את התאים שלוש פעמים בחמישה מיליליטר של PBS קר כקרח והשליכו את חומרי השטיפה על מנת להדביק כינים. Resus, השעו את כדור התא ב-700 מיקרוליטר של חיץ היפוטוני קר קר עם מעכבי פרוטאז ואפשרו לתאים להתנפח על הקרח למשך שלוש שעות. בעזרת עלי טפלון מסוג A, הומוגניזציה של התאים עם 10 עד 20 משיכות כלפי מטה.

בדוק את הליזאט במיקרוסקופ מעת לעת כל 20 פעימות כדי לעקוב אחר ליזה של תאים. חזור על התהליך במשך כ-80 משיכות עד שכל התאים נקרעים בהצלחה. לאחר מכן צנטריפוגה את ההומוגנאט ב-300 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

אחסן את הסופרנטנט במינוס 20 מעלות צלזיוס בצינור כשבר הציטופלזמי כדי להסיר פסולת תאית מהגרעינים ראוס. השעו את הגלולה ב-750 מיקרוליטר של תמיסת סוכרוז מולרית של 0.25, פיפטה אחת, 750 מיקרוליטר של תמיסת סוכרוז טוחנת 0.35, שתיים בצינור צנטריפוגה, ושכבו בזהירות את ההומוגנט המרחף על תמיסה שתיים. סובב את כרית הסוכרוז ב-1400 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן השליך את הסופרנטנט.

השעו מחדש את הגלולה ב-750 מיקרוליטר של תמיסה שתיים לכינים. הגרעינים סוניקציה את התרחיף הגרעיני באמבט קולי, הנשמר בארבע מעלות צלזיוס או מתחת להן בשני פולסים של חמש דקות. בדוק את הליזה הגרעינית תחת מיקרוסקופ שדה בהיר בין פולסים לסוניקט עוד יותר עד שהגרעינים שוכבים לחלוטין.

הפיפטה הבאה 750 מיקרוליטר של 0.88 סוכרוז מולארי תמיסה שלוש בשכבת צינור צנטריפוגה תמיסת הליזאט הגרעיני מעל תמיסה שלוש. צנטריפוגה את הליזאט ב -3000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ה-1.5 מיליליטר S הנקרא הוא השבר הפלזמי הגרעיני, המאוחסן במינוס 70 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-700 מיקרוליטר של תמיסה שתיים. זהו שבר תא השכפול של 85 או RCF של גרעין המארח, המאוחסן גם במינוס 70 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בניתוח אימונופלואורסצנטי, הוסף טיפה של חמישה מיקרוליטר של ה-RCF לשקופית זכוכית מצופה מלח.

תן לאוויר הטיפה להתייבש בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר PBS בטיפה ליד הנקודה והטה את המגלשה כדי להזרים את ה-PBS מעל הנקודה. מסננים את ה- PBS מהשקופית.

לאחר מכן חסום את נקודת הדגימה עם 500 מיקרוליטר PBS המכיל אלבומין סרום בקר 5% למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. כדי להסיר את תמיסת החסימה העודפת, הוסף 500 מיקרוליטר PBS בעדינות לדגימה שנצפתה על השקופית מבלי לזרוק ישירות על הדגימה. בצע את הכביסה שלוש פעמים.

לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מדולל כנגד החלבון הנגיפי E two A קושר DNA בנקודת הדגימה. מכסים את המגלשה כדי למנוע אידוי ודוגרים בתא לח בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. כעת, שטפו את הדגימה שלוש פעמים בעדינות עם PBS המכיל 0.02% עד 20.

הימנע מפיפטינג ישירות על הדגימה לאחר שטיפות אלה. הוסף 20 מיקרוליטר של פלואורו ארבעה נוגדן משני של עכבר ישירות על הדגימה, דגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. בתא לח, הוסף למגלשות 500 מיקרוליטר PBS עם 0.02%Tween 20, שוב, הימנע מפיפטינג ישירות על הדגימה.

לאחר מכן הוסף שני מיקרוליטר של תמיסת הרכבה והפוך החלקת כיסוי מעל הדגימה. אטום את דפנות החלקות הכיסוי בעזרת לק. צפה בשקופית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מטרה של פי 63 באורך הגל הרצוי הספציפי לפלואורו ארבע בשימוש תוצאה מאימונופלואורסצנציה של אדנו-ויראלי E שניים חלבון קושר DNA או DBP מוצג כאן.

המבנים המכילים DBP הם rc ויראלי תת-גרעיני, שימו לב שה-E two A DBP ממוקם בתוך ה-RC ומופיע בירוק. בנוסף, העשרת ה-DNA הנגיפי ב-RCF אושרה על ידי PCR המשווה את ה-RCF והמקטע הפלזמי של הנוקלאו או NPL ב-24 ו-36 שעות לאחר ההדבקה. ה-GNA הנגיפי נמצא באופן סלקטיבי ב-RCF ולא בייעוץ של ה-NPL.

הטקסט הנלווה לראיות נוספות ל-MNA אדנו-ויראלי ב-RCF לאחר שליטה בטכניקה זו ניתן לבצע בשישה מרגע קצירת התאים הנגועים ועד לבידוד של RCF אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור תמיד לשמור את הדגימות על הקרח ולעקוב אחר גרעין ההומוגניזציה, הבידוד, הסוניקציה ושלבי בידוד השבר התת-גרעיני על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר. בצע הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו R-T-P-C-R ומיקרוסקופ אלקטרונים הולכה על מנת לחקור את ויסות ביטוי הגנים הנגיפי הקשור לתאי השכפול הנגיפי ואת מבנה האולטרה של חלקיקים אלה. לטכניקה זו יש פוטנציאל לסלול את הדרך לחוקרים בתחום וירולוגיה של גידולי DNA לחקור מנגנונים מולקולריים המשנים את ויסות מחזור התא ומקדמים שכפול ויראלי בתאים אנושיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי שכפול נגיפיים מגרעיני תאים נגועים כדי לבצע מחקרים מורפולוגיים, פונקציונליים וקומפוזיציוניים של מבנים המושרים על ידי נגיף זה.

אל תשכח שעבודה עם מחוון SAN עלולה להיות מסוכנת, ותמיד יש לבצע כלי הקשה, כגון חבישת פיות אוזניים בזמן ביצוע הליך זה.